（广西柳州市妇幼保健院出生缺陷预防与控制重点实验室 545001）
【摘要】目的 探讨含钾通道四聚化结构域15（KCTD15）基因单核苷酸多态性位点rs29941与壮族儿童单纯性肥胖的相关性。方法 对200名柳州某区小学学龄前儿童（年龄均小于7岁）分别检测身高和体重，计算体重指数。利用SNaPshot技术分析100例单纯性肥胖儿童和100例健康对照儿童的KCTD15基因型及等位基因频率分布状况。结果 肥胖组和健康对照组KCTD15基因T/T型、T/C型及C/C型基因型频率分别为60.7%、34.6%、4.7%和55.4%、39.6%、5.0%，两组等位基因频率分别为78.0%、22.0%和75.2%、24.8%，C等位基因的OR值为1.169，95%的可信区间为0.742-1.842。两组基因型与等位基因频率差异均无统计学意义（P>0.05）；肥胖组的体重指数水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。而肥胖组中各基因型间体重指数水平的差异没有统计学意义（P>0.05）。经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，其等位基因在两种人群中的分布符合遗传平衡，说明样本具有群体代表性。而该位点的等位基因及基因型频率在所收集的肥胖组与对照组样本中分布未见显著异常。结论 KCTD15基因rs29941位点多态性与广西壮族学龄前儿童单纯性肥胖无相关性。
【关键词】含钾通道四聚化结构域15 基因多态性 单纯性肥胖 壮族
【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）02-0394-02
肥胖症是由遗传和各种环境因素相互作用下引起的，其特征性表现为脂肪细胞数目增多和体积增[1]，通常都开始于生命的早期，以儿童时期快速增长的体重指数（BMI）为标志[2]。流行病学研究发现，我国儿童单纯性肥胖率高达7.2%，接近欧美发达国家水平，肥胖正逐渐成为严重影响我国居民身体素质的问题之一，特别是儿童超重和肥胖现象愈发严重[3]。这种现象得不到充分的认识和改观，将给我国今后的疾病预防与治疗工作带来极大困难。因此，在早期检测BMI水平，防止过于肥胖，对于早期预防慢性代谢病，提高人民生活质量变得尤为重要。到目前为止，对于肥胖的候选基因和易感基因位点的研究有很多，其中于2009年，研究人员通过对大量人群进行全基因组关联研究（GWAS）分析筛选出含钾通道四聚化结构域15（KCTD15）基因 rs29941位点，被证实与肥胖相关[4]。本文针对KCTD15 基因rs29941 位点多态性与广西柳州壮族学龄前儿童单纯性肥胖进行分析，旨在采用SNaPshot技术[5]，一种基于单碱基延伸原理的SNP分型新方法，从分子生物学角度探讨肥胖在广西壮族人群中的遗传机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2011年9月-2013年5月来本院儿保科体检的壮族儿童200人，儿童单纯性肥胖诊断标准：超过同身高同性别参照人群标准体质量的20%者定为单纯性肥胖儿童[3]。肥胖组107例，平均身高1.16米，平均体重29.02kg；健康对照组101例，平均身高1.01，平均体重15.26kg。两组均排除继发性肥胖症且未服用激素与影响脂代谢的药物。两组间性别和年龄差异无统计学意义。
1.2 方法
1.2.1 血脂及血常规测定两组儿童于相同条件下按照标准方法测量身高和体重，根据公式BMI=W（kg）/H（m2）计算BMI，其中W代表体重，单位为千克，H代表身高，单位为米。抽取2mL静脉血予乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，于雅培公司CELL-DYN3700全自动五分类血细胞分析仪上测定血常规。同时严格执行室内质控程序。
1.2.2 全血基因组DNA提取 取200μLEDTA抗凝全血，用Quanqia试剂盒提取全血基因组DNA，-20℃保存。
1.2.3 KCTD15基因多态性的检测（1）引物的设计：应用PrimerPremier5软件进行设计,由上海立菲生物技术有限公司合成。PCR扩增正向引物为F：TCATGCCTGGATGCACAAC，反向引物为R：GATCTCACAACCAGCGAGTTC。SNaPshot反应过程中延伸引物序列为tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttTGACCTCTGCAGACCTAGGA。（2）PCR扩增反应：PCR反应体系为20μL,包括10×PCR缓冲液（Mg2+free，invitrogen公司）2μL，dNTP混合物0.5μL（10mM，Takara公司），0.8μLMgCl2（50mM，invitrogen公司），PlatinumTaqDNA聚合酶0.2μL（5U，invitrogen公司），PCR正向和反向引物（10pmol/L）各0.5μL和1μLDNA模板（20mg/L）。PCR反应程序：95℃变性2分钟，94℃变性20秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，33个循环，最后72℃延伸5分钟，结束后4℃保存。PCR扩增后，取PCR反应产物2μL做琼脂糖凝胶电泳检测有片段的表明实验成功。（3）PCR产物纯化：用虾碱酶方法进行PCR产物的纯化，总体积为10μL，在2μLPCR产物中加入0.3μLSAP（1U/μL）和0.2μLExoI（20U/μL），震荡混匀，37℃保温1小时40分钟，然后75℃保温15分钟以灭活SAP和ExoI酶，纯化好的模板可以在4℃保存24小时或-20℃长期保存。（4）SNaPshot反应：取1.5μL纯化好的PCR产物，每条浓度为0.2μmol/L的SnaPshot引物混合物、SNaPshot荧光混合物（含AmpliTaqDNA多聚酶和不同荧光标记的ddNTP）组成一个PCR反应体系。SNaPshot反应程序：96℃变性10秒，然后96℃变性10秒,51℃退火5秒，60℃延伸30秒,25个循环，最后60℃延伸30秒，结束后4℃保存。SNaPshotPCR产物用SAP纯化，总体积为8μL，在5μL上述延伸产物中加入0.5μLSAP（1U/μL），震荡混匀，37℃保温1小时，75℃保温15分钟以灭活SAP酶，4℃可保存24小时或-20℃长期保存。（5）3730扫板分析：首先将SNaPshot产物稀释20倍。每份样品中加入Hi-DiFormamide(高纯甲酰胺)8.6μL,GeneScan-120LIZSizeStandard0.9μL,SNaPshot纯化产物0.5μL,总体积10μL,95℃变性5分钟，迅速冰冷4分钟。在ABI3730XL型DNA序列检测仪上进行毛细管电泳，运行GeneMapper4.0软件分析实验结果。
1.3 统计学方法 计量资料采用x-±SD表示，组间差异进行方差分析，样本间率的比较用χ2检验。采用SPSS14.0 进行统计学处理，以P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 KCTD15 基因rs29941 位点多态性的测序结果
3730测序结果经GeneMapper4.0软件处理后KTCD15基因rs29941位点的SNaPshot图像见图1。
图 1 KCTD15基因rs29941位点的波形和基因型。1：KCTD15基因rs29941位点T/T基因型；2：KCTD15基因rs29941位点T/C基因型；3：KCTD15基因rs29941位点C/C基因型。（T：蓝色，C：绿色）。
2.2 KCTD15基因rs29941 位点基因型及等位基因型频率在肥胖组和正常对照组的比较
KCTD15基因rs29941 （A/G）位点TT、TC、CC基因型在肥胖组和正常对照组频率分别为60.7%、34.6%、4.7%和55.4%、39.6%、5.0%，而T、C等位基因型频率分别为78.0%、22.0%和75.2%、24.8%（见表1），经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，其等位基因在两种人群中的分布符合遗传平衡，具有群体代表性。肥胖组的BMI水平为20.95±2.50(kg/m2)显著高于健康对照组14.97±1.30(kg/m2)，差异有统计学意义(P<0.05),然而引起这一差异的原因，与KTCD15基因rs29941位点的多态性没有关联，因为T/T型、T/C型及C/C型基因型的BMI值在组间并没有显著差异（P>0.05）。该位点各基因及基因型频率在广西壮族学龄前肥胖儿童与健康对照组中的分布未见显著性差异（P>0.05），C等位基因的OR值为1.169, 95%的可信区间为0.742-1.842（见表1），因此该位点并非为广西柳州壮族学龄前肥胖儿童的易感位点。
Table 1 The frequencies of genotype and allele of KCTD15 gene rs29941 in obesity and control groups [n（%）]
3 讨论
近年来对肥胖症的研究有很多，尽管人们普片认为肥胖在很大程度上受到环境的影响，但2008年，WardleJ[6]等科学家通过对双胞胎体重指数和腹部脂肪厚度检测指标中证明了遗传因素才是在肥胖疾病中的主导因素。随后，全基因组关联分析（GWAS）渐渐的用于研究辨别在普通人群中肥胖存在的共同的遗传变异。然后对于含钾通道四聚化结构域15（KCTD15）基因单核苷酸多态性位点rs29941的变异，目前在国内外还存在着两种不同的观点。其中于2009年，WillerCJ等研究人员通过GWAS研究证实了rs29941位点与肥胖相关[4]，而在2014年由国内科学家通过对中国肥胖人群的GWAS分析中，排除了KCTD15的rs29941位点为我国肥胖的易感位点[7]。KCTD15基因位于19q13.11，编码含钾通道四聚化结构域15，看通过神经中枢影响肥胖，在脑及下丘脑影响食欲及能量平衡区域有很高的表达，最终使人发胖。该基因rs29941位点的最小等位基因频率（MinorAlleleFrequency）MAF=0.397（A）。为了研究这一人群携带率的改变是否和中国广西壮族人一致，同时探讨该多态性位点是否也与肥胖相关。因此，我们收集了200名柳州某区小学学龄前儿童（年龄均小于7岁）分别检测身高和体重，计算BMI。利用SNaPshot技术分析100例单纯性肥胖儿童和100例健康对照儿童的KCTD15基因型及等位基因频率分布状况。结果发现KCTD15rs29941(T/C)多态性位点基因型TT、TC、CC三种基因型的构成比以及等位基因T和C在肥胖组和健康对照组中并没有明显差异，并且差异没有统计学意义（P>0.05）。肥胖组的BMI值要明显高于健康对照组，差距有统计学意义（P<0.05），然而在对肥胖组rs29941多态性位点基因型与BMI水平比较的分析中，发现肥胖组中的BMI水平在各基因型中的差异没有统计学意义（P>0.05），C等位基因的OR值为1.169,95%的可信区间为0.742-1.842，OR值在1.0~1.1之间，说明该位点C等位基因与单纯性肥胖是没有关联的，因此我们推测KCTD15基因rs29941多态性与广西壮族学龄前儿童单纯性肥胖是没有相关性的，也与国内研究结果一致。
本研究得出与欧美的研究相反的结果，对于这种反差可能在于以下几个方面：（1）该基因多态性存在着种族差异；（2）该基因变异致肥胖作用较小，需要在大样本人群中或者选择合适的指标才可能检测到；（3）肥胖的发生发展是众多易感基因及环境因素相互作用的结果，某个位点变异的效应可能被其他基因或环境效应所修饰。要阐明KCTD15SNPrs29941位点基因多态与肥胖的关系，可通过特定种族人群的Meta分析或扩大样本规模提高检验效能，广泛选择肥胖表型，排除可能的混杂因素，以得出的更有意义的结论。
参考文献
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基金资助：中国疾病预防控制中心妇幼保健中心合生元母婴营养与健康研究项目(2012FY009)
论文作者:钟青燕,唐宁,李哲涛,李红辉,严提珍
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第2期供稿
论文发表时间:2014-4-4
标签：肥胖论文; 基因论文; 多态性论文; 位点论文; 单纯性论文; 儿童论文; 基因型论文; 《医药前沿》2014年第2期供稿论文;