陈虹[1]2002年在《凋亡抑制基因CED-9转化烟草和水稻的研究》文中研究指明当前，植物细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)已成为植物学的研究热点之一。CED-9是发育PCD的负调控基因，本课题将CED-9基因通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导转化烟草和水稻，获得以下结果： 1．从质粒pBS中获取CED-9基因片段，构建中间载体pGEM-ced9以获得合适的酶切位点。在此基础上再构建重组表达载体pBI-ced9，将CED-9基因置于CaMV35S启动子控制之下。然后以pBI121为对照组，通过根癌农杆菌EHA105的介导，将CED-9基因导入烟草叶片组织中，通过两轮抗性筛选，得到抗卡那霉素(Km)的再生植株。对所得到96株再生苗进行PCR检测，结果表明，阳性苗比例为34％。Southern点杂交结果显示，目的基因确已整合到烟草基因组中。 2．通过水稻幼胚诱导愈伤，并建立了水稻悬浮细胞系，为转基因提供了良好的受体材料。构建了用于水稻中表达的载体pCA-ced9，通过农杆菌EHA105转化导入水稻愈伤组织和水稻悬浮细胞，经潮霉素(Hym)筛选，以期望获得抗性植株，目前该工作仍在进行中。
王闻哲[2]2008年在《转细胞凋亡抑制基因Ced-9/Bcl-2提高烟草和水稻的耐铝抗盐性及其机理分析》文中研究指明Ced-9是从动物线虫(C.elegance)中克隆出来的抗凋亡基因,属于Bcl-2家族,与哺乳动物中的抗凋亡基因Bcl-2同源。前人的研究结果已经证实凋亡抑制基因Bcl-X_L和Ced-9能够促进植物细胞对生物和非生物胁迫的抗性,但是其作用机制仍知之甚少。本研究以烟草为模式材料,开展铝(Al)、盐诱导其细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)的研究,并通过转细胞凋亡抑制基因Ced-9/Bcl-2提高烟草和水稻的耐铝抗盐性及其机理分析,获得如下主要结果:1、用DNA ladder检测证明了Al诱导的植物细胞死亡是类似于凋亡的PCD过程。2、通过测定转基因烟草的相对根长、苏木精染色等指标,首次证明凋亡抑制基因Ced-9在烟草细胞内具有一定的促进耐Al功能。通过苏木精染色比较转基因和野生型烟草在不同Al浓度下根部Al的积累量,证实Ced-9可缓解Al胁迫下烟草根部Al的积累量。研究表明过量表达Ced-9的转基因烟草植株也表现出比野生型更强的抗盐能力。3、用DNA ladder检测比较转基因和野生型烟草在Al或盐胁迫条件下的植物细胞PCD,发现Ced-9能阻断Al或盐诱导PCD的发生,从而提高烟草的耐胁迫能力。4、研究发现Ced-9能通过下调植物细胞内Al和盐诱导的类天冬氨酸依赖性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的液泡酶(vacuolar processing enzyme,VPE)的表达水平,抑制Al和盐诱导的PCD发生。揭示PCD的负调控可能是潜在的耐Al机制之一,并且PCD的负调控作用对植物细胞耐受非生物胁迫具有广谱性。5、用荧光探针DCFH和Fluo-3结合共聚焦荧光显微技术,发现Al能显着诱导细胞内的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)增加。研究还发现凋亡抑制基因Ced-9不能抑制Al诱导的ROS增加,但能直接调节胞内钙离子(Ca~(2+))水平。暗示Ced-9作用于Al胁迫引起的ROS信号的下游并延迟了Al激活的Ca~(2+)信号水平的升高。推测Ced-9在植物细胞中的耐Al机制可能是通过延迟细胞内的Ca~(2+)信号水平的升高来抑制Al引起的PCD。6、研究表明Ced-9不直接上调受Al诱导的基因NtGDI1、parB、NtPox的表达,这些基因的表达能抑制Al胁迫激发的ROS所引起的脂质过氧化作用。说明Ced-9不直接抑制Al胁迫引起的脂质过氧化作用。7、此外,还将Ced-9和Bcl-2基因通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105介导转化水稻,获得以下结果:(1)将Bcl-2小片段连接到中间载体pGEM上以获得合适的酶切位点,构建中间载体pGEM-Bcl2,将酶切下来的Bcl-2小片段连接到载体pCAMBIA13011上,成功构建了表达载体pCAMBIA13011-Bcl2。(2)将pCAMBIA13011-Bcl2以及实验室已有的pCAMBIAl3011-Ced9通过农杆菌介导法转化水稻,用潮霉素对转基因种子筛选获得抗性植株,并进行PeR和Gus活性检测。(3)转基因植株后代遗传分析,获得转基因纯系,并用RT-PCR检测到转基因后代植株的基因表达。(4)利用Tail-PCR技术对其中一株转基因水稻进行了T-DNA插入位点检测。发现水稻基因组上对应位置在水稻8号染色体上。
金英浩[3]2012年在《转Bcl-2、Ced-9、PpBl-1基因水稻抗盐性及其抗性机理研究》文中进行了进一步梳理盐胁迫是植物生长发育的主要限制因素之一,严重影响着农作物的产量和品质。利用基因工程手段提高农作物的抗盐性已成为作物遗传改良的重要内容之一。前人的研究结果已经证实凋亡抑制基因Bc]-2和Ced-9能够提高植物细胞对生物和非生物胁迫的抗性,但是其作用机制仍知之甚少。本研究以水稻为材料,开展盐(NaCl)诱导细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)的研究,并通过转细胞凋亡抑制基因Bcl-2/Ced-9/PpBI-1提高水稻的耐盐性,研究其耐性机理。获得如下主要结果：1Bcl-2基因通过抑制盐胁迫引起的胞质Ca2+增加和PCD的产生,提高水稻对盐胁迫的耐受性。1.1在盐(NaCl)胁迫条件下,Bcl-2转基因水稻比野生型具有较高的萌发率、相对根长生长和细胞活性,显示更强的耐盐性,证明凋亡抑制基因Bcl-2在转基因水稻根尖细胞内具有明显的促进耐盐胁迫功能。1.2用DNA ladder检测方法,比较转Bcl-2基因和野生型水稻在盐胁迫条件下的细胞PCD,发现Bcl-2基因的过表达能明显地抑制盐诱导PCD的发生,说明过表达Bcl-2转基因水稻通过抑制PCD的产生而提高耐盐胁迫能力。1.3用Fluo-3/AM共聚焦荧光显微技术,发现NaCl能显着诱导水稻根尖细胞内钙离子(Ca2+)水平增加；Bcl-2能直接抑制调节胞内钙离子(Ca2+)水平。提示Bcl-2作用于盐胁迫引起的Ca2+信号水平的调控。Bcl-2在植物细胞中的耐盐机制可能是通过控制细胞内Ca2+信号水平的升高来抑制盐胁迫引起的PCD。1.4La3+处理能显着缓解野生型盐胁迫导致的水稻萌发率和根伸长抑制,减缓胞内钙离子(Ca2+)水平上升,抑制PCD发生。但La3+处理对Bcl-2转基因水稻作用不明显。2用非损伤微测技术(Non-invasive Microtest Technique(NMT))进一步证明了Bcl-2通过调节离子流抑制盐胁迫引起的PCD。2.1用非损伤微测技术(Non-invasive Microtest Technique),测定盐胁迫引起的水稻根尖细胞的离子流,结果表明,在盐胁迫下,野生型水稻细胞产生明显的K+和H+外流,而Bcl-2誓能够显着减弱K+外流并抑制PCD的产生,但H+外流没有影响。证明在盐胁迫下,发生水稻根尖细胞PCD的主要原因是盐胁迫引起的K+外流。2.2La3+处理野生型能够抑制盐胁迫引起的水稻根尖细胞K+外流,而对转Bcl-2基因水稻的作用不明显。说明Bcl-2的作用位点可能与La3+作用位点相同,均与NSCC发生作用。2.3采用共聚焦显微技术,测定细胞内Ca2+的含量以及Ca2+外流,结果表明在盐胁迫下,水稻根尖细胞Ca2+外流增加,而Bcl-2转基因水稻的Ca2+外排能力比野生型更强。3在盐胁迫-下,野生型水稻OsVPE-2和OsVPE-3表达显着高于Bcl-2转基因水稻；La3+处理能显着抑制野生型盐胁迫引起的OsVPE-2和OsVPE-3表达,但对Bcl-2转基因水稻影响不明显。3.1定量PCR测定结果表明,与野生型相比,胞质Ca2+水平显着降低的过表达Bc1-2转基因水稻中OsVPE-2和OsVPE-3的表达显着被抑制。3.2在盐胁迫条件下,La3+处理能显着抑制野生型盐胁迫引起的OsVPE-2和OsVPE-3表达,而La3+处理对转Bcl-2基因水稻OsVPE-2和OsVPE-3表达的影响不明显。3.3综合K+、Ca2+测定结果和OsVPE-2和OsVPE-3表达特征,表明在盐胁迫条件下,通过改变K+外流,影响胞质K+、Ca2+浓度,调节OsVPE-2和OsVPE-3表达,影响PCD的产生,最后表现出不同的抗盐性。4通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105介导转化方法,成功将抗凋亡基因Ced-9和PpBI-1转入水稻细胞,获得了转Ced-9和PpBI-1基因水稻株系,并进行抗盐性鉴定及其遗传分析。4.1构建含Ced-9或PpBI-1基因的表达质粒pCAMBIA13011-Ced-9/PpBI-1,通过根癌农杆菌EHA105介导转化水稻(日本晴),经潮霉素筛选和PCR鉴定、Southern杂交分析,证明Ced-9和PpBI-1基因成功插入到水稻基因组,并用RT-PCR分析确认Ced-9和PpBI-11基因已成功表达,获得了两个转基因纯合株系。4.2通过对转Ced-9/PpBI-1基因水稻T3代的生长发育特性分析,观察到转Ced-9基因水稻生长发育正常,而转PpBI-1基因水稻生长发育受到一定影响。认为与转基因插入位点有关。4.3通过对转Ced-9/PpBI-1基因水稻T3代的抗盐性鉴定,发现转Ced-9/PpBI-1基因水稻株系在萌发率和根伸长方面明显表现出对盐胁迫的耐受性。4.4通过DNA laddering检测发现,Ced-9基因过表达能减弱盐胁迫引起的水稻根尖细胞PCD。
潘建伟[4]2002年在《大麦根尖和边缘细胞铝毒生物学特性及其机理研究》文中指出铝毒是酸性土壤影响作物生长的主要原因，已成为植物胁迫生理学与遗传学的重要研究内容。然而，目前对植物铝毒机制仍不清楚。大麦是铝毒极为敏感的作物，本实验以大麦为材料，开展了铝毒诱导的根尖细胞超微弱发光、姐妹染色单体交换(SCE)、细胞程序性死亡、耐铝基因工程及边缘细胞在铝毒中的功能研究。试图为植物铝毒及耐铝机制和遗传改良研究探索新途径。 利用超微弱发光鉴定植物根尖铝毒及耐铝性，目前国内外仍未见正式报道。本实验表明，利用根相对伸长率可将30个大麦品种划分为耐铝、中等耐铝和敏感叁种类型；而利用根尖相对发光率可将其分成高耐铝、耐铝、中性、敏感和高敏感五种类型。根相对伸长率与根尖相对发光率之间具有正相关性(r=0.63295)。并且根尖相对发光率比根相对伸长率更为灵敏。建立的大麦根尖超微弱发光技术用于鉴定大麦耐铝性是完全可行的。 首次研究了铝毒诱导植物SCE的效应。观察到用20μmol／L Al诱导敏感大麦cv．2000-2的SCE率比耐铝大麦cv．Humai16高，铝毒诱导的SCE率与大麦耐铝性呈负相。经不同铝浓度处理，这两个品种的SCE率具有相类似的变化曲线，但两者的临界浓度(诱导SCE率最高的浓度)显着不同(分别为10和320μmol／L)。这些结果表明，大麦根尖SCE对铝毒反应极为敏感，可作为植物铝毒研究的敏感指标。用于鉴定大麦耐铝性。进一步的实验表明，Vc能明显抑制铝毒诱导的SCE。推测铝毒很可能通过诱导ROS间接诱导SCE的发生。 铝在根尖细胞壁上的积累是铝对植物根尖产生毒害的先决条件。通过对耐铝性差异极其显着(P＜0.01)的大麦cv．2000-2与cv．Humai16铝处理后的Morin荧光检测，观察到cv．2000-2根尖荧光明显比cv．Humai16强，表明敏感品种根尖细胞壁上铝积累比耐铝品种多。同时，铝处理4h的cv．2000-2根尖果胶甲基酯酶PME活性显着上升，但处理24h后PME活性又显着下降；而cv．Humai 16的PME活性无显着性差异。表明细胞壁上铝积累与PME活性变化有密切相关性，PME活性在铝毒敏感性中可能起着重要作用。 本研究首次报道了铝毒诱导大麦根尖细胞程序性死亡。在铝胁迫或无铝恢复培养过程中产生的细胞伸长或生长的不可逆抑制起源于细胞死亡。0.1-5.0mmol/L铝处理大麦根尖8h或悬浮细胞24h均产生了梯状DNA，但未观察到凋亡小体的形成。故将这种细胞死亡形式称为铝诱导PCD。超微弱发光的结果表明，铝诱导PCD很可能是通过ROS信号传导途径来实现的。铝毒诱导的不可逆抑制表明，一旦细胞死亡程序被激活后，无论铝存在与否，细胞死亡将成为一个不可逆的过程。 通过基因工程方法导入凋亡抑制基因是作物抗逆性遗传改良的一条新策略，也是细胞凋亡研究成果的具体应用，目前国内仍未见正式报道。本研究试图通过农杆菌介导法将凋亡抑制基因cedg导入烟草，获得高耐铝性的转基因植株。结果表明，利用pGEMJ松八载体上的Sacl和Xbal位点，将pBS载体上的cedg基因成功地克隆到表达载体pBllZI（含 CaMV 355）上，定名为 pBI－ced习。通过农杆菌感染烟草叶盘，经筛选、诱导和分化后，共获得96株再生植株厂。卜经PCR检测和h 杂交表明，目的基因cedg已整合到烟草基因组中。有关转基因植株的CCdg表达活性及其对生长发育的影响、耐铝性鉴定将在T；、TZ、T。代进行。 根边缘细胞（BC）研究是最近几年植物学和遗传学的新领域之一。本实验表明，大麦 cv．Hang 98 BC发育启动与根发育几乎同步，这与豆科植物 BC发育不同。在悬空气培中，大麦BC发育属于非组成型表达的过程。在水培中，每个根每天仍释放300～350个BC，属于组成型表达过程。根冠PME活性检测表明，大麦BC发育与PME活性具有密切的相关性，PME活性在BC游离过程中起着重要作用。温度对大麦根伸长有明显的抑制作用，但对BC发育影响不大。 铝毒对离体收集的 BC活性影响非常明显。大麦耐铝品种 cv．Humall6的 BC经 20和 50 v moffe AI处理后，其活性无显着性差异，而敏感品种 cv．2000．2的BC活性却受到显着抑制，说明BC的耐铝性与其个体植株水平的耐铝性相一致。到目前为止，国内外有关铝毒对植物BC发育的影响仍未见正式报道。本实验表明，铝毒对大麦 BC发育有明显的抑制作用。20 u mow AI对。2000上的 BC发育有显着性抑制o＜0刀5卜但对cv．Humal 16的BC发育的影响不大j0 u mowAI对这两个品种的BC发育均有显着性抑制0m．of卜PME活性检测表明，铝毒很可能通过抑制根冠细胞壁PME活性从而抑制BC发育。另外，根据我们的实验，BC及其粘液对铝毒诱导的大麦根伸长抑制的保护功能很小。但在低浓度铝或短时间胁迫下，BC及其粘液对其根尖分生组织和根冠分生组织具有一定的保护作用。这种保护作用可能与粘液中含有糖醛酸有关。
李璇[5]2011年在《胞质钙离子稳态在酵母铝诱导细胞死亡中的调控作用》文中研究指明铝(Al)毒是酸性土壤中限制作物生长和产量的重要因素之一。近年来,在胁迫植物生理学领域,针对Al毒和耐Al的分子机制研究取得重大进展。植物在进化过程中产生了两种重要的抗Al毒机制,分别是Al的外部排斥和内部耐受。其中,程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)的负调控也是一种Al的内部耐受机制。Al3+在诱导酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)凋亡发生时,伴随着胞质钙离子(ca2+)水平的上升,而在酵母中过量表达凋亡抑制因子时,胞质Ca2+水平下降。但是胞质Ca信号在PCD中的调控作用及其抗Al毒的内部耐受机制仍不清楚。本论文研究了酿酒酵母液泡Ca2+泵Ca2+-ATPase Pmc1p、细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM和凋亡抑制因子调控胞质Ca2+水平的功能以及胞质Ca2+浓度及其稳态在Al3+诱导酵母细胞死亡中的调控作用。取得主要结果如下：1.通过测定一系列酵母Ca2+通道突变体的Al毒敏感性,发现与野生型和其它Ca2+通道突变体相比,液泡Ca2+-ATPase PMC1的突变体(pmc1)对Al毒更加敏感。2.在Al3+处理条件下,野生型和pmc1突变体菌株都发生了细胞凋亡,而且pmc1突变体发生凋亡的细胞数目显着多于野生型,说明pmc1突变体由于液泡Ca2+通道异常,失去利用液泡调节胞质Ca2+水平的功能,引起胞质Ca2+浓度增加,促进PCD发生。暗示胞质Ca信号上升是Al3+诱导酵母细胞发生PCD的一个早期事件。3.为了分析pmc1突变体对Al毒敏感是否具有特异性,进一步用可以诱导酵母细胞发生凋亡的其它胁迫因子山梨醇、铜离子(Cu2+)和镉离子(Cd2+)作实验,结果表明pmc1突变体只对Ca和Al胁迫敏感。4.野生型和pmc1突变体细胞在不同pH值的培养基上生长能力相似,pH的变化几乎没有改变胞质Ca2+水平。而在Al处理条件下,pmc1突变体比野生型对Al毒更加敏感。说明pmc1突变体和野生型酵母在Al胁迫下产生的差异是由Al毒引起的而不是由于加入Al3+降低培养基pH值所引起的。5.为了研究PMC1能否缓解pmc1突变体对Al毒的敏感性,构建了PMC1的表达载体并将其转到野生型和pmc1突变体菌株中。结果表明,在Ca、 Al胁迫处理下,过量表达PMC1的菌株胞质Ca2+水平降低,从而增强了对Ca和Al胁迫的耐受性。6.胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM的实验表明,在1mM Al3+处理酵母细胞时,胞内Ca2+水平随加入BAPTA-AM浓度的增加而呈下降的趋势,并且BAPTA-AM的加入使酵母细胞存活率上升。说明BAPTA-AM可以抑制胞质过多的游离Ca2+,缓解Al对酵母的毒害作用。证实了Al3+诱导酵母细胞死亡是通过胞内Ca信号波动和Ca2+稳态调控的。抑制Al3+诱导胞质C2+的上升可以降低Al对细胞的毒害作用。7.为了研究凋亡抑制因子能否缓解pmc1突变体对Al毒的敏感性,将凋亡抑制基因(Bcl-2、Ced-9或PpBI-1)转入野生型和pmc1突变体菌株中。结果表明,在Al3+处理条件下,转基因酵母细胞中Al3+诱导胞质Ca2+上升的水平明显低于对照细胞,表达Bcl-2、Ced-9或PpBI-1的转基因酵母细胞对Al胁迫的耐受性提高,说明Al3+诱导胞质Ca2+水平上升可以被抗凋亡蛋白所抑制,凋亡抑制因子能够部分弥补Ca2+-ATPase PMC1-的功能。因此,可以通过对PCD的负调控调节胞质Ca2+稳态,从而缓解Al对细胞的毒害作用。8.为了研究Ca信号的分子机制,用荧光定量RT-PCR分析Ca信号途径因子的表达情况。其中PMC1、CMD1、CNB1和PLC1的表达水平在Al3+处理下发生变化。结果表明这些与Ca相关的基因参与了酵母中Al胁迫的应答。
参考文献：
[1]. 凋亡抑制基因CED-9转化烟草和水稻的研究[D]. 陈虹. 浙江大学. 2002
[2]. 转细胞凋亡抑制基因Ced-9/Bcl-2提高烟草和水稻的耐铝抗盐性及其机理分析[D]. 王闻哲. 浙江大学. 2008
[3]. 转Bcl-2、Ced-9、PpBl-1基因水稻抗盐性及其抗性机理研究[D]. 金英浩. 浙江大学. 2012
[4]. 大麦根尖和边缘细胞铝毒生物学特性及其机理研究[D]. 潘建伟. 浙江大学. 2002
[5]. 胞质钙离子稳态在酵母铝诱导细胞死亡中的调控作用[D]. 李璇. 浙江大学. 2011