（1江苏省宜兴市第二人民医院 江苏 宜兴 214221）
（2南京医科大学附属淮安一院 江苏 淮安 223300）
【摘要】 目的：了解一组多药耐药克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶基因和16SrRNA甲基化酶基因的存在状况。方法：收集南京医科大学附属淮安一院2013年2月至2015年3月病人标本中分离的多药耐药克雷伯菌属共20株，用分子鉴定法鉴定菌种，将15种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因使用聚合酶链反应（PCR）方法进行分析。结果：本组20株菌中19株为肺炎克雷伯菌, 1株为变栖克雷伯菌。氨基糖苷类修饰酶基因或/和16SrRNA甲基化酶基因检出率达80.0%。其中aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb群、ant(3″)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、rmtB的检出分别为9株、12株、10株、5株、4株。并且在变栖克雷伯菌中发现了aac(6’)-Ⅰb-cr基因。结论：本组克雷伯菌对氨基糖苷类产生耐药，造成该结果的主要原因是其产4种氨基糖苷类修饰酶基因和1种16SrRNA甲基化酶基因。在变栖克雷伯菌中发现了aac(6’)-Ⅰb-cr基因是国内外首次报道。
【关键词】 克雷伯菌属；氨基糖苷类修饰酶；16SrRNA甲基化酶；多药耐药
【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）31-0195-02
Study on the drug resistance-related aminoglycoside genes form multi-resistant klebsiella
Wuhaipeng1 Linning2 Sunhaiping2
1 Yixing Second People’s Hospital,Jiangsu,214221,China;2.Huai’an First Hospital, Nanjing Medical University, Jiangsu,223300,China
【Abstract】Objective To understand the distribution of aminoglycoside modifying enzyme genes（AMEs）and 16SrRNA methylase genes in a group of multidrug-resistant Klebsiella. Methods From feburary 2013 to march 2015, 20 strains of multidrug-resistant Klebsiella were collected from samples of inpatients in Huan’an First Hospital Nanjing Medical University, strains were identified by molecule identification, and 15 kinds of AMEs and 6 kinds of 16SrRNA methylase genes were analyzed by PCR. Results In 20 strains of Klebsiella, 19 strains were Klebsiella pneumonia, 1 strain was Klebsiella variicola. And AMEs and 16SrRNA methylase genes were positive in 16 strains: 9 strains of aac(3)- Ⅱ, 12 strains of aac(6’)-Ⅰb group , 10 strains of ant(3″)-Ⅰ, 5 strains of aph(3’)-Ⅰ, 4 strains of rmtB were positive. And aac(6’)-Ⅰb-cr was discovered in Klebsiella variicola. Conclusion In this group of Klebsiella, producing AMEs and 16SrRNA methylase genes played a key role in resistance to aminoglycosides. And it’s the first report that aac(6’)-Ⅰb-cr were discovered in Klebsiella variicola in the world.
【Key words】Klebsiella; Aminoglycoside modifying enzyme;16SrRNA methylase;Multidrug resistance
近年来氨基糖苷类药物在临床抗感染领域过度应用，临床对其耐药的分离株屡见不鲜。本研究对一组多药耐药克雷伯属菌进行15种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因检测，以清晰克雷伯菌属对氨基糖苷类药物产生耐药的相关基因及存在现状，现报告如下。
1.材料与方法
1.1 菌株来源
20株克雷伯属菌均分离自南京医科大学附属淮安一院2013年2月至2015年3月住院患者临床标本，其中痰液18份，血液1份，脑脊液1份。采用法国生物梅里埃公司Vitek32全自动细菌鉴定仪对全部菌种进行初步鉴定。经检测和对比确认，19株为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)，1株为变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola,Kva)。
1.2 抗菌药物敏感性试验
选择14种抗菌药物，采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验。质控菌株ATCC700603肺炎克雷伯菌购自江苏省临床检验中心。
1.3 细菌处理
提前将新鲜配制浓度为200μg/L的蛋白酶K溶液400μl置入0.5ml的离心管，再置入经纯培养的单个菌落，为消化细菌细胞膜裸露DNA而放置56℃水浴2小时，为灭活蛋白酶K而改置95℃水浴10分钟，提取上清液-20℃保存备用。
1.4 基因检测
将15种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因使用聚合酶链反应（PCR）方法进行分析。无锡新区虎马生物信息学工作室设计并授权使用全部PCR引物。无锡市克隆遗传技术研究所提供检测试剂盒以及阳性对照DNA，所有步骤和使用方法均严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.5 基因测序
采用荧光法直接测序检测阳性基因（委托铂尚(上海)生物技术有限公司完成）。测得序列采用Chromas软件读序,并进行BLAST Search比对。
2.结果
2.1 抗菌药物敏感性试验
20株多药耐药克雷伯菌属菌对14种抗菌药物的耐药率：头孢噻肟100%、头孢呋辛90%、复方新诺明85%、庆大霉素75%、氯霉素75%、头孢他啶75%、头孢吡肟70%、环丙沙星70%、阿米卡星70%、头孢西丁65%、左氧氟沙星60%、头孢哌酮/舒巴坦45%、哌拉西林/他唑巴坦45%、亚胺培南30%。
2.2 基因PCR检测及其测序
20株多药耐药克雷伯属菌中有16株检出氨基糖苷类修饰酶基因或/和16SrRNA甲基化酶基因，检出率80.0%。其中aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb群、ant(3″)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、rmtB的检出率分别为9株（45.0%）、12株（60.0%）、10株（50.0%）、5株（25.0%）、4株（20.0%）。Klebsiella variicola(Kva)菌aac(6’)-Ⅰb-cr型测序图见图1。
3.讨论
革兰氏阴性菌主要携带乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH）、核苷转移酶(ANT)三大类基因，是氨基糖苷类药物产生耐药的最重要机制[1]，目前已发现30余种。引起革兰阴性杆菌对氨基糖苷类药物耐药的原因，一是由于产氨基糖苷类修饰酶灭活进入细菌胞内的氨基糖苷类药物活性而耐药；二是由于产16SrRNA甲基化酶导致靶位甲基化后的16SrRNA与氨基糖苷类药物结合力下降，该二类基因常常为可移动遗传元件介导，为获得性耐药机制且易于水平传播。其它原因尚有细菌对药物摄入量减少，细菌核糖体小亚单位的16SrRNA或小核糖体蛋白编码基因突变，细菌主动外排机制增强等。
本组研究20株多药耐药克雷伯属菌中共检出4种（16株）氨基糖苷类修饰酶基因，分别为aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb群、ant(3″)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ，其中aac(6’)-Ⅰb群、ant(3″)-Ⅰ阳性率均大于50.0%。国内、外陆续有学者发现新氨基糖苷类修饰酶-aac(6’)-Ⅰb-cr型对氨基糖苷类药物以及喹诺酮类药物均会产生修饰钝化作用 [2]。我们也曾在耐药铜绿假单胞菌临床分离株发现aac(6’)-Ⅰb-cr基因[3]。本研究中aac(6’)-Ⅰb群阳性共检出12株，经PCR阳性产物测序比对，其中10株检出aac(6’)-Ⅰb-cr型。其中变栖克雷伯菌检出aac(6’)-Ⅰb-cr型基因,为国内外首次发现。
细菌产16S rRNA甲基化酶而耐氨基糖苷类药物是近年革兰阴性杆菌出现的新现象,氨基糖苷类药物作用靶位被甲基化后，全部氨基糖苷类药物失去作用，故后果非常严重。本组20株多药耐药克雷伯属菌检出rmtB型16S rRNA甲基化酶基因，阳性率达20.0%。过去我们曾从本院的多药耐药大肠埃希菌和耐药铜绿假单胞菌中査出rmtB型16SrRNA甲基化酶基因[4]。本研究再次从克雷伯属菌中査出,提示rmtB型16SrRNA甲基化酶基因在本院的菌株中有一定的流行。
【参考文献】
[1]原鸿雁,郭兵方,尹晶平,等.耐药大肠埃希菌氨基糖苷类修饰酶和16SrRNA甲基化酶基因的分析[J].江苏大学学报（医学版）,2013,23(5):419-422.
[2]黄支密,糜祖煌,王春新,等.阴沟肠杆菌中发现氨基糖苷类-氟喹诺酮类修饰酶基因aac(6’)-Ⅰb-cr[J].中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(6):531-533.
[3]林宁,孙海平.耐药铜绿假单胞菌临床分离株发现aac(6’)-Ⅰb-cr基因[J].中华临床感染病杂志,2011,4(3):163-167.
[4]林宁,孙海平,糜祖煌.多重耐药大肠埃希菌16SrRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因研究[J].中国抗生素杂志,2008,33(9):536-539.
论文作者:吴海鹏1 林宁2（通讯作者）,孙海平2
论文发表刊物:《医药前沿》2016年11月第31期
论文发表时间:2016/11/11
标签：糖苷论文; 氨基论文; 基因论文; 克雷论文; 检出论文; 甲基化论文; 类药物论文; 《医药前沿》2016年11月第31期论文;