（黑龙江省中医药科学院 哈尔滨 150036）
[摘要] 目的：探讨消瘕丸对H22荷瘤小鼠实体肿瘤的疗效及其可能的作用机制。方法：本研究运用H22肝癌小鼠模型，观察消瘕丸对小鼠H22肝癌的疗效、免疫功能的影响。结果：消瘕丸能明显抑制小鼠H22肝癌肿瘤的生长，抑瘤率高达38.7%，稳定病灶，能提高荷瘤小鼠的生存质量，明显提高校正廓清指数α（P＜0.01）以及溶血素水平（P＜0.05），改善免疫功能。结论：消瘕丸对小鼠H22肝癌有明显疗效，其作用机制与其本身对H22肝癌实体瘤有抑制作用和提高荷瘤小鼠免疫功能有关。
[关键词] 消瘕丸；H22肝癌；廓清指数α；溶血素
Objective: To investigate the therapeutic effect of Xiao Pill on solid tumor of H22 bearing tumor mice and its possible mechanism. Methods: in this study, H22 hepatoma mouse model was used to observe the effect of Xiao Pill on the efficacy and immune function of H22 liver cancer in mice. Results: the pill can obviously inhibit the growth of H22 tumor in mice. The tumor suppressor rate is up to 38.7%. It can stabilize the tumor, improve the survival quality of the tumor bearing mice, improve the correction of the clearance index alpha (P < 0.01) and the level of hemolysin (P < 0.05), and improve the immune function. Conclusion: Xiao Zhen pill has obvious effect on H22 liver cancer in mice, and its mechanism of action is related to its inhibiting effect on H22 hepatoma solid tumor and improving the immune function of tumor bearing mice.
Xiao Qi pill; H22 liver cancer; clearance index alpha; hemolysin
中药复方防治肿瘤，是目前肿瘤研究的热点。消瘕丸由白花蛇舌草、苦参、黄芪、僵蚕等组成，是长期临床实验经验总结的有效验方。本研究以H22荷瘤小鼠作为研究对象，探讨及抗肿瘤的作用及可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 试剂
小鼠H22细胞株，由黑龙江省肿瘤研究所提供；环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：20140307）；印度墨汁：北京西中化工厂，批号：20110506；碳酸氢钠：天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20080718）；绵羊红细胞：哈尔滨兽医研究所提供；SA缓冲液（C4H4N4O30.46g, MgCI20.2g、2H2O0.2g、NaCl8.38g、NaHCO30.252g、C3 H11 N2Na O30.3g，加蒸馏水至1000ml）；都氏液：碳酸氢钠1.0g、氰化钾0.05g、高铁氰化钾0.2g,加蒸馏水至1000毫升。
1.2实验动物
昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（黑）2012-008；豚鼠：体重350-450g，由哈尔滨市松北区翔
［作者简介］王欣，硕士，助理研究员，从事中药的药效学及机制研究，E-mail:keaidyuxi@163.com
林养殖场提供，许可证号：SYXK（黑）2006-008。
1.3实验仪器
721分光光度计：上海第三分析仪器厂；酶标仪：TECAN，infinive M200PRO；
低速台式离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司，TDZ4A-WS；电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司，DK-98-ⅡA。
2.2 实验方法
2.2.1 对H22小鼠瘤重的影响
接种方法[1-2]：无菌条件下抽取传代7天，生长良好的H22荷瘤小鼠腹水，无菌生理盐水1:3稀释（显微镜下计数约含肿瘤细胞2*106/ml），按0.2ml/只接种于常规消毒后的小鼠右前肢腋部皮下。
实验分组：造模后小鼠随机分为5组，每组10只，分别为消瘕丸高、中、低剂量组（生药量44.2g/kg、22.1 g/kg、11.1g/kg）；模型组：20ml/kg生理盐水；环磷酰胺（CTX）给药组：每日1次腹腔注射CTX 30 mg/kg；另选10只未接种肿瘤细胞的小鼠作为空白组。小鼠接种肿瘤细胞后第2天开始给药，每天1次，连续给药14 d。第15天，称取小鼠体重，取瘤块称重，计算抑瘤率。
2.2.2 对H22荷瘤小鼠对碳粒廓清的影响[3]
a计算单核巨噬细胞吞噬指数
接种方法及实验分组同2.2.1，于第15天尾静脉注射用生理盐水稀释3倍的印度墨汁，给药容积为10 ml/kg，分别于注射后1 min和11 min用毛细血管从眼眶后静脉取血25 μl，溶于2 ml 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，置721分光光度计在波长650 nm下比色测定光密度（OD），以0.1%Na2CO3溶液校零。最后将小鼠处死，称体重、肝重和脾重。按下式计算廓清指数K和校正廓清指数α。
b颈椎脱臼处死小鼠，取胸腺、脾脏称重计算胸腺、脾脏系数并计算矫正吞噬指数α值。计算公式
1.4.3对H22荷瘤小鼠血清溶血素的影响
接种方法及实验分组同2.2.1。
绵羊红细胞制备：将从绵羊颈静脉抽取血液100ml，离心去除其它成分后，用生理盐水冲洗，制成的红细胞放入生理盐水中备用。试验时取离心沉淀的红细胞生理盐水3:5（v/v）稀释即用。
豚鼠补体制备：实验时取6只豚鼠，心脏抽血，分离血清，将1ml压积红细胞加入到5ml豚鼠血清中，放4℃冰箱30min去除非特异性补体参与的溶血，2000r/min离心10min，吸取血清备用。
各组小鼠于给药3天后，腹腔注射绵羊红细胞悬液（SRBC）0.2mL/只进行免疫，于免疫后第11日（共给药14天），眼内静脉丛取血，2500rpm离心10分钟，分离血清备用。
溶血素测定：取各样品管中血清用SA缓冲液稀释300倍，将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%(v/v)的绵羊红细胞0.5mL，1:8补体1ml。另取对照管加入1mL生理盐水，10%(v/v)的绵羊红细胞0.5mL，、1:8补体1ml。将各管置37℃水浴中保温20min，冰浴终止反应后2000rpm离心10 min。另取试管，分别取上清液1mL，加都氏液3mL，同时取10%绵羊红细胞稀释液0.25mL，加都氏液至4mL，充分混匀，静止10分钟后，用酶标仪于540nm波长处，以对照管作空白，测各管的吸光度。计算每个样品的半数溶血值（HC50）。公式：
样品HC50=样品的吸收度值/羊红细胞半数溶血时吸收度值×稀释倍数
受试样品的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项试验结果阳性。
结果以各给药组与对照组的平均HC50值进行统计分析。
2 结果
2.1 消瘕丸对小鼠体重及肿瘤重量和生长抑制率的影响
表1 消瘕丸给药前后对小鼠体重的影响
注：与给药前组比较#p＜0.05,##p＜0.01,与消瘕丸组比较*p＜0.05,**p＜0.01
由表1可见，消瘕丸高剂量组的体重于结束时与给药前比较均有所升高P<0.01，环磷酰胺组的体重较给药前的明显下降P<0.01；且环磷酰胺组的体重明显低于五龙消癥丸高、中、低剂量组P<0.01。 消瘕丸给药可使荷瘤小鼠体重明显增加，改善荷瘤小鼠的生存质量。
表2 消瘕丸对小鼠瘤重的影响
注：与空白组比较#p＜0.05,##p＜0.01,与模型组比较*p＜0.05,**p＜0.01
瘤组织肉眼观察：模型组瘤体积明显大于给药组，瘤体表面无明显被膜，与周围组织粘连且不易剥离，肿瘤浸润至肌肉组织深部甚至浸润至肋骨。环磷酰胺组、消瘕丸高、中剂量组的瘤体明显小于模型组，与周围组织较易剥离，肿瘤与周围组织未见有明显的浸润。
由表2可见，消瘕丸高、中、低剂量组、环磷酰胺组肿瘤重量均较模型对照组减轻（P<0.01），瘤重抑制率（%）均﹥38%。五龙消癥丸高、中剂量组平均瘤重抑制率在65%、50%左右。
2.2 消瘕丸对小鼠碳粒廓清巨噬细胞吞噬功能的影响
表3 消瘕丸丸对H22荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 (±s)
注：与正常对照组比较**P＜0.01；与模型组比较##P＜0.01；与CTX组比较&& P＜0.01
由表3可知，模型组及环磷酰胺组矫正碳粒廓清吞噬指数均较空白组明显降低，差异具有显著性意义（P＜0.01），消瘕丸高剂量组矫正吞噬指数明显高于模型组（P＜0.05）及环酰胺组（P＜0.01），与空白组无明显差异（P＞0.05）。消瘕丸组能提高荷瘤小鼠的碳粒廓清能力，但无无明显的剂量关系。
2.3 消瘕丸对小鼠溶血素的影响
表 4 消瘕丸对H22荷瘤小鼠血清溶血素的影响 (±s)
注：与正常对照组比较**P＜0.01；与模型组比较##P＜0.01；与CTX组比较&& P＜0.01
由表4可知，模型对照组荷瘤小鼠血清溶血素含量明显低于正常组（P＜0.01）；环磷酰胺组荷瘤小鼠血清溶血素含量低于模型组(P＜0.01)；消瘕丸组荷瘤小鼠血清溶血素含量虽低于正常组但(P＞0.05)；消瘕丸高、中剂量组血清溶血素明显高于模型组(P＜0.05)；消瘕丸各组血清溶血素明显高于环磷酰胺组(P＜0.01)。消瘕丸可提高荷瘤小鼠的溶血素水平，改善其免疫功能。
3 讨论
肝癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，对放疗、化疗及免疫治疗的敏感性均较差。因此寻找安全、有效的药物依然是肿瘤治疗工作的重要课题。采用抗肿瘤中药治疗恶性肿瘤是具有中国特色的肿瘤治疗方式[4]。在本研究中，消瘕丸组抑瘤率高达38.7%。消瘕丸进入机体后，能剌激机体的免疫系统，增强机体的细胞免疫功能以及体液免疫功能，表现为荷瘤消瘕丸给药组校正廓清指数α明显高于模型组，血清溶血素水平也明显提高。本研究从基础研究角度证实消瘕丸对H22肝癌实体瘤有明显疗效，其作用机制可能与其本身有抗癌作用和增强机体的免疫功能有关，具体作用机制有待进一步探讨。
4参考文献
[1]吴勉华，李黎.消癌解毒方对H22荷瘤小鼠基因表达谱的影响[J].中国中西医结合杂志,2013,33(9),1232-1235
[2]刘宝瑞,徐修礼,刘文超,等.4种中药制剂对人肺癌A549细胞增殖的影响[J].中国药理学通报,2002,18(1):94-96.
[3]李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:157.
[4]李博,李瑞汉,高冬梅.中医药抗肿瘤机理研究概况[J].实用中医内科杂志,2005,19(5):403-406.
论文作者:王欣
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第05期
论文发表时间:2018/7/18
标签：小鼠论文; 血清论文; 红细胞论文; 肿瘤论文; 给药论文; 模型论文; 生理盐水论文; 《世界复合医学》2018年第05期论文;