【摘要】目的：利用多重实时PCR技术，通过优化反应体系和反应条件，探索一种可同时且快速准确检测五类致谢性大肠埃希菌、志贺菌的方法。方法：选择78株大肠埃希菌、志贺菌为研究对象，筛选各菌种特有的一些毒性基因，包括aggR、eaeA、ipaH、lt、stlb、stx1及stx2，以这些毒性基因作为PCR扩增反应的检测目标，通过NCBI网站获取各基因的核苷酸序列，利用引物设计软件primer5.0进行引物序列的设计，而后进行PCR扩增反应，对反应产物进行验证从而证实引物的特异性，同时通过反应体系中各底物浓度的配比进行调节和对反应条件进行优化调整，确定最佳PCR扩增体系和条件，最终成功建立一种能同时鉴定五类致泄性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。结果：本研究结果发现，针对各菌种的毒性基因所设计引物经PCR扩增反应的验证，被证实均特异性地扩增出相应的目标基因产物，且在本研究中对78株大肠埃希菌及志贺菌的多重PCR检测结果与单重PCR检测结果吻合。结论：本研究利用多重PCR技术，成功建立了一种能同时且特异性地检测致泄性大肠埃希菌及志贺菌特异性的检测方法，我们期望这种检测方法可应用在临床疾病诊断及在食品检验等方面发挥具有重要作用。
【关键词】致泻性大肠埃希菌；多重PCR方法；毒性基因；内参照基因
Development of a multiplex PCR assay for the five main pathotypes of diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp
Abstract：Object To explore the reaction system and conditions and establish a rapid, accurate method to identify five categories of E.coli and shigella by using the multiple real-time PCR technology. Methods 78 strains of E.coli and shigella were included in this study, and choose virulence genes of e. coli and shigella, including aggR, eaeA, ipaH, lt, stlb, stx1 and stx2 for target, the nucleotide sequence of each gene were obtained from NCBI, design the validation primers by using the software primer, and then the PCR products were tested to confirm the specificity after PCR amplification reaction, at the same time the ratio of the substrate concentration and conditions were adjusted and optimized, eventually successfully establish a multiple PCR method which could identify five classes of e. coli and shigella. Results In this study, the primers can amplify the corresponding gene product, in the experiments of 78 strains of E.coli and shigella test results are in complete accord with single PCR identification results, confirmed the detection of five classes to drain of E.coli and shigella by using multiple PCR reaction. Conclusion In this study, we successfully established a multiple PCR method to detect the characteristics of E.coli and shigella, we are looking forward it can be applied in clinical disease diagnosis, and plays an important role in food inspection and other aspects.
Key Words：diarrheagenic Escherichia coli; multiplex PCR; virulence genes; internal control gene
腹泻是一种具有季节性发病特点，在世界范围内流行的肠道疾病，导致其发病的细菌被称为致泻性细菌，在医学上通常将这些能够引起腹泻症状的细菌称为致泻性大肠埃希菌（DEC），另外根据毒力、致病机制及流行病学特征可将DEC分为五亚类，分别被命名为肠产毒素大肠埃希菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、肠出血性大肠埃希菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC）、肠集聚性大肠埃希菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（Enteroinvasive-Escherichia coli，EIEC）及肠致病性大肠埃希菌（Enteropathogenic E.coli ，EPEC）[1]，同时各类DEC的致病机制不尽相同，且目前对其致病机制不甚明确，目前科学界普遍认为，DEC的致病性主要由质粒编码的毒力基因决定，该类菌和志贺菌是目前引起人类感染性腹泻的主要病原菌，易造成社会重大的公共卫生负担[2]。现阶段在临床上关于致腹泻病原菌的检测，主要鉴定方法是依靠常规分离生化血清学检测，然而这类方法存在一系列的操作问题，例如耗时、工作量大且缺乏统一评判标准等，因很难满足对微生物快速、特异性检测鉴定的需要，因此在推广应用方面存在一定难度和限制。所以，在实验室条件下探索一种快速、敏感性高、特异性强的检测方法对于保障公众健康至关重要。本研究旨在总结以往常规检测方法的基础上，建立一种可在同一个PCR反应体系中同时鉴定致谢性大肠埃希菌、志贺菌的特有毒性基因，包括stx1、stx2、aggR、eaeA、ipaH、lt、stlb及参照基因rrs进行检测的验证方法，以达到快速、高效地鉴别临床中相应的致泻大肠埃希菌和志贺菌的目的。
1 材料与方法
1.1 实验菌株
本研究所用的78株菌株，均购自中国药品生物制品检定所，分别包括ETEC、 EHEC、EAEC、EIEC、EPEC 各2、39、5、3、10及志贺菌9株。其他9种与腹泻相关的菌株均为本实验室分离保存，包括阿伯丁沙门氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、气单胞菌、枸橼酸杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌及副溶血弧菌。
1.2 药品及实验用仪器
菌株培养用LB液体培养基、琼脂糖、DNA marker（上海生工，中国）；Taq DNA聚合酶试剂盒（TaKaRa公司，日本）；DNA提取试剂（MP公司，美国）；荧光定量PCR仪（ABI公司，型号7500，美国）。
1.3 多重PCR检测方法
1.3.1 引物设计合成 在NCBI网站GenBank数据库中检索各基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计相关的正反向引物序列[3]，交由上海捷瑞生物公司合成，引物序列等详细信息参见表1。
表1 PCR扩增实验所用引物相关信息
1.3.2 获取微生物DNA
具体实验步骤参照DNA提取试剂盒使用说明，DNA提取后-20℃保存备用。
1.3.3 单重PCR体系扩增及条件优化
按照TAKARA公司DNA聚合酶试剂盒的使用说明配制反应体系，包括2x SYBR Premix Ex TaqTM，10μM的正向引物（Forward primer）、反向引物（Reverse primer）、50 x ROX Reference Dye （Ⅱ），DNA模板以及灭菌蒸馏水。DNA扩增的反应条件为95℃预变性；95℃变性，60℃ 退火，循环反应，72℃延伸。分别以标准菌株EDL933、E2348 /69、10407、44825、F2a301、Ec042、MG1655的染色体为模板，对stx1、stx2、eaeA、lt、stlb、aggR、ipaH及内参基因rrs片段进行扩增，其过程对每个基因引物和探针浓度进行梯度优化以获得最佳的浓度组合。最后对扩增产物进行1.5%的凝胶电泳，回收胶体纯化后由上海捷瑞生物公司进行测序比对，验证扩增产物的特异性和正确性。
1.3.4 引物特异性检测
9种与腹泻相关的病原菌，包括阿伯丁沙门氏菌、霍乱弧菌、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、气单胞菌、枸橼酸杆菌、阿伯丁沙门氏菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌及副溶血弧菌，分别提取其DNA，按1.3.3的方法进行特异性PCR扩增反应，获得的扩增产物于浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳中进行跑胶，观察扩增产物的有无及其大小。
1.3.5 多重PCR体系的建立及条件优化
参照Vu等人的多重PCR方法[4]，同时参考Lin和Chase的文献[5-6]对1.3.3中描述的荧光PCR反应条件和体系进行优化（主要优化内容包括8对引物浓度比例、PCR反应体系及条件、上下游引物引物浓度的配比、Buffer浓度（1x、2x、3x、4x）、酶浓度（2U/50μL、4U/50μL）以及反应循环数），PCR扩增体系中标准菌株的DNA均按1:5的比例混合，初始浓度均为10ng/μL。反应结束后将扩增产物于浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳中跑胶验证。
2 结果
2.1 单重PCR反应扩增结果
PCR扩增反应中，以6种标准阳性菌株EDL933、E2348 /69、10407、44825、F2a301、Ec042及标准阴性菌株MG1655作为扩增模板，对目的基因片段进行扩增，结果显示7种标准菌株均对内对照基因rrs扩增为阳性。五类DEC中EHEC、ETEC分别可分为3个基因型， 和2个基因型，而EPEC、EIEC、EAEC及志贺菌则均只为1个基因型。具体检测情况见表2。
表2 五类DEC和志贺菌基因分型情况
2.2 PCR引物特异性检测
以内对照菌株rrs基因为模板，对其他7对毒力基因的引物进行PCR扩增，结果显示，在合适的PCR反应体系和反应条件下，阴性菌株的PCR扩增结果均表现为阴性，而阳性对照菌的PCR扩增结果则均表现为阳性，此结果说明设计的引物具有良好的特异性。
2.3 多重PCR反应体系及反应条件优化结果
通过对PCR反应体系和反应条件进行优化，确定最佳的反应体系如下，反应体系：2x SYBR Premix Ex TaqTM 5μL，10μM的Forward primer、Reverse primer各0.15μL，50 x ROX Reference Dye （Ⅱ）0.2μL，DNA模板1.0 μL以及灭菌蒸馏水3.5μL。各引物最佳浓度为rrs 0.1μmol/L、stx1 0.4μmol/L、stx2 0.6μmol/L、eaeA 0.2μmol/L、lt 0.3μmol/L、stlb 0.3μmol/L、aggR 0.5μmol/L、ipaH 0.2μmol/L。反应条件：95℃ 30 s预变性，1个循环；95℃ 5 s 变性，60℃ 34 s退火，40个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物进行电泳，结果如图1所示。
图1 8对引物PCR扩增后电泳结果
2.4 多重PCR反应分离菌株检测
按照优化后的PCR体系和反应条件对78株菌株进行了鉴定，结果显示多重PCR反应实验中检测的78株大肠埃希菌及志贺菌的鉴定结果与单重PCR鉴定结果吻合，此78株菌株分为9个基因型（见表2），此9个基因型的电泳结果如图2所示。
图2 11种毒力基因型的电泳结果
3 讨论
目前，在临床上对腹泻的诊断一方面是根据对患者的临床症状进行分析，另一方面是对病原体进行分离培养和进行生化鉴定。EPEC、EHEC、EIEC、ETEC、EAEC是临床上常见的引起腹泻的DEC分离菌株，其大多数为不含有毒力基因的非致病菌株，因此区分其是否为致病菌株（是否含有毒力基因）是鉴定的关键。此五类DEC引起腹泻的临床症状虽略有不同，但仅仅依靠临床症状判断容易出现错误，并不能作为有效的依据。
传统鉴定病原体的方法存在一定缺点和局限，主要包括费时、操作复杂、灵敏度不高、易受外界条件干扰等。根据《感染性腹泻诊断标准》[7]中的描述，一般可采用普通的PCR扩增方法对各病原菌分离株的毒性基因进行检测，同时，已有关于利用多重PCR技术检测不同种类的致泻性大肠埃希菌和志贺菌的文献报道[8]，然而文献报道中的方法需要进行PCR后处理，从而降低了PCR检测病原菌的敏感性，当病原菌数量较低时会出现漏检或错检（如出现假阴性结果）的情况。
近年来，PCR是微生物检测鉴定方向的一种常见的检测手段和方法，它具有特异度高、灵敏度强及省时省力等优点，能够在一定程度上提高大肠埃希菌的检出和鉴定效率，目前， PCR方法已被国内外众多实验室采纳用于对大肠埃希菌的初步筛选和鉴定。然而，目前国内关于五类致泻性大肠埃希菌的筛选仍缺乏省力、高效、准确度高的鉴定和检测方法。在本研究中，对设计的引物进行PCR特异性扩增验证，并对反应体系以及循环反应条件等相关因素进行优化，针对五类致腹泻大肠埃希菌EAEC、EHEC、EIEC、EPEC、ETEC的毒力相关基因设计相应的引物，通过一步PCR反应同时筛选出五种DEC的特异性基因，成功建立一种能够同时检测鉴定五种DEC的多重PCR方法，从而避免了由于使用过多基因的多重PCR带来的假阴性问题[9]，本实验结果发现，多重PCR实验中对78株菌扩增特异性为100%，结果与单重PCR结果完全一致，实现了一管多检的要求。提示我们在临床上可通过对分离菌株以及模拟粪便标本进行多重PCR检测和鉴定，为鉴定不同类型的DEC提供一种较为简便快速、灵敏度高的检测方法。
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通讯作者：曹忠帅
论文作者:董文博1,袁野1,马淑红1 郭寰宇2,曹忠帅1*
论文发表刊物:《中医杂志》2016年12月
论文发表时间:2017/6/1
标签：引物论文; 菌株论文; 基因论文; 特异性论文; 鉴定论文; 方法论文; 体系论文; 《中医杂志》2016年12月论文;