（中山大学附属第八医院泌尿外科，深圳 518033）
[摘要]目的 探讨TK1基因在前列腺癌中的表达，其表达水平与前列腺癌的临床TNM分期,病理分级之间的关系，在前列腺癌的发生、进展中的作用，为前列腺癌的诊断、预后及治疗提供新的生物学指标。方法 采用免疫组化方法(Elivision)分别检测54例前列腺癌组织和13例前列腺增生组织标本中TK1抗体表达情况。结合患者临床资料及组织病理学特点探讨TK1表达与前列腺癌的恶性程度与转移的关系 结果 前列腺癌组中TK1抗体阳性表达率为61.11%(33/54),显著高于前列腺增生组的5%（1/20）的阳性表达率，TK1抗体随着临床分期及病理分级的提高，其阳性表达率显著升高。结论 TK1表达水平越高的前列腺癌组织中，病理分级相对越高，成正相关关系(P＜0.05)，可用于判断术后前列腺患者预后。
关键词：前列腺癌；胸苷激酶-1 免疫组织化学
Expression and Significance of Thymidine Kinase 1 in Prostatic Cancer
Wang Guxin, Luo Yunfei, Dai Ping, Cheng Zhihen,Wang Xinggen. Department of Urology, the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, shenzhen 518033,China
Corresponding author:Wang Guxin, Email:2206714351@qq.com
[Abstract] objective To investigate the expression of TK1 gene in prostate cancer, the relationship between its expression level and the clinical TNM stage, Gleason score of prostate cancer, the role of TK1 gene in the development and progression of prostate cancer, and provide new evidence for the diagnosis, prognosis and treatment of prostate cancer of the biological indicators.
[Methods] Immunohistochemical method was used to detect the expression of TK1 antibody in 54 cases of prostate cancer and 13 cases of benign prostatic hyperplasia. The relationship between TK1 and expression and the degree of malignancy and metastasis of prostate cancer was analyzed by combining the clinical data and histopathological features [Results] Prostate cancer group TK1 antibody positive expression rate of 61.11% (33/54), significantly higher than the positive expression rates of benign prostatic hyperplasia of 7.69% (1 / 13), through the analysis of TK1 antibody with increase of case classification and improvement of Gleason score, the positive expression rate was significantly increased. [Conclusion] The higher the expression level of TK1 in prostate cancer, the higher the pathological grade, the positive correlation (P <0.05), can be used to determine the prognosis of postoperative prostate cancer.
[Key words] Prostate cancer; thymidine kinase 1; immunohistochemistry
前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，占全球癌症发病率的第五位。据WHO全球肿瘤统计数据（GLOBOCAN 2008）显示，2008年前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二位（仅次于肺癌），占男性全部癌症发病例数的14%【1】。
随着现代血清学肿瘤标志物相关研究的迅速发展，一种极具生命潜力的细胞增殖标记物———胸苷激酶 1 （thymidinekinase 1，TK1） 在全身脏器肿瘤的发生、发展及其预后中的作用也逐渐受到关注。研究发现，在非增殖细胞和健康人血清中，TK1含量极微或检测不到，但在恶性肿瘤患者中伴随着肿瘤细胞的急剧增值而升高。认为TK1可以作为一种很好的细胞增值标志，适用于恶性肿瘤细胞增殖度检测[2]。本研究检测TK1抗体在前列腺癌与前列腺增生组织中的表达情况与Gleason分级及临床分期的关系，探讨TK1在前列腺癌诊断、预后及转移等方面的价值。
1资料与方法
1.1 标本来源 收集深圳市福田区人民医院（现中山大学附属第八医院）病理科2010年10月-2015年7月手术切除或活检的前列腺癌标本54例（术前均未行放化疗治疗），术后病理诊断证实为前列腺癌，年龄为45-80岁，中位年龄为61.7岁。骨转移根据放射性全身骨扫描、MRI及X线检查判定。重新采取实验标本，HE染色后请2位病理科主任医师读片，按照Gleason评分分为5级，其中G1期8例，G2期12例，G3期13例，G4期11例，G5期10例。临床分期按,AJCC-TNM标准分为4期，其中I期10例，II期18例，III期17例，IV期9例。另外取前列腺增生标本20例作为对照组，年龄为50-70岁。
1.2实验所需的试剂 TK1抗体（ab76495）购自英国Abcam公司。即用型试剂盒、柠檬酸缓冲液、Tween 20购自福建迈新公司。其他常用试剂：蒸馏水、双氧水、1%Hcl、1%氨水、70%、80%、90%、100%浓度酒精均有福田区人民医院病理科提供。
1.3 实验原理 免疫组织化学技术是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原-抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。本文采用Elivision法：主要使用福建迈新公司的即用型免疫组化 EliVisionTM plus 试剂盒，其是基于聚合物技术的最新一代免疫组化非生物素检测系统，是将多个抗鼠和抗兔的IgG分子标记在辣根过氧化物酶聚合物上，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。因此我们可以通过特定显色剂DAB使前列腺癌组织中的抗原-抗体复合物显色，本文中TK1主要在细胞质中染棕黄色。
1.4实验步骤 切片准备：对所有组织4微米连续切片，48度温水展片，捞片后60度恒温箱烤2小时。 脱蜡: 开始二甲苯脱蜡的，四缸二甲苯，每缸五分钟的；水化：分别用100%、95%、80%、70%酒精浸泡5分钟，蒸馏水冲洗几遍，然后用PBS容易洗3遍，每次3分钟。水化：每张切片上滴加3%的双氧水去背景，静置10分钟后，用PBS液冲洗3×3’。抗原修复：取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波炉中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗3×3’。(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)。 阻断内源性过氧化物酶：每张切片上滴加3%的双氧水孵液，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，用PBS液冲3×3’； 加入相应的一抗（已稀释1:200）及37°C孵液室温下孵育60分钟，然后PBS缓冲液冲洗3×3’；加入增强剂，常温孵育20min，然后PBS缓冲液冲洗3×3’; 加入二抗酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B）,常温下孵育30min，PBS液冲洗3次，每次3分钟。 移除PBS液后，每张切片加入DAB液，显微镜下观察5分钟，20分钟后，PBS液冲洗3×3’；苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
1.5 结果判断TK1基因主要位于细胞质，阳性染色时呈棕黄色。每张切片行双盲阅片，分别又两位病理科主任医师进行，计数方法采用病理科常用的计量方法：在400倍显微镜下，随机选取10个视野，每个视野下数100个细胞，阳性细胞/肿瘤细胞总数＜5%为（-），5%-25%为（+），25%-50%（++），＞50%为（+++）。
1.6统计学分析 本文采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，TK1在前列腺癌级前列腺增生组织的表达采用Χ2检验进行分析，TK1在前列腺癌组织中的表达与临床分期及病理分级之间的关系采用Spearman相关分析，以检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1病理资料分析 患者术后所得的标本：包括活检术(采取饱和穿刺)，前列腺癌腹腔镜下根治术，均又病理科两位主任医师进行Gleason分级。G1级8例：单个的腺体大小相对一致，形成边界清楚的结节。G2级14例：单个的腺体大小相对一致，但是形成的结节周围稍微不规则，肿瘤性的腺体轻度的浸润到周围的非肿瘤性前列腺组织。G3级13例：肿瘤细胞形成单个腺体，肿瘤性腺体浸润和穿插在正常的腺体之间。腺体的大小和形状变化大，一般腺体大小比Gleason 1 级和2 级的要小。G4级11例：小的腺体融合，腺腔形成差的腺体，筛状结构的腺体，肾脏小球样的腺体，肿瘤细胞超肾样结构，前列腺导管腺癌。G5级9例：单个的肿瘤细胞或形成肿瘤细胞呈条索状生长，不形成腺腔而是成片生长的肿瘤细胞，筛状结构伴有粉刺样坏死。
2.2 TK1在前列腺癌及前列腺增生组织中的表达情况：
TK1在大部分前列腺癌组织中的细胞质中表达，54例前列腺癌组织中，（-）表达21例，（+）表达10例，（++）表达8例，（+++）表达11例，阳性表达率为61.1%（33/54）。在前列腺增生标本20例标本中，（-）为19例，（+）为1例，（++）为0例，（+++）为0例，阳性表达率为5%（1/20）。根据上述数据可见TK1在前列腺癌组中的表达明显高于在前列腺增生组中的表达，差异具有统计学意义P＜0.05,
3 讨论
虽然目前前列腺癌发病率仍以美国及欧洲最高，但近年来我国的前列腺逐步上升的趋势，因此加强对前列腺癌的发病机制、发病因素、转移机制的探索，对于我们将来在前列腺癌的诊断、治疗、预后等方面具有重要的作用。目前具体发病原因尚未确切，但由于基因生物学的快速发展，已有研究表明可能与某些基因的缺失或者突变导致前列腺癌的发生、进展及转移。虽然临床工作中上上用前列腺特异性抗原(PSA)用于前列腺癌的前期检测，但由于其有一定的局限性：如前列腺炎、BPH、尿路解释等因素皆有可能。因此，往往需要通过病理组织才确诊，导致病人错过最佳的治疗事机，导致预后不良。如何寻找一个特异性更好，准确率更高的分子标志物显得越来越重要，对我们在诊断前列腺癌、判断其预后及转移风险提供更多的参考价值。
胸苷激酶-1（Thymidine Kinase,TK1）是DNA补救合成途径的限速酶，因而能在ATP存在的情况下催化脱氧胸腺嘧啶（dT）形成单磷酸胸腺嘧（dTMP）而最早被发现。TK1基因位于17号染色体的长臂上[3]。TK1是细胞周期依赖性标志物，正常人细胞中TK1含量极低，只有当机体出现大量细胞增值是，TK1的水平才会迅速升高，尤其在恶性肿瘤中显得更加明显。目前血清TK1活性测量已用于某些肿瘤疾病[4]的诊断和各种血液系统恶性肿瘤的预后[5,6]和肿瘤增殖标记。Nisman等[7]研究表明，STK1活性值在前列腺癌血清均高于健康截止约25%的样本。
TK1在前列腺癌的表达及对预后的影响，目前国内外TK1用于前列腺癌组织中的检测比较少见，查看相关文献，我国叶方萍等[8]等检测了42前列腺癌组织发现TK1表现出与前列腺癌分期Ⅱ和分级G3 有正相关(P<0.05)。TK1标记指数与临床分期Ⅰ 和Ⅱ ,病理分级G1 和G2 表现出差异有显著性(P <0.05), TK1的标记指数与临床分期Ⅱ ～ Ⅲ 、病理分级G2 ～ G5 具有极高的一致性(P<0.05)。本实验中，TK1在大部分前列腺癌组织中的细胞质中表达，54例前列腺癌组织中，（-）表达21例，（+）表达10例，（++）表达8例，（+++）表达11例，阳性表达率为61.1%（33/54）。在前列腺增生标本20例标本中，（-）为19例，（+）为1例，（++）为0例，（+++）为0例，阳性表达率为5%（1/20）。经χ2检验存在显著差异性（P=）。可见TK1的阳性表达率与病理分级存在正相关（r=），因此TK1可推断TK1阳性表达水平与前列腺癌恶性程度呈正相关，相对来说病人预后会较差。由于部分患者资料缺失及无法完全回访实验中的54例病人生存率情况，无法根据TK1来判断患者预后。
参考文献
[1] Ferlay J,Shin HR,Bray F, et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12):2893-2917.
[2] Arner ES, Triksson S. Mammalian deoxyribonucleosid kinases[J].Pharmacology& therapeutics,1995,67(2):155-186.
[3] E.Solomon,D.Ledsetter and P.Fain. Report of the committee on the genetic constitution of chromosome 17[J.]Genome Prior.Rep.1992,1(5):473-504.
[4] Nisman B, Allweis T, Kaduri L, Maly B, Gronwitz S, Hamburger T, et al. Serum thymidine kinase 1 activity in breast cancer. Cancer Biomark. 2010;7(2):65–72.
[5] Hallek M, Wanders L, Strohmeyer S, Emmerich B. Thymidine kinase; a tumor marker with prognostic value for non-hodgkin's lymphoma and a broad range of potential clinical applications. Ann Hematol. 1992,65(1):1–5. doi: 10.1007/BF01715117.
[6]. Hallek M, Langenmayer I, Nerl C, Knauf W, Dietzfelbinger H, Adorf D, et al. Elevated serum thymidine kinase levels identify a subgroup at high risk of disease progression in early, nonsmoldering chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1999,93(5):1732–7.
[7] Nisman B, Allweis T, Kadouri L, Mali B, Hamburger T, Baras M, et al. Comparison of diagnostic and prognostic performance of two assays measuring thymidine kinase 1 activity in serum of breast cancer patients.Clin Chem Lab Med. 2013,51(2):439–47.
[8] 叶芳萍;谢清莲; 刘新玲; 郑建红; 兰竞丽; 俞敏 前列腺疾病中TK1和Ki_67的表达.临床与实验病理学杂志 2008 Dec;24(6)，664-667.
论文作者:王固新 罗云飞 戴平 陈枳恒 王新根
论文发表刊物:《医师在线》2018年3月上第5期
论文发表时间:2018/6/28
标签：前列腺癌论文; 组织论文; 腺体论文; 肿瘤论文; 病理论文; 阳性论文; 细胞论文; 《医师在线》2018年3月上第5期论文;