谭盈盈[1]2003年在《角蛋白废物微生物水解技术的研究》文中研究指明我国拥有丰富的角蛋白资源，它们大多未被充分利用，有的甚至污染环境，造成公害。采用微生物水解技术，可将其转化成很好的资源。角蛋白具有不溶于水和抗分解的性质，要将这项技术成功地应用于角蛋白废物的开发，必须找到高活性的降解菌株，建立合适的水解工艺并研创高效的水解装置。本课题针对羽毛角蛋白废物的资源化利用，进行了为期叁年的系统研究并取得了如下研究成果：1．分离了八个羽毛角蛋白的高效降解菌株。以某养殖场污水处理系统的活性污泥作为分离源，分离纯化了两株放线菌(A1和A2)，叁株真菌(F1、F2和F3)，叁株细菌(B1、B2和B3)。试验证明，这些菌株都有很高的降解羽毛角蛋白的活性，其中以A1和F1的降解活性最为突出。菌株A1和菌株F1都能以羽毛为唯一的碳源、氮源和能源生长，将其接种于经过灭菌处理的羽毛培养基中，振荡培养4～5天后可使整枝羽毛完全消失。2．鉴定了一株高效羽毛角蛋白降解菌。菌株F1能在马铃薯蔗糖培养基上生长。28℃点植培养10天，菌落直径可达3cm，菌落生长较快。菌落无味，表面粉末状，正面呈淡粉红色，背面呈紫红色。菌丝有隔膜多核，直径2～3微米。子实体结构复杂，具有帚状分枝，产生成串的分生孢子，分生孢子椭圆形，表面光滑。未见有性阶段。初步判定菌株F1属于半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、丛梗孢科、拟青霉属(Paecilomyces)。迄今为止，国内外还没有拟青霉降解羽毛的文献报道。3．试验了两个高效降解菌株(F1和A1)的生长条件(营养条件和环境条件)。在营养条件上，着重考察了钙离子和镁离子的添加效应。研究证明，两种离子对菌株F1和菌株A1的产酶及其酶活都有显着的刺激作用。在环境条件上，着重考察了溶解氧、起始pH值和温度的影响。研究证明，菌株F1和菌株A1皆为好氧性微生物；菌株F1产酶的最适pH值为9左右，最适温度为30℃；菌株A1产浙江大学环境工程硕士学位论文 摘 要酶的最适叫值为8左右，最适温度为35～40oC。 4．建立了菌株FI和菌株AI降解羽毛角蛋白的动力学方程。研究证明，这＿。＿＿＿＿＿。。。。＿＿。n＿：＿＿＿．．＿。＿＿＿＿。。，＿．Vm。。［SI。、、；＿，。。。＿两个高效菌株的降解反应可用8hgg｝＊a旧＊＊e方程 V一二上的L上L）拟合。试验求 ＿—－”Km＋［S］0得菌株FI：Vm。x二2．795gi（L＊一，Km二1．197glL；菌株AI：Vm。x二0．661gi（L＊V〕Km二0．628glL。在羽毛角蛋白浓度较高时（反应初期），宜选用菌株FI，充分利用其反应潜力大的特点；在羽毛角蛋白浓度较低时（反应后期），宜选用菌株AI，充分利用其底物亲和力大的特点。由于反应速度是决定生产成本的重要因素，选用菌株FI的经济性优于菌株AI。 5．提出了羽毛角蛋白微生物水解的新工艺。即先将收集的羽毛进行清洗，再进行加热预处理，然后采用特制反应器水解，最后从水解液中分离回收水溶蛋白，由水解残渣生产高蛋白饲料。采用该工艺，可从 Ikg羽毛回收水溶蛋白 0．11 kg，铝得高蛋白饲料0．6kg。 6．研创了高效的羽毛角蛋白微生物水解装置。借鉴垃圾堆肥和活性生物滴滤池技术，设计了羽毛沥滤床反应器。将经过加热预处理的羽毛作为“填料”，放置于羽毛沥滤床反应器的中段，让高效菌株在其中生长代谢，使无机培养液从装置顶部喷淋至“填料”上，富含水溶蛋白的水解液从底部引出。羽毛沥滤床反应器 的主要操作和效能参数为：供气量 1195．Zffi3lffi3＊，沥滤量 0．3ffi3lffi3＊，回流量6．72m3lm3·d，容积负荷6．67kglm了d，转化率40O，容积产品（可溶蛋白）产率 2．4kglm3·d o
王晶[2]2006年在《一株新的羽毛角蛋白降解菌的鉴定、研究与应用》文中研究表明角蛋白作为一种硬性蛋白，具有不溶于水和抗分解的性质，一般条件下不溶解，且不能被一般的蛋白酶水解，这给角蛋白的处理提出了难题。我国的角蛋白资源极其丰富，它们大部分没有被充分利用，有的甚至造成环境污染。而近年来畜牧业及氨基酸工业的大力发展使得蛋白资源极其紧缺，因此，当前应大力研究最有效的处理方法使废弃的羽毛角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，使之能直接得到应用或作为进一步提纯氨基酸的廉价易得的原料，从而变废为宝，既保护环境又资源利用，这将具有十分显着的经济效益和深远的社会效益。本课题针对羽毛角蛋白废弃物的资源化利用，进行了以下的研究。首先对从堆积腐烂羽毛的土壤中分离得到能高效降解羽毛角蛋白的细菌KI进行形态观察和16S rRNA测序。初步鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonas)，与嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)相似性达98％，命名为嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)。迄今为止，国内还未见寡养单胞菌(Stenotrophomonas)降解羽毛角蛋白的相关报道。通过对分离于长期堆积腐烂羽毛土壤中的嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)进行紫外诱变，在最佳照射时间90s下，经过一系列筛选方法，得到一株高效的突变菌株L4。该突变菌株接种于含有灭菌处理过的完整羽毛的基础培养基中，发酵1天后即可见羽毛有明显脱落，发酵6天后羽毛已经完全脱落，羽梗也有一定程度的毁解，降解率可达80％，比原始菌株提高了20％。发酵液蛋白质含量最大可达7.05mg／mL，酶活力最大为8U／mL，氨基酸含量最大为0.19mg／mL，这表明突变菌株L4具有较强降解羽毛角蛋白的能力。原始嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)产生的粗酶液最适作用pH为7.5，最适作用温度为40℃，在pH6.5～8.0，40℃以下酶活较稳定。突变菌株L4粗酶液的最适作用pH为7.8，最适作用温度为50℃，在pH7.0～8.0，60℃以下酶活较稳定。Ca~(2+)，Ba~(2+)，Cu~(2+)，N~a+，K~+和Mg~(2+)离子对粗酶活力有促进作用，而Hg~(2+)，Cd~(2+)，Pb~(2+)，Zn~(2+)和PMSF则对粗酶活力有抑制作用。由于其被PMSF所抑制，可认为嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)产生的角蛋白酶应属于丝氨酸蛋白酶。对粗酶液进行了SDS—PAGE电泳，测定该角蛋白酶可能为复合酶，由两个亚基构成，大小分别为141kD和119kD。初步研究了嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)降解角蛋白的机理。电镜观察到细菌紧密地生长在羽枝上，在96h左右完全降解羽毛。生物化学研究显示嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)产生具有角蛋白降解能力的胞外酶。胞外酶的角蛋白水解活性(5.5U)受到胞内二硫键还原酶的促进(16.3U)。但是，单独的角蛋白酶和二硫键还原酶在没有活的细菌存在下，都不能降解羽毛。这说明细菌附着在降解过程中起了重要的作用。这可能是由于细菌持续提供了一种还原剂破坏二硫键。此外，在羽毛降解过程中，在胞外酶中还检测到亚硫酸盐，说明亚硫酸盐解对羽毛降解也起了一定的作用。固定化技术是提高生物催化利用率、生物反应速率以及实现高效连续生产过程的有效方法。本课题研究了壳聚糖表面吸附法固定嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)进行羽毛降解。由于其具有使用寿命长，具有足够的韧性、强度和一定的生物相容性，易回收，降解效果稳定等特点，因此是值得致力研究的方向。提出了羽毛角蛋白微生物水解的工艺，并借鉴垃圾堆肥和活性生物滴滤池技术，设计了羽毛水解装置。将经过加热预处理的羽毛作为“填料”，放置于羽毛反应器的中段，让高效菌株在其中生长代谢，使无机培养液从装置顶部喷淋至“填料”上，富含水溶蛋白的水解液从底部引出。羽毛沥滤床反应器的主要操作和效能参数为：供气量1200L／d，进水量0.5L／d，循环量8L／d，转化率42％，产生可溶蛋白5.46g／L。
傅伟[3]2007年在《地衣芽孢杆菌降解羽毛角蛋白及其发酵产角蛋白酶的研究》文中研究说明畜禽类羽毛蕴含了大量潜在的有用蛋白质和氨基酸，我国羽毛角蛋白资源丰富，若合理利用可作为优质饲料蛋白。但是因为其结构稳定，极难降解，找到合适的方法是研究降解角蛋白的关键。传统物理、化学降解法存在众多缺陷，诸如效率低、耗能高、污染大，而采用微生物降解法效果显着，既利用了蛋白资源，也有利于环环境保护。同时角蛋白及角蛋白酶的应用还体现在各行各业中，有广阔的前景及较高的经济价值和社会价值。本课题主要针对羽毛蛋白的资源化利用，从菌种的确定入手，对微生物降解羽毛发酵技术和发酵工艺，以及所产的酶等进行系统研究，并建立发酵动力学模型，取得的主要研究结果如下：1．对两株都能以羽毛为唯一碳源、氮源生长的高效降解菌进行比较筛选，试验结果表明地衣芽孢杆菌ZJUQH(Bacillus licheniformis ZJUQH)能力最强。在基础培养基中加入羽毛，250ml摇瓶发酵，4d～5d后羽毛完全脱落被分解。采用扫描电镜拍摄结果显示发酵5d中整片羽毛的降解情况。2．用地衣芽孢杆菌细胞直接降解羽毛，采用正交实验设计对几个主要影响条件进行优化，结果表明：在细胞生长温度40℃，摇床转速120r／min，发酵时间48h，装液量为25ml，反应pH值为7.5，菌体细胞加量为0.5g时，发酵产酶结果最佳。而当反应pH值为7.0的时候，羽毛降解率结果最佳。前者很好的体现了正交实验设计的优化作用。并且经验证试验，酶活可达55.7U，略高于优化前最大值。3．进行各培养条件优化研究。羽毛发酵前经0.1％的氢氧化钙处理3h，能极大提高羽毛粉消化率，并对以后的微生物产酶及羽毛降解起到明显促进效果。外加碳源中低浓度葡萄糖有利于羽毛分解和角蛋白酶合成，外加氮源没有明显作用。生长因子中玉米粉提取物对菌的生长和羽毛分解有很好促进效果。金属离子中钙离子、镁离子和表面活性剂中吐温-80具有促进效果，但作用不大。采用响应面试验(BBD)设计对培养的营养组成和培养条件(葡萄糖、玉米提取物、磷酸氢二钾)进行优化，结果在最优化发酵培养基：碱处理羽毛粉(鸡毛粉)2％，葡萄糖1.45％，玉米粉提取物0.735％，磷酸氢二钾0.195％，初始pH 7.5，和最佳发酵环境条件下，37℃，180r／min，培养72h，产生的角蛋白酶活力最高达到85.8U，可溶性蛋白在96h最高可达1.13mg／ml。5d后羽毛粉降解率达84.06％。4．在5-L自控式发酵罐中，采用最优化培养基进行实验。分批发酵条件为：搅拌转速200r／min，通气量1L／min，培养温度37℃，装液系数0.6，pH值不控制，接种量5％，发酵7d结果表明放大实验酶活最高值达到61U(72h)，最终的降解率达到64.1％(168h)，可溶性蛋白含量最高可达0.8874mg／ml(108h)，均不如摇瓶，但研究结果为以后的放大深入试验提供基础。5．建立微生物降解动力学模型，地衣芽孢杆菌ZJUQH发酵产酶动力学X=46.4356／1+e~((3.8026-0.111125t))和地衣芽孢杆菌ZJUQH发酵羽毛降解动力学X(t)=(1131253.4475-8329.8338t)~(0.329965)，并对各自模型的参数进行估计，对模型作了分析和评价。6．对5-L发酵液的氨基酸进行了分析，由发酵前后的对比可知羽毛粉经发酵，原本在生羽毛粉中含量很低的必须氨基酸如：蛋氨酸、组氨酸和赖氨酸等都出现大幅度增加。同时羽毛经过水解，提高消化率，其他各营养成分也得到了改善。因此认为地衣芽孢杆菌ZJUQH发酵降解羽毛生产高营养价值的氨基酸是可行的，并可以进一步优化条件，扩大试验规模。7．由羽毛粉发酵液提取粗角蛋白酶，并分析其酶学性质。酶的最适温度为37℃，温度在35℃～45℃之间较稳定，45℃以上酶活性开始下降，50℃保温90min基本失去或性。最适pH为8.0，pH在7.5～8.5之间较稳定，pH 6.0以下或10.0以上保温90min基本失去活性。该酶受苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、铜离子、汞离子抑制，钙离子和巯基乙醇可提高酶活性。
陈丽[4]2006年在《废羽毛生物水解技术的研究》文中指出角蛋白作为一种硬性蛋白,具有不溶于水和抗分解的性质,一般条件下不溶解,且不能被一般的蛋白酶水解,因此这给角蛋白的处理提出了难题。我国的角蛋白资源极其丰富,它们大部分没有被充分利用,有的甚至造成环境污染。而近年来畜牧业及氨基酸工业的大力发展使得蛋白资源极其紧缺,因此,当前应大力研究最有效的处理方法使废弃的羽毛角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸,使之能直接得到应用或作为进一步提纯氨基酸的廉价易得的原料,从而变废为宝,即保护环境又资源利用,这将具有十分显着的经济效益和深远的社会效益。 本课题针对羽毛角蛋白废弃物的资源化利用,进行了如下的研究: 1、化学法水解羽毛角蛋白的研究 通过对水解介质浓度、固液比、反应时间、反应温度进行单因素实验,确定了化学法(酸解和碱解)水解羽毛角蛋白的最佳工艺条件并进行了最佳水解条件下的动力学分析。比较分析酸解和碱解羽毛提取复合氨基酸的效果可知,硫酸水解羽毛角蛋白的能力明显优于氢氧化钠,氨基酸转化率高出10%左右。这可能是由于氢氧化钠水解液采用活性炭脱色,活性炭在脱色过程中对产物具有一定的吸附作用,从而降低了氨基酸含量。该法存在着高能耗、高物耗的问题,且水解过程中挥发的气体易腐蚀设备污染环境,水解液的脱色也会使复合氨基酸得率降低。 2、角蛋白降解菌的分离选育及鉴定 以某长期堆积腐烂羽毛的土壤为分离源,分离得到六株能高效降解羽毛角蛋白的细菌(分别为L1、L2、L3、L4、L5、L6)。通过对这些菌株降解羽毛能力的对比实验,证明其中菌株L1降解羽毛能力最为突出。该菌株经形态观察和16S rRNA测序初步鉴定为黄单胞菌,与嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)相似性达98%,命名为黄单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)。迄今为止,国内还未见黄单胞菌降解羽毛角蛋白的相关报道。该菌株接种于含灭菌处理过的完整羽毛的基础培养基中,发酵1天后即可见羽毛有明显脱落,发酵5天后羽毛已完全脱落,羽梗也有
梁田[5]2010年在《嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ固态发酵羽毛角蛋白的研究》文中指出我国的羽毛资源极其丰富,羽毛中含有大量的角蛋白,角蛋白作为一种硬性蛋白,具有不溶于水和抗分解的性质,一般条件下不溶解,且不能被通常的蛋白酶水解,因此它们大部分没有被充分利用,有的甚至造成了环境污染。而近年来畜牧业及氨基酸工业的大力发展使得蛋白资源极其紧缺,因此研究最有效的处理方法使废弃的羽毛角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸,使之能直接得到应用或作为进一步提纯氨基酸的廉价易得的原料,从而变废为宝,既保护了环境又实现了资源利用,这将具有十分显着的经济效益和深远的社会效益。羽毛废弃物的处理利用方法有很多,但这些方法都有缺点,不适宜大规模工业生产。近年来研究表明,固态发酵法具有节水、节能的独特优势,而且没有废液产生,是一种清洁生产技术,因此,当前应大力研究微生物固态发酵羽毛角蛋白工艺以及发酵产物的利用方式,使废弃的羽毛能得到高效利用,变废为宝,既保护了环境又有利于资源利用。本课题针对羽毛角蛋白废弃物的资源化利用,进行了如下的研究：首次将东华大学环境学院筛选、分离纯化,并经过诱变处理后的嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ应用于固态发酵羽毛角蛋白工艺上,并对发酵产物进行了分析,得到了发酵产物的应用方向,同时进行了产物应用的经济性分析,研究结果如下：1、羽毛固态发酵工艺可行性研究在嗜麦芽寡养单胞菌液态发酵羽毛优化后的发酵条件下,通过改变种龄,接种量和发酵时间来对比菌株的液态发酵和固态发酵,实验结果表明在相同条件下,固态发酵羽毛工艺是可行的。2、固态发酵羽毛角蛋白工艺的优化经优化实验后得到嗜麦芽寡养单胞菌固态发酵羽毛的最佳工艺是：初始pH为7.5、培养温度为35℃、培养时间为4天、培养基组成是麸皮和干酪素,固液比是1：1.5,在该发酵条件下嗜麦芽寡养单胞菌的产酶能力及降解羽毛能力显着高于未优化发酵条件。其中,蛋白质含量达到30.72 mg/mL,粗酶液酶活力达到26.49 U/mL。这说明该菌株固态发酵羽毛角蛋白具有潜在的实际开发价值。3、发酵产物分析通过分析发酵产物,得出羽毛发酵液中氨基酸和微量元素的组分分布,以及可溶蛋白分子量分布。根据发酵液组成特点,认为合适的应用领域是通过表面吸收方式利用,如洗护用品或肥料。4、两种发酵方法的经济性分析和比较通过对固态发酵产物生产过程的成本分析,并与液态发酵条件的情况对比可知,在生产过程中,得到相同质量的发酵产物,固态发酵条件下的成本低于液态发酵条件下。同时,对于发酵产物中残留的羽毛粉,建议部分代替鱼粉或作为辅料直接加入鱼粉中,能有效的提高饲料产品质量,同时降低饲料成本。
聂康康[6]2009年在《一株高效羽毛角蛋白降解菌的分离鉴定、发酵试验及其角蛋白酶酶学性质研究》文中指出羽毛作为家禽屠宰业的副产物,每年产量巨大。羽毛的主要成分为角蛋白,其含量高达90%之多,富含有丰富的动物成长所必须的氨基酸,还含有常量元素、微量元素以及一些未知生长因子,由于角蛋白的化学结构很稳定,一般条件下不溶解,也很难被一般的蛋白酶所水解。物理化学方法处理产品,易造成产品品质低、氨基酸破坏严重、耗能高、污染高等问题,而利用生物降解角蛋白是一种较好的替代方法,不仅改善羽毛角蛋白的营养价值,还利用了环境废物。同时角蛋白及角蛋白酶在肥料、医药、化妆品等领域有较高的利用价值及广阔的发展前景。本研究采用以羽毛(或羽毛粉)为唯一碳氮源的培养基筛选高效降解羽毛角蛋白菌株,以羽毛粉的降解率为判定依据,从长期堆放死鸡的发酵池中分离到一株具有高效降解羽毛角蛋白能力的菌WHK4。根据形态学、生理生化特性和16S rRNA的比对结果,该菌株与短小芽孢杆菌相似性达99.7%,确定菌株WHK4为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),并命名为短小芽孢杆菌WHK4(Bacillus pumilus WHK4).发酵48h,羽毛粉降解率达到85.76%。以昆明小白鼠为实验动物,将培养24h,活菌数高达8.7×1013CFU/mL的细菌WHK4进行小白鼠灌胃以及由WHK4发酵60h的羽毛培养基上清液小白鼠灌胃,急性毒性试验表明,小白鼠没有死亡,群体健康；处死试验组和对照组的小白鼠,剖检观察发现试验组小白鼠肝脏、肾脏、肺脏、肠道等器官无任何病理变化,结果显示短小芽孢杆菌WHK4及发酵产物对小白鼠安全的。菌株WHK4以10%的羽毛为底物降解效率进行了优化,确定最佳发酵培养基为：羽毛100.0g/L, MgSO4·7H2O0.15g/L, NaC10.15g/L, CaCl20.005g/L, K2HPO40.09g/L KH2PO40.54g/L。最佳发酵条件：初始pH8.0,接种量6.0%,茵龄18h,发酵温度37℃,摇床转速180r/min。测定表明优化后的发酵培养基,发酵60h,羽毛降解率高达52.0%。如果用等量的羽毛粉代替羽毛,发酵60h,羽毛粉降解率可达到74.4%。在最佳培养基组成和培养条件下,对羽毛发酵进程进行研究。结果显示,发酵36h时,锥形瓶内呈现棕深色浑浊的液体。扫描电镜观察羽毛变化及羽毛降解率结果显示,羽小枝和羽毛梗是同步进行降解的,发酵24h后,羽毛结构进入明显破坏的剧烈阶段,降解率达21.5%；发酵60h时,羽小枝几乎全部脱落,羽毛梗表明出现很深的凹陷,羽毛降解率达52.0%；发酵72h时,羽毛梗出现断裂和分离现象,降解率达54.2%。发酵上清液SDS-PAGE电泳显示,随发酵时间的延长,发酵上清液中可溶性的小分子蛋白增多。发酵84h,上清液中可溶性蛋白含量最高,可达1.84mg/mL,随后浓度有下降趋势。以短小芽孢杆菌WHK4(Bacillus pumilus WHK4)为材料,进行发酵产酶。经低温离心制备粗酶液,测定角蛋白酶酶学性质；该酶的最适温度为60℃,在40℃-50℃能保持良好的热稳定性,最适pH8.0；DTT能较好的提高酶活性,而PMSF对酶活性具有很强的抑制效果。本研究为微生物发酵降解羽毛角蛋白提供了优良高效的菌株,在优质蛋白质饲料生产中具有潜在的应用前景。
谭盈盈, 郑平[7]2001年在《角蛋白的微生物降解与利用》文中研究表明本文对角蛋白、角蛋白酶、角蛋白降解菌的研究和应用状况作了系统的综述。现代化的家禽养殖产生大量角蛋白废物 (如羽毛和毛发 ) ,若加以合理利用 ,它们是一种新的蛋白质来源。多种角蛋白降解菌和角蛋白酶已被分离并得到深入研究。在强调可持续发展的今天 ,角蛋白酶的研发和角蛋白废物的利用不失为一个经济有效的环保举措
张伟[8]2010年在《产角蛋白酶微生物菌株选育及产酶发酵条件研究》文中提出我国每年产生大量的家禽羽毛和废次羊毛。家禽羽毛和废次羊毛的主要成分是角蛋白。由于角蛋白含有大量的二硫键、氢键和疏水作用的存在,不容易被普通蛋白酶水解,因而大部分未被利用,有的甚至造成环境污染。许多微生物能产生角蛋白酶。角蛋白酶可将家禽羽毛、废次羊毛降解转变为可溶蛋白质、多肽或者氨基酸,用作动物饲料,变废为宝,减少环境污染。角蛋白酶还可用于羊毛表面的整理改性,提高羊毛品质。本课题以羊毛角蛋白为底物进行了产角蛋白酶微生物菌株选育及产酶发酵条件研究。本课题以羊毛为唯一碳、氮源,从不同来源的7个土壤样品中筛选得到50株微生物菌株。经初步鉴定其中32株为放线菌,18株为细菌。再经摇瓶复筛得到一株产角蛋白酶活较高的细菌菌株FYM601,其酶活为10.1U/mL。由于筛选的野生FYM601产角蛋酶活低,达不到工业生产的要求。为了提高FYM601的酶活,采用紫外和微波2种物理诱变手段进行了诱变育种。紫外诱变效果优于微波诱变。经紫外诱变处理,筛选出了一株UV09菌株,其酶活和发酵液中可溶性蛋白含量为26.0U/mL和0.217mg/mL,分别是原始菌株的2.6倍、2.4倍。微波诱变处理,菌株MW-1产酶活力最高,其酶活14.8U/mL约为原始菌株1.5倍。因此选择UV09菌株做进一步研究。培养条件及培养基成分对菌体生长及产酶有很大影响。本课题研究了培养条件及培养基成分对UV09菌株发酵产酶及降解羊毛的影响。实验结果表明:最适培养条件为:1%羊毛,温度37℃,pH值为9.0,接种量10%,摇床转速180r/min,发酵72h。其产角蛋酶活达到了42.3U/mL,发酵液中可溶性蛋白含量达0.616mg/mL。外加碳、氮源和金属离子对UV09菌株发酵产酶有较大影响。2%葡萄糖、2%蔗糖、2%可溶性淀粉均可促进产酶,其中葡萄糖促进产酶效果最明显,UV09酶活最达49U/mL。然而乳糖的添加反而抑制了产酶。在所试验的4种无机氮源中,(NH4)2CO3(0.1%)抑制作用最大,酶活仅为对照的40%。实验添加的4种有机氮源中,0.1%酪蛋白对产酶具有极大的促进作用,酶活高达77U/mL,提高了约70%。然而,0.1%牛肉膏对产酶具强烈的抑制作用。研究还发现添加Mn2+有明显促进作用,而Mg2+、Ca2+却抑制作用显着,使产酶活力降低了约25%。
刘宝[9]2012年在《角蛋白降解菌的紫外线和硫酸二乙酯复合诱变》文中进行了进一步梳理合理加工和利用我国丰富的羽毛资源,既可以减少羽毛对环境的污染,又能为社会生产、畜牧业发展等提供蛋白质资源。用微生物降解羽毛角蛋白的方法既经济又环保,近来受到人们广泛地关注。目前发现的可降解羽毛角蛋白的微生物中细菌种类最多,尤以芽孢杆菌最多,但是现在发现的大多数菌种的酶活力不高,离工业应用要求还有不少的差距。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种,具有速度快、收效大、方法简单等优点,是实验室研究及工业生产中最常采用的优良菌株选育方式。由于紫外线(ultraviolet ray, UV)和微波诱变设备成本低,实验操作简单,常用作实验室诱变育种。烷化剂是芽孢杆菌诱变育种中最常使用的诱变剂,而硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)又是最常用的烷化剂之一。诱变育种时一种诱变方法往往难以达到预期目的,可以采用使诱变方法之间具有协同作用的复合诱变。通过对紫外线、微波和DES诱变条件分别进行研究,得到了对NJQ3细菌最佳的诱变条件。原菌株在37℃、180r·min-1恒温摇床中培养8～12h后,制成菌悬液,紫外诱变时间为2min; DES最佳诱变条件为DES浓度1.5μL/mL,诱变时间为5min;而微波辐射试验中,采用低温热分散法,间断累积诱变时间1～8min,致死率在60%以下,因此并不适合作为NJQ3的诱变选育方法。诱变后的菌株以角蛋白培养基降解圈为初筛条件,发酵液的可溶性蛋白含量和降解率为复筛条件,经过筛选后紫外诱变筛选出4个菌株,但是传代叁次后均失去了正突变性状；DES诱变后筛选出5个菌株,其中D3在传代叁次后仍然具有正突变性状,而微波诱变没有得到正突变菌株。用紫外线和DES复合诱变菌株NJQ3,方法为紫外诱变2min,在37℃、180r·min-1恒温摇床中培养12小时后制成茵悬液,DES浓度1.5μL/mL,诱变5min。经过角蛋白培养基降解圈、可溶性蛋白含量和降解率叁个指标的筛选,得到一个能够稳定传代10代以上的变异菌株YB5。YB5的降解圈角蛋白培养基直径为1.20cm,比原菌株提高了37.08%；可溶性蛋白含量3.84mg/L,提高了160.23%；降解率49.2%,提高了9.82%。
鲁丹[10]2009年在《5L发酵罐中羽毛发酵工艺探索及其产物应用研究》文中研究表明我国的羽毛资源极其丰富,但是没被充分利用,有的甚至造成环境污染。与常规的羽毛处理方法相比,微生物法有突出的优点,而目前微生物法处理羽毛大多停留在菌种分离及角蛋白酶提纯上,并未将发酵工艺放大,关于羽毛发酵产物的应用,更是鲜见报导。因此,当前应大力研究微生物法处理羽毛的放大发酵工艺以及发酵产物的利用方式,使废弃的羽毛能得到高效利用,变废为宝,既保护环境又资源利用。本课题针对羽毛废弃物的资源化,进行了多方面的研究。首次将东华大学环境学院筛选、分离纯化,并经过诱变处理后的嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ发酵羽毛工艺放大,并根据对产物的分析结果分别将发酵产物应用于护发和植物叶面肥,效果显着,具体工作如下:1、羽毛发酵工艺研究得到嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ的最佳发酵培养基和最适发酵工艺。发现在发酵培养基中省去外加碳、氮源可以大大降低成本,简化操作步骤,且降解效果几乎不变;发酵罐在最适发酵工艺下DHHJ菌株对羽毛角蛋白的降解程度优于摇瓶,发酵时间缩短了1天,产量提高了2～3倍;同时根据发酵条件记录进行分析,推测代谢过程中产物形成的动力学模型属于部分偶联型。2、固定化工艺及发酵条件优化实验得到以壳聚糖为原料的DHHJ菌株最佳固定化条件和固定化发酵条件。在该发酵条件下固定化菌株DHHJ能持续高效的降解羽毛角蛋白。且壳聚糖小球具有一定的生物相容性,较高的机械强度和韧性,能连续多次使用,且回收方便,不易污染环境,因此认为用固定化嗜麦芽窄食单胞菌DHHJ在连续发酵装置中进行发酵是可行的。为实现连续发酵工艺,课题提出合适的发酵罐将是在流化床的基础上增加经改良的搅拌器,使反应均匀的同时减轻搅拌对固定化载体的破坏,而且进料途径改为顶部喷淋式,可提高羽毛底物的利用率。3、发酵罐中发酵产物分析通过分析发酵产物,得出羽毛发酵液中氨基酸和微量元素的组分分布,以及可溶蛋白分子量分布。和前人所做结果比较,猜测菌株DHHJ与羽毛利用相关的酶系统。根据发酵液组成特点,认为合适的应用领域是通过表面吸收方式利用,如洗护用品或肥料。4、发酵产物应用及经济性分析将羽毛发酵液应用于护发,发现其具有其他化学合成的护发素、定型剂和防晒剂无法比拟的优点,头发对发酵液有较好的吸附性。发酵液能在头发表面形成透明薄膜,有效修复受损头发,使之光滑有弹性。此外,经发酵液处理的头发定型效果更持久,还能抵抗紫外线。从经济上分析,因为原料价格相对较低,因此具有可观的经济开发价值。除此之外,羽毛发酵液适当稀释后作为植物叶面肥,能明显促进植物生长。发酵液中的复合氨基酸不仅能作为营养物质,同时还是很好的螯合剂,且由于发酵液中表面活性剂的存在,使其在使用效果上优于一般的氨基酸叶面肥。但植物叶面肥的应用领域决定其市场定价不高,用微生物法处理的羽毛发酵液用作植物叶面肥目前稍显浪费。
参考文献：
[1]. 角蛋白废物微生物水解技术的研究[D]. 谭盈盈. 浙江大学. 2003
[2]. 一株新的羽毛角蛋白降解菌的鉴定、研究与应用[D]. 王晶. 东华大学. 2006
[3]. 地衣芽孢杆菌降解羽毛角蛋白及其发酵产角蛋白酶的研究[D]. 傅伟. 浙江大学. 2007
[4]. 废羽毛生物水解技术的研究[D]. 陈丽. 东华大学. 2006
[5]. 嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ固态发酵羽毛角蛋白的研究[D]. 梁田. 东华大学. 2010
[6]. 一株高效羽毛角蛋白降解菌的分离鉴定、发酵试验及其角蛋白酶酶学性质研究[D]. 聂康康. 南京农业大学. 2009
[7]. 角蛋白的微生物降解与利用[J]. 谭盈盈, 郑平. 中国沼气. 2001
[8]. 产角蛋白酶微生物菌株选育及产酶发酵条件研究[D]. 张伟. 河北科技大学. 2010
[9]. 角蛋白降解菌的紫外线和硫酸二乙酯复合诱变[D]. 刘宝. 南京农业大学. 2012
[10]. 5L发酵罐中羽毛发酵工艺探索及其产物应用研究[D]. 鲁丹. 东华大学. 2009