曾东方[1]2000年在《腐生与共生食用菌菌丝体分离、培养及其DNA鉴定研究》文中研究说明无论是食用菌的人工栽培，还是珍贵野生蘑菇的驯化研究，都需要制备菌种并对菌种的真伪进行鉴定，其中最可靠的鉴定方法是诱导纯培养菌种产生赖以识别的子实体。常见食用菌如香菇、平菇的菌种，均可用出菇试验鉴定真伪，但费工费时。尚未驯化的珍贵食用菌如松口蘑、美味牛肝菌等，目前无法诱导人工纯培养菌种出菇，亟待寻找新的可靠办法鉴定分离菌株的真伪。本文首先采用随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polyrnorphic DNA，RAPD)指纹比对技术，对香菇Lentinulaedodes(Berk)Pegler、平菇Pleurotus ostreatus(Jacq：Fr)Quel的分离菌种进行DNA鉴定，取得了和出菇试验一致的鉴定结果。然后进一步采用DNA指纹比对技术，对著名的野生共生食用菌松口蘑Tricholoma matsutake(S.Ito et Imai)Sing、牛肝菌Suillus granulatus(Fr)Kuntze、大红菇Russula rubra(Krom)Bres．等的各种人工分离菌株进行了DNA鉴定，并对它们的菌丝体分离，培养方法进行了探讨。现将研究结果摘要报告如下： 1．香菇分离菌株的DNA鉴定。首先利用常规组织分离方法取得了不同来源香菇子实体的菌丝体纯培养，然后利用代料栽培方法进行出菇试验肯定了分离菌株的真实性。接着以12个随机引物介导RAPD-PCR试验，对香菇子实体不同组织与分离菌株进行DNA指纹比对，发现相同子实体的不同组织即菌盖、菌褶、菌柄，都具有相同的DNA指纹图谱，证明一个子实体内遗传物质DNA的同质性(homogeneity)。从子实体组织分离获得的菌丝体菌株与其来源子实体的不同组织，全部具有相同的DNA指纹图谱，显示了分离菌株与子实体是相同的基因克隆产物，明确判定分离菌株是香菇菌丝体纯培养物。试验结果还表明：人工栽培产生的子实体及其组织分离菌丝体，与所用栽培菌种茵丝体及其种源子实体，都具有一致的RAPD指纹图谱：而不同来源的子实体之间的DNA相似系数在0.886～0.986之间。 2．平菇分离菌株的DNA鉴定。试验从不同栽培场所采集到白色、灰色与黑色不同颜色的平菇子实体，分别取菌柄进行组织分离，均获得了菌丝体分离菌株。采用12个RAPD随机引物介导PCR试验，对获得的所有DNA指纹图谱进行比对分，东方博士论文:腐生与共生食用菌菌丝体分离、培养及其ONA鉴定研究析，发现不同颜色的平菇子实体之间存在着DNA差异，统计分析表明不同来源平菇的遗传相似系数在0.779~0.976之间，其中两个灰色平菇在0.976相似水平上聚类，而与白色平菇在0.955水平上聚类，再与黑色平菇在0.779水平上聚类.试验还表明，不同颜色的平菇都具有相同的遗传规律，即一个相同的平菇子实体上的不同组织，包括菌盖、菌褶、菌柄，均具有相同的DNA指纹图谱.试验组织分离的菌丝体依次与其来源子实体的DNA指纹图谱对应相同，依此判定平菇分离菌株是平菇菌丝体纯培养物. 3.珍稀共生食用菌松口蘑植被调查研究。试验对我国东北长白山的余脉，吉林省龙井市内的一座松茸山进行了植被调查，分类记载植物38科74种，大型真菌8科巧种，共计46科89种。除了常见的赤松(尸inusde胭必ra)、蒙古栋(Que兀esm口吧口lica)、胡枝子(众印‘beza bicolor)、兴安杜鹃(Rhododen动侧nc加”anthum)等外，另外以前并未报道的22种植物，3种高等真菌也在松茸蘑菇圈附近出现频率很高，例如被当地菇农称为松茸花的山萝花(Mela州眨”似脚roseum)，与松茸同期发生的蘑菇如密丛枝(R amaria stricta)、粘柄丝膜菌(cortinari。。口llinitus)等. 4.野生松口蘑DNA多态性研究。利用RAPD分析技术研究了我国主产区野生松口蘑的DNA指纹图谱.从40个随机引物中筛选到18个扩增效果好，重复性稳定的引物以介导不同来源的20个松茸子实体DNA的扩增，得到了它们清晰可辨的DNA指纹。分子数据分析把供试松茸在72%相似水平上聚成一类，支持云南、四川、吉林的松茸是一个相同物种的结论。鉴于目前松茸菌丝体分离培养困难，制备松茸子实体的DNA指纹图谱，为鉴定不同生境下获得的组织分离物之真伪提供了遗传依据。 5.松口蘑菌丝体分离培养。试验采用8种培养基配方，对9个松口蘑子实体的不同部位进行组织分离，计接种试管810支。结果从菌褶部位获得94支慢生型的菌丝体分离菌株，从菌柄部位仅获得1支快生型的分离菌株.除51支试管污染细菌型菌落、8支试管污染霉菌以外，其余656支各种培养基的试管未长任何微生物菌落。试验结果表明，松茸菌丝体分离的适宜组织部位是新鲜松口蘑的菌褶，而以前报道的菌柄并不适合作为菌丝体分离。在供试8种培养基中，以马铃薯葡萄糖土壤滤液培养基(PDAS)为最适用，对菌褶进行组织分离的成功率达74.4%。另外，马铃薯葡萄糖麦数滤汁培养基(PDAW)、BM培养基、PDA培养基也从菌褶2曾东方博士论文:腐生与共生食用菌菌丝体分离、培养及其DNA鉴定研究分离到松茸菌丝体，分离成功率依次是35.5%、巧.6%和8.9%。试验还对松茸菌根、带菌丝土壤进行了分离，结果很容易获得各种快生型的丝状真菌，因此认为菌根、土壤并不适合分离松口蘑菌丝体。 6.松口蘑分离菌株的DNA鉴定。试验以9个吉林松口蘑子实
曾东方, 罗信昌[2]2001年在《应用RAPD分析快速鉴定外生菌根蘑菇分离物的真伪》文中认为采用DNA指纹比较技术对部分外生菌根蘑菇分离菌株的真伪进行了鉴定 ,结果表明 :不同来源的点柄乳牛肝菌Suillusgranulatus子实体之间的DNA相似系数为 0 93 9,但各菌丝体分离菌株与其来源子实体的DNA相似系数为 1 0 0 0 ,每个供试引物获得的RAPD指纹图谱全部对应相同 ,证实分离物为真正的牛肝菌分离菌株。试验还鉴定与子实体DNA具极高同源性的细裂硬皮马勃Sclerodemaareolatum的组织分离菌丝体是真正的分离菌株。供试大红菇Russularubra分离培养物与供试子实体之间存在很大的DNA异质性 ,因此判定该分离物为杂菌或其它生物体分离物 ,并非大红菇的分离菌株。试验结果显示 :RAPD指纹技术是外生菌根蘑菇分离物真伪鉴定的一种快速可靠的方法。文章就RAPD鉴定共生真菌分离菌株的可靠性与技术范围进行了讨论
林晓民[3]2004年在《大型真菌的生态多样性及分子鉴定》文中指出本研究包括大型真菌的生态多样性调查和菌丝体的分子鉴定两部分，现分述摘要如下： （一）大型真菌的生态多样性调查 调查了 422 种大型真菌的生境、生态，按生态习性将这 422 种大型真菌分为 12 个生态类型，即土壤腐生菌、木腐菌、落叶及腐草生菌、粪生菌、植物寄生菌、昆虫寄生菌、真菌寄生菌、地衣型真菌、外生菌根菌、昆虫共生菌、天麻共生菌和真菌共生菌。结合 94 幅典型照片对中国大型真菌的生态多样做了初步阐述，并对大型真菌生态多样性的研究方法进行了讨论。 （二）大型真菌菌丝体的分子鉴定 大型真菌的菌种一般都是菌丝体，而传统的真菌种类鉴定主要是依据子实体的特征，菌丝体不能直接用于种类鉴定。对于能用人工培养方法生产子实体的种类，可通过出菇试验对菌种进行种类鉴定，但这种鉴定方法花费的时间较长，往往需要一个月以上甚至一年的时间。对于尚不能用人工培养方法生产子实体的种类，则不能用这种常规方法进行菌种鉴定。分子鉴定技术可以对菌丝体进行种类鉴定，但过去文献上报道的大型真菌分子鉴定多是采用RAPD和ITS-RFLP等方法，这些方法除了精确性与重复性较差外，还需要以同种真菌的子实体作对照，不同条件下的研究结果缺乏可比性。 本研究是基于 rDNA ITS 区段的 DNA 序列对菌丝体进行物种鉴定，其方法是先扩增出待鉴定真菌 rDNA ITS 区段的 DNA，并测出其序列，然后与互联网上 DNA 序列数据库中的信息资源进行比较，从而得出物种鉴定的结论。 运用该方法首先对出菇试验证实了的 3 种栽培食用菌（桃红侧耳、白阿魏侧耳和杏鲍菇）的菌种进行了物种鉴定，分子鉴定结果与出菇试验的鉴定结果相一致，证明这种分子鉴定方法是切实可行的，鉴定结果是可靠的。然后进一步用该方法对分离自 6 种外生菌根菌子实体的菌株进行了分子鉴定，结果表明：分离自松口蘑（Tricholomamatsutake）子实体的 1 个菌株被证实为真正的松口蘑菌种，分离自其它 5 种外生菌根菌子实体的菌丝体均被证明不是原分离子实体所属物种的菌种。其中分离自褐环乳牛肝菌[Suillus luteus (L.:Fr.)Gray]子实体的 1 个菌株被证实是裂褶菌（S. commune），该分子鉴定结果进一步得到了出菇试验的支持；分离自干巴菌（Telephore ganbajun）子实体的 1 个菌株被证实为一种镰刀菌（Fusarium sp.），该分子鉴定结果进一步得到了形态鉴定的支持；分别分离自厚环乳牛肝菌[Suillus grevillei (Klotzsch.)Sing.]和玫红铆钉菇[G. roseus （Fr.）Karst.] 子实体的 2 个菌株经分子鉴定它们 ITS 区段的 DNA 序列完全相同，该 DNA 序列与互联网上 DNA 序列数据库中一种内生真菌（Endophytic fungi ）的相应序列具有高度的同源性 [96.61% （599/620）]，该内生<WP=7>ii 大型真菌的生态多样性及分子鉴定真菌分离自我国台湾的珍稀植物南方红豆杉（Taxus mairei），属于一种未鉴定出种类的担子菌；分离自污白疣柄牛肝菌[Leccinum holopus (Rostk. ) Watl.]子实体的 1 个菌株的 ITS 区段 DNA 序列与互联网上序列数据库中的所有 DNA 序列同源性均较低，最高同源性约为 78%，这些同源序列均属于子囊菌。 此外，以茯苓基因组 DNA 为模版，用通用引物 ITS1/ITS4 能扩增出了一条约 1700bp的特异性 DNA 片段，经 PCR 产物直接测序，测出了 2 条具有茯苓物种特异性的 DNA 序列，这两方面的 DNA 分子特征可作为茯苓物种鉴定的分子依据。
佟丽华[4]2006年在《乳牛肝菌菌种的分离、鉴定及培养》文中认为牛肝菌是森林生态系统中的重要生物类群之一，菌丝体与植物根系结合形成菌根，使植物生长成为可能，使不同种类植物的根系联在一起，有助于提高森林生态系统中植物的多样性、稳定性和生产力，增加植物-土壤间的联系，改善土壤结构，促进土壤微生物生长，增强植物器官的功能，促进造林或育苗成活与生长。牛肝菌中的许多种类是分布极广的具有经济价值的著名药食两用真菌，具有很高的营养价值和独特的药用价值。开展牛肝菌子实体的诱导和栽培研究是国内外微生物和食用菌研究人员十分关注的研究课题。牛肝菌人工驯化栽培的关键是批量生产纯菌种，其难点是难以获得纯菌种以及菌种生长速度缓慢。基于此，本文对乳牛肝菌的子实体进行了菌种分离和分子鉴定，并研究了菌种培养、发酵液产酶情况以及乳牛肝菌子实体内部及附生微生物的多样性。主要研究内容如下： 1．乳牛肝菌菌种的分离及鉴定：采用组织分离法从乳牛肝菌子实体分离得到纯培养菌丝体，由于乳牛肝菌是外生菌根菌，无法人工栽培，而传统的形态学方法难以鉴定其真伪，故采用ITS序列分析方法对其进行分子鉴定，同时构建进化树，初步分析乳牛肝菌的系统发育关系。 2．乳牛肝菌菌种的培养：对牛肝菌母种培养基进行筛选试验，开展液体和固体培养研究。结果表明：牛肝菌母种在葡萄糖蛋白胨培养基基上生长最好，可用此培养基进行乳牛肝菌的液体发酵；对多种固体培养基的培养比较实验表明，乳牛肝菌在麦粒培养基上生长最好，在甘蔗渣培养基上长势次之，而在其它几种培养基上未生长。 3．乳牛肝菌液体培养的胞外酶活性研究：测定了乳牛肝菌液体培养时的胞外酶活性，并同时与几种白腐真菌的胞外酶活性作对比。结果表明乳牛肝菌在整个培养过程中不产纤维素酶、半纤维素酶和漆酶，而这几种酶都存在于几种白腐真菌树舌、金针菇和灵芝中。 4．乳牛肝菌内生及附生微生物多样性研究：用玻璃粉吸附法提取出乳牛肝菌、美味牛肝菌和硬皮马勃子实体及根际土壤的总DNA，并以此为模板，对16srRNA基因V_3区和18s RNA基因的ITS区进行PCR扩增，用DGGE技术对PCR产物进行分离，从而得到数目不同且分离的电泳条带。结果说明三种外生菌根菌子实体及根际微生物类群略有不同，乳牛肝菌根际土壤真菌种类较为丰富一些。 综合以上结果，作者认为乳牛肝菌菌种分离困难及生长缓慢的原因与其胞外降解酶活性低及子实体含有内生或附生微生物有关。
参考文献：
[1]. 腐生与共生食用菌菌丝体分离、培养及其DNA鉴定研究[D]. 曾东方. 华中农业大学. 2000
[2]. 应用RAPD分析快速鉴定外生菌根蘑菇分离物的真伪[J]. 曾东方, 罗信昌. 林业科学. 2001
[3]. 大型真菌的生态多样性及分子鉴定[D]. 林晓民. 西北农林科技大学. 2004
[4]. 乳牛肝菌菌种的分离、鉴定及培养[D]. 佟丽华. 南京师范大学. 2006