贾伟章[1]2007年在《乌鳢免疫相关基因的克隆鉴定与特征分析》文中研究指明鱼类具备两种基本的免疫应答类型:先天性免疫应答和适应性免疫应答。头肾主要由网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成,包括淋巴细胞、单核细胞、浆细胞、两种或叁种的粒细胞以及巨噬细胞等,担负着机体特异性和非特异性免疫反应,在个体发育过程中可能为免疫系统的生发中心。为了解乌鳢在病原刺激后的免疫反应,以及为鱼类分子免疫学研究提供一定的科学依据,本研究以poly I:C体内诱导乌鳢为测试组,对照鱼为驱动组,通过抑制差减杂交构建富含诱导后差异表达基因的乌鳢头肾差减cDNA文库。利用PCR和斑点杂交筛选文库,揭示了一批与哺乳类IFN系统基因同源,参与干扰素信号转导和转录调控的相关基因,如信号转导和转录激活因子(STAT)、干扰素调控因子(IRF),IFN刺激基因(IFN stimulated gene, ISG)或抗病毒基因,如Viperin、ISG15和ISG12,以及其他的免疫相关基因包括鼠李糖凝集素(RBL)、组织相容性抗原复合物(MHC I)、免疫球蛋白重链和轻链(IgM和IgL)、热休克蛋白70(HSP70),受体激活蛋白C(RACK)等。通过RACE扩增的方法获得乌鳢STAT1、IRF1、Viperin、ISG15 cDNA全长。在此基础上,根据乌鳢IRF1以及已知IRF2和IRF7同源分子,设计位于开放阅读框保守位置的IRF2和IRF7兼并引物,扩增IRF2和IRF7片段。进而完成了叁个干扰素调控因子cDNA和基因组克隆。分析叁种鱼类干扰素调控因子的基因结构,并与人类IRF1、IRF2和IRF7基因进行了比较基因组学研究,发现IRF1和IRF2基因在进化上具有高度的保守性,外显子和内含子的组织模式在乌鳢和人基本一致,并且IRF1和IRF2基因之间也存在进化的保守性,尤其DNA结合区的外显子区段;乌鳢IRF7 5′端非编码区未出现内含子,这使该基因的组织模式与人IRF7显着不同。同时检测了叁种IRF的组织分布,并且证实这些基因在脾脏和肝脏中能够被poly I:C诱导表达。为了解干扰素调控因子表达的分子基础,通过基因步移的方法,获得乌鳢叁个干扰素调控因子的启动子序列。分析乌鳢干扰素调控因子启动子区的目的是寻找可能的转录因子结合位点,了解IRFs的表达调控,以及干扰素调控因子能够被病毒和双链RNA诱导表达的分子机理。此外,通过基因步移的方法,我们还获得了STAT1、Viperin和ISG15的启动子序列,鉴定了两种干扰素刺激基因,并比较了这两种干扰素刺激基因的启动子区特征。我们发现在Viperin和ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反应元件(ISRE)和γ-干扰素激活序列(GAS)。此外,Viperin启动子区包含保守的NF-κB结合位点,这是保守的NF-κB结合位点以一致的序列模式(GGGRNNYYCC)出现在鱼类干扰素刺激基因启动子区的首次报道。通过分析乌鳢STAT1和IRF7启动子序列特征,表明鱼类存在类似哺乳动物信号反馈的传导通路调控细胞对干扰素信号的反应。这为研究干扰素系统基因的调控奠定了基础。在此基础上,我们讨论了干扰素调控因子在调控免疫相关基因和病毒或干扰素介导的信号传导通路中潜在的角色。从低等脊椎动物到高等脊椎动物,鱼类和哺乳类干扰素和抗病毒蛋白呈现不同水平的差异,这从一定程度上反映了它们在不同生境中遭遇不同病原的选择压力。然而,根据我们的结果来看,不仅干扰素信号通路成员是保守的,而且干扰素调控因子和干扰素刺激基因的调控方式均与哺乳动物类似。此外,用RACE-PCR扩增的方法克隆到MHC I类分子,免疫球蛋白重链和轻链,RBL等全长cDNA序列。通过基因步移的方法获得RBL基因全长及其启动子序列。检测了STAT1、Viperin、ISG15、MHC I和RBL基因在各组织中的表达情况,同时还检测了poly I:C诱导后Viperin和ISG15在肝脏中的诱导表达。在差减杂交和同源PCR的基础上,通过RACE和基因步移,我们克隆并鉴定了STAT1、IRF1、IRF2、IRF7、Viperin、ISG15,以及其他免疫相关基因。着重对干扰素系统几个基因的结构特征、表达特性、诱导机制、分子进化等进行了比较研究,初步揭示出鱼类存在复杂的调控网络介导IFN系统基因的表达。乌鳢免疫相关基因的研究工作对了解鱼类免疫机制以及鱼类抗病药物的开发具有重要的理论指导意义。
贺亚军[2]2008年在《优质棉纤维发育品质相关基因的分离、克隆、鉴定与定位》文中研究表明棉花是世界重要的经济作物之一。棉纤维是棉子上的一种表皮毛,也是重要的经济价值之所在,是纺织工业的原料。优良的纤维品质是世界棉花育种的主要目标之一。因此,从分子水平阐明棉纤维发育的机理,具有重要的理论价值与现实意义。本研究的目的即利用基因芯片方法筛选与棉纤维品质相关的EST,并分离和鉴定部分棉纤维发育相关基因,这些研究将有助于我们进一步探讨形成优质纤维的分子机理。构建高强纤维种质系7235开花后5-25天棉纤维伸长、次生壁加厚期间的cDNA文库,随机大规模测序,获得1436条EST,制成基因芯片。提取7235和纤维品质一般的陆地棉遗传标准系TM-1不同发育时期的mRNA与之杂交,筛选到31条差异表达EST,主要是参与代谢、次级代谢、胁迫与抗逆、转录等相关基因。通过RT-PCR验证,23条差异表达EST与基因芯片实验结果一致。为了进一步定位这些差异表达EST并分析其与纤维品质性状的相关性,我们分析了所有差异表达EST在7235与TM-1间的多态性。结果表明,叁条EST在7235与TM-1间存在多态。利用(7235×TM-1)RIL群体,对这叁条EST进行染色体定位及单标记分析,结果表明,两条EST(分别编码LTP基因与ADH基因)与纤维品质性状极显着相关。由于大部分基因在7235与TM-1间不存在差异,所以,我们利用[(TM-1×Hai 7124)×TM-1]群体对其进行定位。结果表明,13条差异表达EST被定位到四倍体棉花遗传图谱的相应染色体上,其中8条EST定位在品质相关QTL区间或附近。通过基因芯片技术,我们鉴定了一条可能编码谷氨酰胺合成酶的EST。Northern杂交验证了该基因在7235与TM-1开花后8天的胚珠和纤维中表达有显着差异。随后,利用7235纤维cDNA文库测序,结合5′RACE技术从7235纤维中获得了全长谷氨酰胺合成酶基因。序列分析结果表明,该基因与已报道的其他植物的细胞质谷氨酰胺合成酶(GS1)基因具有较高氨基酸序列同源性,命名为GhGS。Southern blot分析结果表明,GhGS在陆地棉基因组的A、D亚基因组可能各存在一个拷贝。之后,从不同材料7235、TM-1、非洲棉、雷蒙德氏棉基因组中分离到GhGS基因序列。根据7235与TM-1基因组GhGS序列的SNP,将该基因在(7235×TM-1)RIL群体中进行定位并分析基因与纤维表型的相关性,结果发现,GhGS与纤维强度存在相关,但由于该RIL图谱上的位点较少,GhGS基因不能整合到该图谱上。随后,利用[(TM-1×Hai 7124)×TM-1]群体,将GhGS基因定位在四倍体棉花遗传图谱的D7染色体上。另外,我们测定了棉纤维发育不同时期胚珠和纤维的GS活力和总蛋白含量。测定结果表明,在开花后5天和8天的7235胚珠GS活力显着高于TM-1相应时期的胚珠GS活力。同时发现,开花后11天的7235胚珠总蛋白含量和胚珠重量都显着高于同时期TM-1胚珠总蛋白含量和重量。这一结果暗示GS可能通过提供N而促使棉花种子的形成。而在纤维中的测定结果表明,在7235中GS活力和总蛋白含量都低于TM-1中的GS活力和总蛋白含量。这一结果暗示GS在胚珠和纤维中行使的功能可能并不完全相同。GS在纤维发育过程中的可能功能还需进一步探讨。另一个克隆的基因为脂肪酶基因。通过对7235纤维cDNA文库测序,获得一个可能编码脂肪酶的cDNA片段。随后,利用RACE技术获得该cDNA全长并命名为GhLipase。序列分析结果表明,GhLipase全长1286bp,包含一个编码368个氨基酸的开放读码框。BLAST分析表明,它与已报道的其他植物的脂肪酶基因具有较高的氨基酸序列同源性。从表达特征看,GhLipase在胚珠和纤维细胞优势表达,而且在开花后5-17天的纤维中表达水平较高。Southern blot结果表明,GhLipase基因在陆地棉基因组中可能存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A13染色体上。第叁个利用7235cDNA文库分离的基因为木聚糖水解酶基因。该cDNA全长1790bp,ORF编码560个氨基酸。CDS分析表明,GhXyl基因推导的氨基酸含有糖基水解酶家族10的保守区域,具有典型的糖基水解酶家族10基因结构,BLAST结果表明其与来源于其他植物的木聚糖水解酶有较高的同源性,命名为GhXyl基因。RT-PCR和Northern blot分析结果表明,GhXyl属纤维细胞优势表达,且在开花后5-8天的纤维中表达水平最高。Southern杂交结果表明木聚糖水解酶基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A3染色体上。本研究利用7235纤维cDNA文库,还分离到六个小分子质量的热激蛋白基因,分别命名为LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3、LMWHSP4、LMWHSP5、LMWHSP6。分析它们的序列结构,发现它们分别属于叁种不同类型的小热激蛋白,LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP4、LMWHSP6都与细胞质Ⅰ类热激蛋白序列同源性较高,而LMWHSP3与细胞质Ⅱ类热激蛋白序列同源性较高,LMWHSP5与线粒体热激蛋白序列同源性较高。对这六个小分子质量热激蛋白基因进行转录表达分析,结果表明,它们在棉花体内具有不同的表达特征,LMWHSP2是组成型表达的基因,LMWHSP 1、LMWHSP 4、LMWHSP5、LMWHSP6都在开花当天的胚珠中表达量最高,而LMWHSP3在棉花叶片中优势表达。这一结果暗示,线粒体小热激蛋白和细胞质Ⅰ类小热激蛋白基因可能受纤维启始和分化的调控,而细胞质Ⅱ类小热激蛋白与棉花叶片的生长发育相关。利用本实验室的四倍体棉花遗传图谱,对这六个小热激蛋白基因进行定位,其中叁个基因LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3分别被定位在A4、D8和A6染色体上。
林玉玲[3]2011年在《龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究》文中研究指明龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是我国南方重要的热带亚热带木本果树,其胚胎发育状况与其果实的产量及品质密切相关。植物胚胎的发育是一个细胞分化的过程,该过程中必然有氧化胁迫的影响,而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)作为抗氧化系统的第一道防线在植物胚胎的细胞分化和发育过程中起着重要作用。本研究利用龙眼体胚发生模式实验系统,在进行龙眼体胚发生过程SOD的生理生化研究的基础上,进一步进行SOD基因家族克隆及表达调控机制研究(启动子分离与功能鉴定、miRNA分离与鉴定以及相关基因和miRNA定量表达分析等),以探讨在龙眼体胚发生中SOD的作用的分子机制,并为龙眼活体胚胎发育中的SOD作用机制提供参考。主要结果如下:1.龙眼体胚发生过程中SOD酶活性变化及同工酶分析在本研究中首先对龙眼活体晚期胚胎和早期离体胚胎中的SOD活性及同工酶谱进行了初步分析。结果发现,不管是龙眼晚期活体胚胎或早期离体胚胎,随着龙眼胚胎的进一步发育,SOD的活性均呈逐渐升高趋势,说明SOD对胚性细胞的分化以及晚期胚胎发育具有促进作用。温度处理对龙眼体胚发生早期SOD活性影响较小,而对SOD同工酶谱影响较大,表现为谱带的出现与消失,其中25℃处理的龙眼胚性培养物,SOD同工酶谱条带数最多,而20℃和30℃处理的材料,表达较弱的酶谱条带消失。提示SOD活性与同工酶谱的规律变化与龙眼体胚发生早期细胞分化、超氧自由基的清除以及促使体胚正常发育有密切关系。2.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族cDNA和DNA全长的获得在酶活性测定的基础上,利用RT-PCR和RACE法从龙眼胚性愈伤组织中获得SOD基因家族20个不同mRNA转录本,它们分别编码细胞质DlCSD1a和DlCSD1b、叶绿体DlCSD2a、叶绿体DlFSD1a、DlFSD1b及线粒体DlMSD等,这是木本植物SOD首次克隆较为完整的,也是植物体胚SOD基因分离较为完整的;SOD基因家族各成员的3’UTR序列的长度都具有多态性,可能与miRNA的转录后水平调控相关;此外,还获得了DlCSD1a-4、DlCSD1a-5、DlCSD1b- variant1和DlFSD1b-variant1~ DlFSD1b-variant4等7个不同的可变剪接体,它们发生剪接的位置不尽相同,并存在各自不同的剪接模式。DlCSD1a基因基因组序列长2741 bp,含8个内含子;DlCSD1b基因长4592 bp,含6个内含子;DlCSD2a基因长3727 bp,含7个内含子;DlFSD1a基因长2171 bp,含6个内含子;DlFSD1b基因长2137 bp,含7个内含子;DlMSD基因长1589 bp,含5个内含子;所有内含子的剪切位点均符真核生物GT-AG规则。不同基因所含内含子和外显子的长度不一,其中DlCSD1b的第5个内含子、DlCSD2a的第6个内含子的长度较长,分别为3539 bp和2178 bp,长内含子的存在可能有利于产生多种mRNA分子,编码出多种功能的蛋白质。3.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族生物信息学分析根据生物信息学分析结果,龙眼胚性愈伤组织DlSODs编码的蛋白质不同成员均含有SOD典型的保守结构域,属于超氧化物歧化酶大家族的不同成员,它们在进化上具有高度保守性,在功能上也具有较大相似性,均为亲水的酸性蛋白,除DlFSD1a和DlFSD1b外,其余均为稳定蛋白。不过不同类型的SOD又具有各自特点,它们在龙眼体胚中的可能作用机理:①DlCSD1a和DlCSD1b定位于细胞质,不含信号肽,不进行跨膜运动,两者相互协调主要负责细胞质中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸的位点为辅发生磷酸化;②DlCSD2a定位于叶绿体,含有信号肽,以由叶绿体内膜到叶绿体外膜上方式进行跨膜运动,主要负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;③DlFSD1a定位于叶绿体,含有信号肽,不含跨膜结构域,可能与DlCSD2a协同作用负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化;④DlFSD1b和DlFSD1b(JF316733)可能定位于过氧化物酶体和细胞质,均不含信号肽,含2个跨膜结构域,倾向于由外到内进行跨膜运动,并以酪氨酸为主、丝氨酸及苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;⑤DlMSD定位于线粒体,不含信号肽,存在从线粒体内膜到外膜或从外膜到内膜的双向跨膜运动的2个跨膜螺旋结构域,主要负责线粒体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化。4.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族启动子克隆和功能鉴定为进一步了解SOD基因家族在转录水平上的调控作用,本研究采用Tail-PCR法和IPCR法,分别获得了DlCSD1a、DlCSD2a、DlFSD1a和DlMSD基因启动子序列,长度分别为2252 bp、164 bp、1080 bp和843 bp,其中,DlCSD1a启动子区域含有2个内含子序列。利用RLM-RACE法鉴定DlSODs基因家族的TSS,结果显示它们都含有丰富的TSS,数量从3 ~ 10个不等;5’UTR长度波动范围较大,介于11~193 bp之间;TSS碱基组成一般以A为主,其次为G和C,还少数出现T。龙眼DlSOD基因家族不同成员存在多个TSS且各TSS起始mRNA转录效率不同,暗示RNA聚合酶和调控因子在DlSOD基因家族启动子的一个较宽范围内的互作控制了转录的效率。PlantCare软件分析显示,DlCSD1a、DlCSD2a和DlFSD1a基因启动子区域中,均含有核心启动子元件和基本启动子区,但DlMSD基因5’端基础启动区缺少TATA和CAAT盒;此外,还存在大量与光响应、激素应答、环境胁迫响应、胚乳特异表达响应、细胞周期相关响应及大量的功能未知或功能特异的相关元件;另外不同成员SOD基因还存在各自功能特异的顺式元件。此外,DlCSD1a和DlFSD1a基因可能受bZIP类转录因子调控,而DlMSD可能受WRKY类转录因子的调控。在此基础上,还构建它们3’/5’不同缺失突变体的瞬时表达载体,为将来功能验证实验奠定基础。5.龙眼体胚发生过程中调控SOD基因家族的小分子RNA的分离与鉴定为了解DlSODs基因在转录后水平上的表达调控机制,本研究首先采用Solexa技术对龙眼体胚发生过程中的sRNA进行测序。结果表明:共得到Unique序列6,553,782条,其中仅13,151条序列与已知miRNAs相似;sRNA以24 nt的长度为主要存在方式;龙眼体胚发生过程中miRNA的表达丰度存在巨大差异,其中大部分为低丰度表达;总共鉴定了367个保守miRNA,构成众多家族,不同家族间成员数量存在巨大差异;另外获得23个候选的新miRNA,其中有10个miRNA含单个基因座,另13个miRNA具备多个基因座。在上述基础上,结合psRNA Target预测软件和RLM-RACE法最终鉴定到调控DlSODs的11个dlo-miRNAs,它们以裂解DlSODs mRNA的方式调控其在龙眼体胚发生过程中的转录后水平表达。这11个dlo-miRNAs分别是dlo-miR156(靶标DlCSD1a);dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643(靶标DlCSD1b);dlo- miR159、398、1171a和1171b(靶标DlCSD2a)以及dlo-miR808和2089(靶标DlFSD1a),它们在龙眼体胚发生过程中呈较大差异表达,推测其差异表达导致了不同类型SOD基因在龙眼体胚发生过程中表达模式的不同。此外利用RT-PCR法克隆获得pre-miR398a/b序列,它们与其它植物的前体序列具有高度保守性。6.龙眼体胚发生过程中SOD基因家族及miRNA定量表达分析①龙眼体胚发生过程中SOD基因家族表达模式分析在上述研究的基础上,以及对龙眼体胚发生过程中qPCR内参基因筛选的基础上,对不同类型DlSODs的表达模式进行分析。首先,不同类型DlSODs在龙眼体胚发生过程中的表达变化趋势比较接近,它们主要在体胚发育的中期和成熟胚中起作用。从松散型胚性愈伤组织开始到成熟胚等9个阶段,它们总体的表达变化趋势主要体现为“递增(胚性愈伤II)-递减(不完全胚性紧实结构)-递减(紧实胚性球形结构)-递减(球形胚)-递增(心形胚)-递减(鱼雷形胚)-递减(子叶形胚)-递增(成熟胚)”模式。其次,不同类型SODs在龙眼体胚不同发育阶段有明显的分工。在胚性愈伤组织II和心形胚阶段,所有类型SOD都介导了其发育;球形胚阶段的形态建成则主要由DlCSD1a-5和DlCSD1b-2负责;鱼雷形胚阶段的发育主要受DlFSD1a、DlFSD1b和DlMSD的调控;在子叶形胚阶段,所有类型SODs的转录水平均很低;在成熟胚阶段的形态建成则主要以DlCSD1a为主,DlMSD为辅负责。此外,还研究了DlSODs基因家族与其它抗氧化系统的相关基因CAT和POD和分子伴侣DlCCS之间表达模式的相互关系,表明CAT、POD等抗氧化系统相关基因与DlSODs的相互协调表达,从而保证了ROS网络的正常运行;DlCCS的正常稳定表达对维持DlCSDs正常发挥生物学功能是必须的,但DlCSDs的激活也并不完全依赖于DlCCS的存在。②龙眼体胚发生过程中miRNAs表达模式分析在龙眼体胚发生过程中qPCR miRNA内参基因筛选的基础上,对20个dlo-miRNAs的表达模式进行分析。dlo-miR3,5,10,12,13,156a,156c,397a,398b.1,398b.2,398b.3,808和2089*等miRNA共同介导了龙眼体胚发生早期的形态建成,它们均在体胚发生早期球形胚之前大量表达,晚期表达量多数下降,部分miRNA甚至不表达;dlo-miR6、160a和167a可能在龙眼体胚发生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a转录水平的累积对龙眼心形胚和鱼雷形胚的形态建成可能是必须的;dlo-miR167a在龙眼子叶胚和成熟胚中起主要作用;而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龙眼体胚发生过程中的表达均比较稳定。以上说明miRNAs表达的组织和时空特异性共同介导了龙眼体胚的发生。③龙眼体胚的发生过程miRNA与DlSODs表达模式的比较分析miRNA-DlSODs的协调表达参与调控了龙眼体胚的发生。对miRNA与DlSODs表达模式进行比较分析表明:dlo-miR156家族、159家族、398b家族、808和2089*在龙眼体胚发生过程中均有特异性扩增,且表达量能与相应靶基因呈负相关;然而dlo-miR863-3p、1023b-23p、1171a/b、1223和2643却未能得到特异性扩增但却能鉴定到它们裂解的mRNA片段,提示在龙眼体胚中可能还存在其它潜在的miRNA或内源siRNA介导了DlSODs的表达。此外,不同miRNA成员间在不同发育阶段具有明确的分工,甚至不同miRNA成员可能控制着相应mRNA转录本的表达,如dlo-miR159家族的4个成员分别调控着DlCSD1b、DlCSD2a不同发育阶段的表达。在龙眼体胚发生早期(球形胚前),它们的表达主要由dlo-miR159a.1负责;从球形胚到心形胚则由dlo-miR159c和159f负责;心形胚到成熟胚阶段由dlo-miR159a.2和dlo-miR159c负责,这种现象还在dlo-miR156家族及398b家族出现。这可能提示当miRNA某个成员不能裂解mRNA表达时,另外一些成员则对其功能进行互补,从而实现对靶基因转录后水平的调控。dlo-miR159同时介导DlCSD1b和DlCSD2a的表达,并负责协调不同靶基因间的表达变化趋势;miRNA可能以裂解靶基因mRNA的降解或抑制靶蛋白质翻译两种调控机制并存的方式同时介导靶基因的表达。此外,dlo-miR398b与pre-miR398b的表达模式基本一致,它们与靶基因DlCSD2a的表达模式刚好相反,说明前体miRNA能在一定程度上反应成熟miRNA的表达情况。综上所述,龙眼体胚发生过程中DlSODs的表达调控机制可能是:当外界环境因子发生改变时(内源激素或外界环境因子胁迫),细胞内活性氧水平发生变化,进而启动相关调控因子[(转录因子bZIP、WRKY、miRNAs(dlo-miR156、159、398、808和2089*)、磷酸化作用)]转录水平的变化从而调控DlSODs的表达,使之最终参与龙眼体胚发生过程中的基础代谢、激素信号转导、细胞凋亡、氧化胁迫等生理过程,从而最终影响其发育的整体进程。总之SOD的表达是多种因子共同构成的一个复杂调控网络。
马云[4]2006年在《牛叁个基因的分离、定位及其与牛经济性状的关联研究》文中研究说明本研究分别以秦川牛、鲁西牛、中国西门塔尔牛、晋南牛、夏洛来牛、利木赞牛和安格斯牛8个品种牛的309份血样和中国西门塔尔牛、安格斯牛及海福特牛的肝脏组织样为材料,分别提取基因组DNA和RNA,运用生物信息学方法和同源序列克隆技术结合电子PCR(ePCR)、反转录PCR(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,对牛的类β-酮酰基转运蛋白还原酶(FABGL)基因、类血管生成(ANGPTL4)基因4和乙酰辅酶A合成酶2(ACAS2)基因的cDNA序列和基因组DNA序列进行了克隆、鉴定与序列分析,运用辐射杂种定位技术对所分离的叁个基因进行了染色体物理定位,运用测序和PCR-SSCP结合的方法对叁个基因的部分基因组DNA片段进行了单核苷酸多态检测,运用一般线性模型研究了FABGL和ANGPTL4基因与上述8个品种牛部分生长与肉质性状的相关性,得到了如下结果:1)利用电子PCR(ePCR)、反转录PCR(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术分离并鉴定了牛FABGL基因和ANGPTL4基因的包含全长CDS的cDNA序列,ACAS2的部分CDS序列,并为GenBank数据库收录,收录号分别为DQ355520、DQ355521和DQ459834。进行了牛FABGL基因和ANGPTL4基因蛋白质序列的推导和结构的初步分析。结果表明,牛FABGL蛋白和ANGPTL4蛋白分别由260个和410个氨基酸组成。2)分离了牛FABGL基因和ANGPTL4基因的完整3'cDNA和部分5'cDNA。克隆了FABGL基因的全部基因组9个外显子和8个内含子序列,并进行了序列分析。获得了包含全部外显子和内含子的FABGL基因的基因组DNA片段,并为GenBank数据库收录,收录号为DQ409814。3)克隆了ACAS2和ANGPTL4基因的11个基因组DNA片段,并进行了鉴定,序列已经提交给GenBank,正在申请收录号。4)对分离的叁个牛新基因用SUNbRH杂种板进行了染色体定位,结果:FABGL、ANGPTL4和ACAS2基因分别被定位于牛的23、7和13号染色体上,FABGL基因与牛23号染色体上的标记BM47,ANGPTL4基因与牛7号染色体上的标记DIK4204及ACAS2基因与牛13号染色体上的标记DIK4350的距离分别为1.71、8.54和1.51cR。5)对上述3个基因进行了SNPs的检测,发现如下3个单核苷酸多态座位: FABGL基因第8内含子的PCR-SSCP (87A-87G), FABGL基因第5内含子的PCR-SSCP (25C-25T);
刘娣[5]2008年在《秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆》文中研究指明我国每年的作物秸秆产出量约6.5亿吨,折合纤维素含量约2亿多吨,是自然界藴藏最丰富的可再生资源。但是作物秸秆由于组成成分结构的复杂性,不易降解已经成为生产中的障碍,特别在以种植业为主的地区,秸秆在短期内的不易腐解,加上直接还田影响墒情和耕作,导致废弃和焚烧秸秆遍及广大农村,由此引起环境污染和严重的资源浪费,获取高效降秸秆纤维素的微生物菌株及其制剂的应用是解决我国严峻秸秆问题技术的关键。本文进行了秸秆降解微生物的研究,取得了以下主要结果:利用稀释涂平板法从300个来自吉林,浙江,四川,河北,北京等地的土壤样品中初筛到360株秸秆纤维素降解菌,依据降解菌在平板上降解圈的大小,得到5株降解能力较强的真菌,分别命名为T1,HD5,HD6,HD7和HD24。这5株真菌均能以秸秆纤维素为唯一碳源良好生长。通过形态观察、18S rDNA序列分析和ITS序列分析鉴定这5株菌分别属于肉座菌属的Hypocrea lixii(Trichoderma harzianum)、曲霉属的黄曲霉(Aspergillus flavus)、曲霉属的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、木霉属的Trichoderma koningiopsis和青霉属的草酸青霉(Penicillium oxalicum)。纤维素降解菌株Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24在固体平板上和液体培养基中都有很好的降解效果。在固体平板上,秸秆纤维素的添加量为1%时,Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24 30℃培养7d,固体平板中央出现明显的降解透明圈,为20-25mm不等。在液体培养基中,Hypocrea lixii T1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsis HD7和Penicillium oxalicum HD24在第3d全酶活(FPA)均达到最大,其FPA的最大酶活力分别为25.4U,34.36U,28.85U,31.19U,32.05U,比标准菌株Trichoderma viride(AS3.3711)的酶活力分别高出21.88%,64.87%,38.43%,49.66%,53.79%。它们的最适反应温度均为50℃,但是菌株间产酶的pH值存在差异,菌株T1,HD5,HD6的最适pH值为5,菌株HD7的最适pH值为5.5,而菌株HD24的最适pH值为6。不同的氮源及其用量影响菌株降解纤维素的FPA活性,确定了菌株最佳的氮源种类及其用量:Hypocrea lixiiT1的最佳氮源为NaNO_3,添加量为1.5%;Aspergillus flavus HD5的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为2%;Aspergillus fumigatus HD6的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为0.5%;Trichoderma koningiopsisHD7的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为1.5%;Penicillium oxalicumHD24的最佳氮源为(NH_2)_2CO添加量为1%。添加0.1%蔗糖对菌株降解纤维素的FPA活性均呈现抑制作用,而添加0.1%的纤维二糖只对Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性表现了一定的抑制效应,明显提高Penicillium oxalicumHD24的FPA活性;添加0.1%的Tween 20对Hypocrea lixiiT1, Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性促进作用不明显,但显着提高了Aspergillus flavus HD5和Penicillium oxalicumHD24的FPA活性。利用SMART cDNA library Construction技术,构建了Hypocrea lixii T1,Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsis HD7的cDNA文库:通过抽提总RNA,经反转录合成cDNA第一链,PCR合成第二链,制备了cDNA的全长片段,收集500bp以上的片段,与λTriplE载体重组,其库容量均达到10~9pfu/mL,重组载体经体外包装、转染E. coli LE392,在Amp+的抗性培养基上获得10万多个λ噬菌斑。利用纤维素底物诱导,筛选到了携带纤维素外切酶和内切酶基因的目的克隆子320个,挑选其中45个阳性克隆子,经PCR扩增测序和比对,获得3个新的纤维素酶基因。采用双向凝胶电泳(2DE)技术,研究了在相同培养条件下Trichoderma viride AS3.3711,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24的蛋白组学,结果表明纤维素酶的活性与其蛋白质的表达密切相关,这些菌株的2DE图谱之间也存在明显的差异,推测这些差异表达的蛋白质点可能与纤维素酶的种类、活性有关。
李芳[6]2013年在《芍药花乙烯代谢及信号转导主要基因的克隆与分析》文中研究表明芍药是中国的传统名花，适宜做切花应用。由于芍药花期短且集中，影响了它的应用价值。乙烯在芍药花开放和衰老进程中具有关键的调控作用。本论文应用RT-PCR技术，克隆了芍药肌动蛋白和ACC氧化酶的编码区序列；应用RACE技术克隆了芍药ACC合成酶、乙烯受体ETR1及信号转导关键元件EIN3基因cDNA序列，并对他们进行了初步的生物学信息分析；应用半定量RT-PCR技术分析了Actin基因在不同组织和芍药切花不同发育阶段的表达情况。研究结果如下：1、克隆了芍药Actin编码区序列，GenBank登录号为JX310002。该基因长度为1134bp，共编码377个氨基酸。芍药肌动蛋白与棉花、向日葵、白梨等物种肌动蛋白氨基酸同源性达99%；生物信息学软件预测分子量为41.7kD，等电点（pI）为5.31，是一个定位于胞液、不含跨膜域、不含信号肽分子的亲水的、稳定蛋白。半定量RT-PCR技术分析表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花及芍药切花不同发育阶段中的表达量保持恒定，适宜作为芍药功能基因表达分析的内标基因。2、克隆了芍药ACO基因编码区序列，GenBank登录号为JX445143。该基因长度为939bp，编码312氨基酸，预测ACO基因分子量为35.2kD，等电点（pI）为5.24。生物信息学分析预测芍药ACO蛋白没有信号肽，属于非分泌蛋白，可能没有跨膜蛋白，亚细胞定位在细胞质。与牡丹、猕猴桃、枣、巴西橡胶等植物ACO蛋白的同源性均超过80%。3、基于RACE技术获得了芍药ACS基因cDNA全长序列，GenBank登录号为JX512359。该基因长度为1752bp，编码492个氨基酸，预测分子量为55.2kD，等电点（pI）为7.13，生物信息学分析表明芍药ACS蛋白没有信号肽，属于非分泌蛋白，亚细胞定位在细胞质，与牡丹、枇杷、苹果、天竺葵等物种ACS蛋白的同源性均高于70%。4、基于RACE技术克隆了芍药ETR1基因cDNA全长序列，GenBank登录号为JX406435。该基因长度为2817bp，编码740个氨基酸，预测分子量为83.1kD，等电点（pI）为6.82，生物信息学软件分析它是一个定位于液泡，没有信号肽。与橙子、枇杷、番茄、莴苣等物种蛋白的同源性均超过80%。5、基于RACE技术获得了芍药EIN3基因cDNA全长序列，GenBank登录号为JX445144。该基因长度为2739bp，编码548个氨基酸，预测分子量为61.5kD，等电点（pI）为5.55，生物信息学软件分析EIN3蛋白不含信号肽，可能不含跨膜蛋白，亚细胞定位在细胞核中。BlastP分析表明芍药EIN3蛋白与毛果杨、苹果、蓖麻等植物的同源性均超过50%。
宋东辉[7]2004年在《水稻抗病性相关的蛋白激酶基因OsBIMK2和OsBISERK1的克隆鉴定与功能分析》文中认为植物在与病原物的协同进化过程中，逐渐形成了一系列复杂高效的保护机制来抵御病原物的侵染。植物中抗病基因所决定的抗病性是一种高水平的品种对病原菌小种的专化抗性。同时，植物还形成了一套适应性更广的可诱导的抗病机制。由于植物可诱导抗病性是一种非特异的广谱抗病性形式，因而倍受关注。在我们实验室的前期研究中，运用抑制性差减杂交法构建了水稻诱导抗病性相关差别表达cDNA文库，分离鉴定了200多个在诱导抗病性中差别表达的cDNA。其中的2个克隆分别含有可能编码水稻MAPK(mitogen-activated protein kinases)和SERK(somatic embryogenesis receptor kinase)蛋白激酶的基因片段。本文克隆和鉴定了水稻中与苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)诱导抗病性相关的编码MAPK的OsBIMK2基因和编码SERK的OsBISERK1基因全长cDNA；研究了OsBIMK2基因和OsBISERK1基因在水稻—稻瘟病菌亲和与非亲和互作过程中的表达模式；原核表达了OsBIMK2基因，获得重组OsBIMK2蛋白，并研究了重组OsBIMK2蛋白的生化特性；克隆了OsBIMK2基因的启动子序列，并运用农杆菌介导的瞬间表达系统分析鉴定了启动子中参与基因表达调控的可能顺式元件：将水稻OsBIMK2基因导入烟草，获得过量表达OsBIMK2基因的转基因植株，这些转基因植株中防卫反应基因PR-1组成型表达，并提高了抗病性。 在运用抑制性差减杂交法分离克隆的与BTH诱发的水稻诱导抗病性相关的差别表达cDNA中，克隆BIHN-n1(BI118686)和BNHN-4w(BI118743)分别含有585 bp和343 bp插入片段，序列搜索表明这两个克隆中的插入片段与植物MAPK和SERK蛋白激酶基因有较高的同源性。运用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术，以水稻cDNA文库噬菌体DNA为模板，分别扩增了BIHN-n1和BNHN-4w克隆的5’和3’端缺失序列，获得全长cDNA序列信息。根据上述2个克隆的全长cDNA序列，运用PCR扩增获得全长cDNA克隆，分别命名为OsBIMK2(Oryza sativa L.benzothiadiazole-induced MAP kinase 2)浙江大学博_卜学位论文和OsB儿涟RKI(Q矛)za夕riva L.互enzothiadiazole一induced业旦丝1)。 05刀了彻琢卫全长eDNA序列为2132 bp，含有一个1521 bp的oRF区域，5’和3’分别含有205 bp和407bP的非编码区。口，刀刀以兀2 oRF序列预测编码一个506氨基酸组成的MAPK蛋白，含有MAPK蛋白激酶所特有的n个Se叮h;保守结构域以及一个特殊的可磷酸化叁肤模体结构TDY。同源性比对以及系统进化树分析表明，osBIMKZ蛋白与己知的其他植物MAPK蛋白在氨基酸序列水平上有40一71%的同源性，与水稻中己知MAPK蛋白激酶有41 .7%一78.9%的同源性，说明OsBIMKZ可能是一个新MAPK。Southem分析表明，OsBll以KZ以单拷贝形式存在于水稻基因组。原核表达获得重组OsBIMKZ蛋白，而且重组osBIMKZ蛋白在体外具有自我磷酸化活性，表明OsB挤孙佗基因编码一个具有生化活性的MAPK。 由己知序列拼接出的osBisERKI全长cDNA序列为2349bP，含有一个1875bp的ORF区域，5’和3’分别含有104 bp和371 bp的非编码区。OsBISERKI的ORF序列预测编码一个624氨基酸组成的SERK蛋白。预测的osB巧ERKI蛋白与己知的其他植物SERK蛋白在氨基酸水平上有75一85%的同源性。Southern分析表明，OsBISERKI以多拷贝形式存在于水稻基因组。 分析研究了OsB挤办佗基因和口‘刀左汪洁梦刀基因在水稻诱导抗病性以及在水稻一稻瘟病菌(Magnoportho grisea)亲和与非亲和互作中的表达模式。BTH诱发处理和稻瘟病菌侵染6h内均能快速激活水稻口‘刀了材xZ和osBISERKI基因的表达并维持较高表达水平。BTH诱发处理的水稻在与稻瘟病菌非亲和互作的6一12h阶段，就能激活口‘刀扒办口和石污刀左汪次人7基因的快速表达。这些结果表明水稻OsBIMKZ和OsBISERKI基因均在水稻MAPK信号传递链参与的诱导抗性以及抗病基因控制的抗病反应的早期起作用。 根据口扭扒仃口基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列，采用PCR方法克隆了3384 bp的口，刀扒办佗的基因组序列和上游2332 bp的启动子序列。osBIj讨人2基因组DNA序列由9个内含子和10个外显子组成，其内含子共有13对正向重复序列和4对反向重复序列，内含子的剪切机制符合植物中最常见的GU一AG形式。分析 OsB扒办佗基因启动子序列，发现起始密码子Al，G上游2.3kb的区域内存在一些与基因表达调控有关的顺式作用元件，如Dof转录因子、ELRE结合序列一浙江人学博卜学位论文GT-1结合序列、WB一box元件和W一box元件等。将OsBIMKZ基因启动子全长区域及其5’一部分缺火构件连接在gus(B一glucuronidase)报道基因编码卜，之前，通过烟草叶片瞬间表达系统发现，克隆的启动子区域中一1071bP或更长的片段在sA诱发处理叶片后都表现出基本的启动子活性。说明在启动子这些区域中存在着受SA诱导的表达口扔了M人卫基因所需的顺式作用元件。 将水稻OsB挤办佗基因导入到烟草，获得过量表达乙七刀从办佗基因的转基因烟草。选用外源花椰菜花叶病毒组成型强表达启动子caMv3，S与载体系统pcAMBIA1381构
陈义挺[8]2009年在《龙眼体胚发生过程中的CDC48和GPX基因克隆与表达》文中研究指明本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)“红核子”胚性愈伤组织(Embryogenic callus, EC)为材料,对以下8个方面进行研究:①龙眼胚性愈伤组织CDC48基因(cell division cycle 48)cDNA和DNA克隆;②CDC48基因的原核表达;③龙眼胚性愈伤组织CDC48基因的生物信息学分析;④龙眼胚性愈伤组织GPX (glutathione peroxidase)cDNA和DNA克隆;⑤GPX基因的原核表达;⑥龙眼胚性愈伤组织GPX的生物信息学分析;⑦以龙眼UBQ和EF-1a 2个基因共同作为内参基因,利用荧光定量PCR技术分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物中龙眼CDC48和GPX基因转录水平表达变化;⑧分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物及逆境胁迫处理下龙眼EC GPX活性变化。主要研究结果如下:1.龙眼胚性愈伤组织CDC48基因cDNA和DNA全长的获得以龙眼EC为材料,应用同源克隆结合RACE技术,获得了龙眼胚性愈伤组织CDC48的cDNA全长为为2620 bp,其中5'UTR为17 bp,3'UTR为187 bp,3’端还含有13个poly(A)尾。该序列与登录GenBank的其它植物CDC48基因有很高的同源性。序列分析发现拼接的cDNA含有一个2415 bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,ATG为起始密码子、TAG为终止密码子。将此基因命名为DLCDC48,并在GenBank上登录,登录号为EU606206。从DNA水平克隆也得到了龙眼胚性愈伤组织的CDC48基因,并且经测序证实该基因无内含子,在GenBank上登录,登录号为:FJ590953。2.龙眼胚性愈伤组织CDC48基因原核表达根据龙眼EC CDC48全长cDNA的序列分析,在可能的ORF区域设计一对添加限制性内切酶的特异引物,进行ORF片段扩增并将其克隆到表达载体pET-28 a中。将构建好的表达载体在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行融合表达。经过诱导,SDS-PAGE分析发现宿主菌中有一个分子量约为89 kD的新蛋白出现。该诱导表达的蛋白分子量与理论推导龙眼EC CDC48的分子量89.5 kD相近。3.龙眼胚性愈伤组织CDC48基因的生物信息学分析应用生物信息学软件对龙眼胚性愈伤组织CDC48的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析。结果表明: CDC48蛋白的分子量是89564.8 Da,理论等电点pI 4.92,是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白,不具有信号肽,主要定位在细胞核上,有3个区域最有可能形成卷曲螺旋,由40.87%的a螺旋、15.28%的延伸链和43.85%的不规则卷曲组成,磷酸化位点有39个。保守结构域与功能域分析龙眼CDC48具有两个典型的ATPase模块,以及含有CDC48特有的N端。通过功能的预测与分析,推测与细胞的分裂有关系。通过其氨基酸序列的系统进化树分析,CDC48的进化在一定程度上反应了植物的进化。此外,还对CDC48酶分子叁维立体结构等进行了预测和分析。4.龙眼胚性愈伤组织GPX基因cDNA和DNA全长的获得以龙眼EC为材料,应用同源克隆结合RACE技术,获得了龙眼胚性愈伤组织GPX的cDNA全长cDNA全长为947 bp, 5'UTR为195bp,3'UTR为245 bp,区域还含有典型的加尾信号AATAA和poly(A)尾。该序列与登录GenBank的其它植物GPX基因有很高的同源性。序列分析发现拼接的cDNA含有一个504 bp的开放阅读框,编码168个氨基酸,ATG为起始密码子、TAA为终止密码子。将此基因命名为DLGPX,并在GenBank上登录,登录号为EU364813。从DNA水平克隆也得到了龙眼胚性愈伤组织的GPX基因,1736 bp核苷酸序列,有ATG起始密码子和TAA终止密码子,并在GenBank上登陆,登陆号为:EU680970。通过DNAMAN 6.0软件分析,GPX基因由5个外显子和4个内含子组成,所有内含子的剪切位点均符合真核生物GT-AG规则。5.龙眼胚性愈伤组织GPX基因原核表达根据龙眼EC GPX全长cDNA的序列分析,在可能的ORF区域设计一对添加限制性内切酶的特异引物,进行ORF片段扩增并将其克隆到表达载体pET-28 a中。将构建好的表达载体在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行融合表达。经过诱导,SDS-PAGE分析发现宿主菌中有一个分子量约为23 kD的新蛋白出现。本研究所用的酶切位点为SacI和XhoI,把载体上额外翻译的38个氨基酸一起表达。龙眼GPX编码基因产物的理论推导分子量18.54 kD,加上额外翻译的氨基酸理论推导分子量为4.08 KD(38个氨基酸理论推导分子量为39.45 KD),总共为22.62KD,与本研究结果相符。6.龙眼胚性愈伤组织GPX基因生物信息学分析运用生物信息学软件对龙眼胚性愈伤组织GPX基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析。结果表明:GPX蛋白的分子量是18541.16Da,理论等电点pI 7.18,是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白,不具有信号肽,细胞主要定位在细胞质上,有1个区域最有可能形成卷曲螺旋,由27.98%的a螺旋,20.249%的延伸链和51.79%的不规则卷曲组成,磷酸化位点有13个。龙眼胚性愈伤组织GPX氨基酸序列含有PHGPX的两个特征序列,推测所克隆到的可能是GPXs家族中保护膜免受损伤的PHGPX的cDNA序列。此外,还对GPX酶分子叁维立体结构等进行了预测和分析。7.龙眼胚性愈伤组织CDC48和GPX基因转录水平表达分析用龙眼胚性培养物中UBQ和EF-1a 2个基因共同作为内参基因,利用荧光定量PCR技术分析龙眼体胚发生过程各阶段培养物龙眼CDC48和GPX基因转录水平表达变化。分析结果显示:龙眼CDC48在体胚发生过程中都有不同程度的表达,其中胚性紧实球形结构阶段表达量最大,其次是胚性愈伤组织,最低的是球形胚;龙眼GPX在体胚发生过程中也均有不同程度的表达,其中胚性紧实球形结构阶段表达量最大,其次是子叶胚,最低的是胚性愈伤组织。8.龙眼体胚发生过程中GPX酶活性变化GPX活性在龙眼体胚发生过程中也均有不同程度的表达,其中胚性紧实球形结构阶段表达量最大,其次是子叶胚,最低的是胚性愈伤组织,这与龙眼体胚发生过程中基因相对定量表达结果是一致的;以龙眼胚性细胞系LC2为材料,研究了在NaCl、光和温度胁迫下龙眼胚性愈伤组织GPX酶活性的变化规律。分析结果显示:在一定逆境胁迫下,细胞内GPX可以起到应答外界刺激的作用,且活性呈规律表达,推测GPX活性变化与胚性细胞抗逆性正相关,是植物在逆境胁迫下防御ROS伤害的主要标志之一。总之,本研究克隆了与体胚发生过程有密切相关的2个基因,进行了表达分析,并比较全面地预测和分析了它们的结构和功能,加深了对龙眼体胚发生机制的理解,为构建龙眼体胚发生的基因网络提供新的资料,为研究龙眼体胚发生过程中的细胞发育调控和活性氧的清除等方面的机理提供有价值的证据,为利用基因工程方法进行龙眼和其它植物胚胎发育调控等方面的遗传改良提供基因资源。
赵欢[9]2011年在《刺参Apostichopus japonicus (Selenka)对温度胁迫响应分子机理的基础研究》文中指出以刺参Apostichopus japonicus为研究对象,探讨了温度胁迫下刺参基因表达变化,构建了高温刺激与未经温度刺激的刺参体壁消减cDNA文库,克隆了与温度密切相关的热休克蛋白90和热休克蛋白26基因cDNA全长序列,分析了基因结构,在mRNA水平上研究了两个基因在不同刺激温度、刺激时间及不同组织中的表达情况,并评价了不同群体刺参耐温性状的差异。1.构建了温度胁迫条件下刺参体壁消减cDNA文库。以温度刺激条件下刺参体壁为检测子(tester),以对照组刺参体壁为驱动子(driver),经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR扩增,获得正向消减文库;以温度刺激条件下刺参体壁为驱动子(driver),以对照组刺参体壁为检测子(tester),构建反向消减文库。在正反向文库中随机挑选768个克隆进行PCR扩增鉴定,发现多数克隆都含有插入片段,进一步利用斑点杂交进行筛选,得到737个有差异表达的阳性克隆,经测序共获得165个EST序列,其中65个为已知基因,100个为未知基因。对这些基因进行功能分类,发现正向库中免疫应激相关基因数量明显多于反向库,而能量代谢相关基因明显少于反向库,表明温度胁迫诱导应激防御相关基因的表达,而抑制代谢相关基因的转录。2.克隆了刺参热休克蛋白90(Aphsp90)和热休克蛋白26(Aphsp26)cDNA序列全长。刺参热休克蛋白90(Aphsp90)和热休克蛋白26(Aphsp26)cDNA全长分别为3458bp和1688bp,编码720和236个氨基酸,均为不具有信号肽的胞内蛋白。多重序列比对、系统进化分析显示ApHsp90和ApHsp26氨基酸序列与其他物种Hsp90和sHSPs具有同源性,蛋白质叁维结构研究发现这两个氨基酸序列具有Hsp90和sHSPs的特征功能区域,表明获得的cDNA序列为目的基因。3.揭示了热休克蛋白90(Aphsp90)和热休克蛋白26(Aphsp26)基因表达特征。应用RT-PCR检测Aphsp90和Aphsp26基因在不同温度下(20、22、24、26℃)刺参不同组织的表达发现,刺参体壁、呼吸树和肠道中Aphsp90和Aphsp26基因表达发生变化以响应温度胁迫,且响应具有组织差异性。在20℃对照组中,不同组织中基因转录水平高低顺序为刺参肠道>呼吸树>体壁;随着温度的升高,Aphsp90和Aphsp26基因表达量与温度呈现正相关性,在不同组织中都显着升高,肠道中两个基因转录水平变化幅度最大,肠道可能是刺参机体热敏感性较高的组织。基因时序表达结果显示两个基因转录水平与胁迫时间具有较好的正相关性,Aphsp26基因转录水平在胁迫初期(0-6h)显着升高,之后下降,末期恢复到接近对照水平,Aphsp90基因表达量在胁迫4h达到最大值,6h维持在最大值,之后缓慢下降恢复到接近对照水平。4.比较了高温定向选育后南移养殖的浙江群体和烟台野生群体对高温的耐受性。高温(28℃)培育对不同群体幼体存活率、变态率及特定生长率的影响结果显示,在高温条件下两个群体幼体存活率、变态率及特定生长率都比恒温条件(22℃)显着下降,浙江南移群体在高温条件下表现出较好的耐受性,各类指标都高于烟台野生群体。分析了两个群体幼体温度胁迫下的生长趋势,发现随着温度的升高,幼体发育加快,提前进入变态期,浙江幼体在高温条件下最大体长增长,而烟台幼体最大体长缩短。对比不同群体幼参32℃热激17天后的存活率,发现浙江南移群体比烟台野生群体表现出较高的存活率;分析不同群体Aphsp90和Aphsp26基因在28℃热激后的表达情况,结果显示浙江南移群体两个基因转录水平在热激后各个时间点都低于烟台群体,表明刺参耐受性差异与Aphsp90和Aphsp26基因表达模式存在一定的相关性。
钟涛[10]2008年在《草地螟触角气味结合蛋白基因克隆及表达》文中研究说明草地螟是我国北方地区严重发生的一类重要的农牧业害虫。近年来,对草地螟的行为学研究比较多,但对草地螟嗅觉识别的分子机制研究,国内外尚未见报道。从分子生物学角度来研究草地螟在产卵和取食过程中对其寄主植物选择性识别机制,可以为开发防控草地螟为害的技术提供新思路。有研究表明,昆虫触角气味结合蛋白在昆虫感知外界信息物质中起作用,并且该类蛋白广泛地存在于昆虫触角嗅觉感受器中。本论文通过基因克隆及原核表达技术对草地螟触角气味结合蛋白进行了研究。已取得的主要结果如下:(1)利用RT-PCR结合RACE技术克隆了草地螟触角普通气味结合蛋白Ⅰ(GOBP1)基因(GenBank登录号为EU413989)。序列分析表明:LstiGOBP1含有完整的蛋白编码区序列,并具有真核生物分泌蛋白的信号肽特征;蛋白呈酸性,有4个亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成3个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在58.2%左右。根据已知的基因序列,构建了LstiGOBP1的原核表达载体,并在大肠杆菌中成功进行了诱导表达,表达产物经Western印迹实验证明与预测蛋白大小一致。(2)利用RACE技术克隆了草地螟触角普通气味结合蛋白Ⅱ(GOBP2)基因(GenBank登录号为EU239360)。序列分析表明:雌雄虫触角中的LstiGOBP2的核苷酸序列没有差别;LstiGOBP2含有完整的蛋白编码区序列,并具有真核生物分泌蛋白的信号肽特征;蛋白呈酸性,有4个亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成2个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在81%左右。根据已知的基因序列,构建了LstiGOBP2的原核表达载体,并在大肠杆菌中成功进行了诱导表达,表达产物经Western印迹实验证明与预测蛋白大小一致。(3)利用RT-PCR结合RACE技术克隆了草地螟触角信息素结合蛋白(PBP)基因(GenBank登录号为EU545482)。序列分析表明:LstiPBP序列含有完整的蛋白编码区序列,并具有真核生物分泌蛋白的信号肽特征;蛋白呈酸性,有4个亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成2个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在64%左右。根据已知的基因序列,成功构建了LstiPBP的原核表达载体。(4)利用RACE技术克隆了草地螟雌虫触角信息素结合蛋白FM1(PBPFM1)基因(GenBank登录号为EU638330)。序列分析表明:LstiPBPFM1含有一段编码138个氨基酸的编码区序列,第18、19个氨基酸残基之间可能存在切割位点;蛋白呈酸性,拥有气味结合蛋白的典型结构特征,序列中含有6个完全保守的半胱氨酸残基,联结形成3个二硫键;与鳞翅目昆虫的同源性在57.2%左右。(5)利用RACE技术克隆了草地螟雌虫触角信息素结合蛋白FM2(PBPFM2)基因(GenBank登录号为EU638331)。序列分析表明:PBPFM2含有一段编码69个氨基酸的编码区序列;蛋白呈酸性,有1个明显的亲脂性区域;该蛋白拥有气味结合蛋白的典型结构特征,即序列中含有3个完全保守的半胱氨酸残基;与鳞翅目昆虫的同源性在51.2%左右。(6)利用RACE技术克隆了草地螟核糖体蛋白L24(Rp L24)基因(GenBank登录号为EU339126)。序列分析表明:LstiRpL24含有完整的蛋白编码区序列;蛋白呈碱性。与鳞翅目昆虫的同源性在94.4%左右。
参考文献：
[1]. 乌鳢免疫相关基因的克隆鉴定与特征分析[D]. 贾伟章. 中国科学院研究生院（水生生物研究所）. 2007
[2]. 优质棉纤维发育品质相关基因的分离、克隆、鉴定与定位[D]. 贺亚军. 南京农业大学. 2008
[3]. 龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究[D]. 林玉玲. 福建农林大学. 2011
[4]. 牛叁个基因的分离、定位及其与牛经济性状的关联研究[D]. 马云. 西北农林科技大学. 2006
[5]. 秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆[D]. 刘娣. 中国农业科学院. 2008
[6]. 芍药花乙烯代谢及信号转导主要基因的克隆与分析[D]. 李芳. 河南科技大学. 2013
[7]. 水稻抗病性相关的蛋白激酶基因OsBIMK2和OsBISERK1的克隆鉴定与功能分析[D]. 宋东辉. 浙江大学. 2004
[8]. 龙眼体胚发生过程中的CDC48和GPX基因克隆与表达[D]. 陈义挺. 福建农林大学. 2009
[9]. 刺参Apostichopus japonicus (Selenka)对温度胁迫响应分子机理的基础研究[D]. 赵欢. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2011
[10]. 草地螟触角气味结合蛋白基因克隆及表达[D]. 钟涛. 西南大学. 2008
标签：生物学论文; 内含子论文; 基因合成论文; 编码序列论文; 科学论文; 启动子论文; 科普论文; pcr技术论文;