长沙市中医医院麻醉科 湖南长沙 410000
【摘 要】目的 研究加巴喷丁对神经病理性疼痛小鼠的脑皮层组织内差异表达极易的影响作用。方法 将90只小鼠随机分成对照组（C）、假手术（S）和模型组（M），以上各组依据不同的给药分成生理盐水（P）及加巴喷丁（G）两个亚组，一共六组。部分实行坐骨神经结扎，两个星期后开始进行腹腔给药，一个月之后留取大脑皮层。在手术侧足性为学及机械痛阈的变化下确定神经病理性疼痛模型成功和观察加巴喷丁后的效果。选取假手术和模型组中的生理盐水亚组以及模型组中的加巴喷丁亚组，对上述三组实行基因表达差异的差异检测，同时采用实时PCR炎症部分表达存在显著差异的基因。结果 假手术和模型组中的生理盐水亚组对比，闹原型神经生长因素、神经肽Y等基因明显不协调。模型组内的两个亚组对比，上述基因明显上调。结论 加巴喷丁镇痛的脑机制有可能和脑源性神经的生长因子、Pleiotrophin和神经肽Y等基因上调存在关联。
【关键词】加巴喷丁；神经病理性疼痛；神经肽Y；Pleiotrophin；脑源性神经的生长因子
加巴喷丁是一种新型的抗癫痫药物，它是γ－氨基丁酸（GABA）的衍生物，其药理作用与现有的抗癫痫药不同，最近研究表明加巴喷丁的作用是改变GABA代谢产生的。该药在临床上已经被证实对神经病理性疼痛存在优良的效果，但是人们对该药的作用机制还有待研究【1】。Hill及Gee得知加巴喷丁的结合位点为了脊髓背角浅层之外，同时包含了脑皮质的外层；并且在神经病理性疼痛外周痛觉过敏机制内，受损神经元和周围组织的异常放电及癫痫发作时的异常放电很相似，显示了出了被跟神经节和脊髓之外，抗癫痫药物加巴喷丁很可能具有脑皮层相关镇痛机制[2]。此次研究就是要观察加巴喷丁干预对神经病理性疼痛小鼠大脑皮层基因表达差异的影响。
1.材料和方法
1.1实验材料 选取90只SPF健康的BALB/c雄性小鼠，体重为20~22g（由中国医学科学院实验动物研究所提供）。Von Frey filaments。加巴喷丁原料药（白色粉末，由恩华药业提供）。Oligo离子通道和载体基因芯片，神经营养素和受体基因芯片[3]。
1.2PSNL疼痛模型建立和加巴喷丁疗效的观察 小鼠随机被分成对照组（C）、假手术（S）和模型组（M），又将每个组按照腹腔给药的不同分成生理盐水组（P）及加巴喷丁组（G）。最后一共6组：C+P：对照，腹腔注射生理盐水；C+G：对照，腹腔注射100mg/kg加巴喷丁；S+P：假手术，注射生理盐水；S+G：假手术，注射加巴喷丁；M+P手术结扎部位坐骨神经且腹腔注入生理盐水；M+G：手术结扎部分坐骨神经、腹腔注射加巴喷丁。依据MambergAB 的方法制作部分坐骨神经结扎模型。假手术组只将坐骨神经暴露出来。手术后两个星期，通过行为学观察以及Von Frey纤毛对足底机械性痛阈测量，明确模型是否成功，术后半月就开始实行腹腔给药，一天两次，分别在上午八点和下午四点，持续给药28d之后，将小鼠杀死并且保留大脑皮层。在此期间，同时做行为学观察以及机械性痛阈测量[4]。
1.3检测脑皮层基因表达差异，PCR验证
按照动物行为学变化和机械痛阈检测结果，选出S+P、M+P、M+G三组实行基因表达差异检测，随后按照芯片的结果和文献报道，从中挑出部分差异明显的基因实施PCR验证。
1.4统计学分析
采用SPSS18.0统计学软件实行统计学分析，计量资料采用均数±方差形式表示，并通过t检验，多个样本之间的均数通过方差齐性检验及方差分析[5]。
2.结果
2.1行为学以及机械痛阈的变化
S+P和S+G术后的3~5d步态基本上恢复正常，饮水和觅食等情况和手术前相同。M+P和M+G在手术后的2天发生了手术侧足趾并拢、外翻、并且拖足行走；左后肢持重，右后足经常性的悬空，偶尔出现抬起并且紧贴在腹部位置。采用Von Frey纤毛基于轻微的刺激后快速的抬足逃离，甚至出现了舔足和甩足的情况[6]。
各个组的小鼠在前机械性痛阈无明显差异。对照组和假手术组痛阈在整个观察中并无明显的差异。模型组术后的第3天出现了很明显的痛阈下降。腹腔给药了以后，M+P组始终保持很低的痛阈；但是M+G组的痛阈很快上升，同M+P组对比差异十分显著，同术前痛阈值对比无明显的差异[7]。
2.2基因检测的最后结果 依据国际的标准，上调超过2倍左右，下调低于0.5倍左右的基因被认为表达存在明显的差异。M+P同S+P对比，明显上调的基因有：CRHR2、GFRA3、TCA1等；明显下调的基因有BDNF，CB1N1、CRHR1、NR1I2、ZFP369等[8]。
M+G和M+P对比，出现明显上调的基因为ACCN1、ATP1B2、CACNB4、KCNN3、BDNF、CB1N1、CRHR1、IL 6ST等。明显下调的基因有CLCN3、KCNA5。
脑源性神经营养因子（BDNF），神经肽Y2受体同多效因子（PIN）都在坐骨神经部分结扎之后明显下调，在使用了巴喷丁治疗之后明显出现了上调。
2.3PCR验证结果
按照芯片结果，选择BDNF、NPY2R、PTN实行PCR验证，详情见下表1：
上述基因通过RT-PCR验证的平均符合了是11.55%。所选的基因变化趋势和芯片的结果一样，显示了芯片杂交结果是真实的。
表1 BDNF、PTN及NPY2R芯片结果和时实PCR验证
3、讨论
在研究神经病理性疼痛机制方面主要是借助动物模型。PSNL模型的机械痛敏在长达70d的观察中有着良好的稳定性。
此次研究内，假手术组的行为和痛阈，在短期内就恢复至正常，模型组手术后快速出现了异常的痛敏。持续观察两周后具有了良好的稳定性；由此可以认为神经病理性疼痛的动物模型建立十分成功。在腹腔给药之后，对照组和假手术组的机械性痛阈并未被巴喷丁所影响；生理盐水对模型组的疼痛无任何的缓解效果，但是加巴喷丁对模型组的疼痛十分有效。
芯片结果说明了模型组同假手术组对比，多基因表达明显出现下调，通过加巴喷丁治疗后，多基因表达明显上调。由于条件的限制，此次研究只选取了BDNF、NPY以及PIN实施PCR验证，同时还证实了它们的表达趋势和明显性差异及芯片的结果是相符的。
脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是1982年Barde等首先在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质。脑源性神经营养因子及其受体在神经系统广泛表达。一种小分子二聚体蛋白质BDNF结构、分布及信号转导BDNF分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为9.99，相对分子质量为3.5×103，主要由β折叠和无规则卷曲二级结构组成，含有3个二硫键，为一种碱性蛋白质。BDNF分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。是能够防止神经元死亡的碱性蛋白，在神经受到损伤后可以促进树突以及轴突的长出。存在保护和修复神经的功效。神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）是一种广泛存在于中枢和外周并维持内环境稳态的激素。在中枢，NPY有抗焦虑抗癫痫功能，并且具有抑制生殖、抑制肌肉兴奋、抑制交感兴奋的作用，导致人体的血压、心率、代谢下降，它还能够促进食欲，并因此成为节食药物的靶点。但是，外周的NPY具有正向的刺激作用，它和糖皮质激素以及儿茶酚胺共同增强应激反应。NPY在外周能诱导血管收缩、血管平滑肌增殖，导致血脂升高、糖耐受，释放脂肪细胞因子。PTN由于具备多种生物活性而被命名为多效因子。探讨PIN及疼痛研究当前还很少。此次研究显示，PTN在坐骨神经结扎之后的6周出现了明显的下调，加巴喷丁治疗后出现了明显的上调，显示了PTN不但能够参与加巴喷丁的镇痛机制，并且可以通过某种机制开启受损神经再生。
综上可知，加巴喷丁镇痛的脑机制有可能和脑源性神经的生长因子、Pleiotrophin和神经肽Y等基因上调存在关联。
参考文献：
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[3]皮倩，梁锐，潘灵辉，钱卫，林飞，李昌龙，刘悦.加巴喷丁对长春新碱致神经病理性疼痛小鼠大脑皮层脑啡肽的影响[J].广东医学，2012，（05）：587-590.
[4]陈绍辉，赵晶，罗爱伦，黄宇光，左萍萍，杨楠，郝文宇.加巴喷丁对神经病理性疼痛小鼠脑皮层组织内差异表达基因的影响[J].基础医学与临床，2007，（06）：652-655.
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[8] 戴秋云，董铭心，王菲等.新型α-芋螺镇痛多肽Eb1.6的结构、作用靶点、镇痛功能及药物发展研究[C].//第十一届中国生物毒素研究及医药应用年会论文集.2013：53-53.
注：基金项目：长沙市科技计划项目（K1308020-31）：联合应用神经妥乐平和加巴喷丁对L5-脊神经结扎大鼠的镇痛作用
论文作者:丁继承1,陶力中1,沈华1,杨再安（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2017年第2期
论文发表时间:2017/3/22
标签：基因论文; 模型论文; 小鼠论文; 差异论文; 疼痛论文; 神经病论文; 生理盐水论文; 《航空军医》2017年第2期论文;