孙丽[1]2005年在《pESP15b/pARA-SP6表达载体的构建及应用研究》文中认为本研究旨在建立高效表达目的蛋白的原核表达载体系统pESP15b/pARA-SP6。在Novagen公司专利产品pET11a的基础上进行改造组建,即用SP6启动子替代T7启动子,并引入组氨酸标签(His tag)从而构建表达载体pESP15b。又以质粒pBlueScript(SK+)和pGro7为基础,构建另一个表达载体pARA-SP6。从而建立原核表达载体系统pESP15b/pARA-SP6。 为了使pESP15b/pARA-SP6表达载体能够最大限度地表达目的蛋白,以碱性磷酸酶(ShAP)为目的蛋白,对载体的宿主和培养温度进行了探讨。为了考察pESP15b/pARA-SP6表达系统的蛋白表达效果,以传统的原核表达载体pET28(a)System和最新上市的原核表达载体CSP System(pColdI载体)作为对照,以碱性磷酸酶(ShAP)为目的基因,对目的蛋白的表达量、可溶性目的蛋白的含量和蛋白活性等方面进行了比较。 通过SDS-PAGE、Western blotting、pNPP活性测定以及ImageMaser 1D Elite V3.01软件等分析结果表明,所构建的原核蛋白表达载体pESP15b/pARA-SP6,在蛋白酶缺陷型大肠杆菌BL21宿主中目的蛋白的表达量最高;在37℃、30℃和25℃条件下分别诱导表达,目的蛋白的表达量随温度的降低而明显增加,37℃培养条件下目的蛋白ShAP占蛋白表达总量的21.2%,而25℃时则达到32.5%;25℃培养条件下可溶性目的蛋白占蛋白总量的65.2%,为37℃时的2倍左右;目的蛋白的活性也随培养温度的降低而明显提高,37℃培养条件下为48.3U/g菌体,而25℃时为1117.6U/g菌体,活性提高约25倍。 作为对照的pET28(a)和pColdI蛋白表达体系,在最佳表达条件下,虽然目的蛋白的表达量与pESP15b/pARA-SP6表达体系无很大差异(分别为28.8%和32.85%),但可溶性目的蛋白含量只占蛋白表达总量的30%左右,明显低于pESP15b/pARA-SP6蛋白表达系统。蛋白活性也明显低于新构建的pESP15b/pARA-SP6表达体系,分别为247.8U/g菌体和452U/g菌体,只是pESP15b/pARA-SP6载体系统的1/5和1/2。
蔡启锋[2]2004年在《原核细胞非融合可溶性表达载体的构建及其应用》文中研究指明以pET28a为母核，将pET32a的多克隆位点(multiple cloning site，MCS)替换到pET28a上，构建质粒pSYPU-0。将编码蛋白H的基因克隆到质粒pSYPU-0的Bpu11021酶切位点处，构建表达载体pSYPU-1a。将镇痛抗肿瘤肽(Analgesic-antitumor peptide，AGAP)作为表达载体pSYPU-1a的表达模型，构建重组质粒pSYPU-1a-AGAP，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析诱导表达的宿主细胞的上清和沉淀。结果表明外源基因得以表达，但大部分表达产物存在于沉淀中。将蛋白H的基因克隆到质粒pSYPU-0的EcoR I与SacI双酶切位点处，构建表达载体pSYPU-1b。同样以AGAP作为pSYPU-1b的表达模型，构建重组质粒pSYPU-1b-AGAP，同样IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析诱导表达宿主细胞的总蛋白、上清和沉淀。结果表明，AGAP得到可溶性表达，95％以上的表达产物存在于上清液中。 构建的表达载体pSYPU-1b转化BL21(DE3)，涂布于LB-Kan琼脂糖平板，挑取单菌落，在连续传116、232、348、464代后，质粒的突变率为0.003％、0.013％、0.017％、0.021％，质粒的丢失率为1.8％、5.0％、9.4％、17.23％。结果表明，pSYPU-1b具有较稳定的遗传性。 重组质粒pSYPU-1b-AGAP转化至表达宿主细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，离心收集菌体细胞，超声破碎后离心得上清，Folin-酚法测得上清总蛋白为120.9mg／L发酵液。上清液经Chealting Sepharose 4B Fast Flow和Q-Sepharose Fast Flow分离纯化，最终每升发酵液得到电泳纯的表达产物2.2mg。
林玲[3]2006年在《中国华东葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因的原核表达及抗体制备》文中认为葡萄白粉病是危害世界葡萄生产的主要真菌病害,起源于北美洲,目前该病的分布范围已经遍及全世界,而且目前世界上主栽的品质优良的欧洲葡萄品种绝大多数不抗该病,因此,该病对世界的葡萄生产造成了严重的经济损失。我国是葡萄属植物的重要原产地之一,而且我国的野生葡萄对真菌病害具有较强的抗性。随着现代生物技术的高速发展,利用基因工程手段可将抗病基因直接导入感病品种,从而育成抗病性明显提高而原有的经济性状不发生分离的转基因新品种,克服了传统方法的缺点。在转基因之前,有必要在体外对目的基因的表达特性及功能进行相应的分析,从而为转基因植株的检测、安全性评价奠定基础。本研究的目的旨在体外对葡萄抗白粉病相关基因-抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因进行相应的研究。根据已克隆的中国葡萄属野生种抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因序列设计并合成特异性PCR引物,以华东葡萄白河-35-1的cDNA第一链为模板,通过PCR扩增获得APX基因,并进一步将之克隆在中间载体pGEM-T easy上。用限制性内切核酸酶从中间载体上切下目的基因,将之插入到表达载体pGEX-4T-1上获得重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21并用IPTG进行诱导,得到GST-APX融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的35%,且以可溶和包涵体两种形式存在。可溶性蛋白经GST亲和树脂纯化后可得到高纯度的目的蛋白。融合蛋白作为抗原免疫家兔制备得到多克隆抗体。本实验取得如下研究结果1成功地将扩增得到的目的基因APX基因与克隆载体pGEM-T easy连接并转化到宿主菌DH5α中,构建了重组克隆载体pGEM-T/APX。2从克隆载体上切下目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1相连,构建了APX的原核表达载体pGEX-4T-1/APX,根据序列分析表明,目的基因按正确的阅读框架插入到表达载体中。筛选出阳性重组体,用IPTG诱导,表达的蛋白产物通过12% SDS-PAGE分析,证明APX基因在大肠杆菌中成功的得到了表达,表达产物的分子量约为55kDa.
黄鹤[4]2003年在《牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆、表达及表达产物的纯化和应用》文中提出肠激酶(enterokinase, EK)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,可沿胰蛋白酶原序列中(Asp)4 –Lys的羧基端切下，从而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、羟胺等化学试剂,肠激酶具有非特异性切割极少，反应条件宽泛，切割位点在全部识别序列之后，切出的目标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。本文首次对中国北方黄牛肠激酶基因催化亚基（EKL）编码序列的cDNA进行了克隆并分别在大肠杆菌与毕赤酵母中实现了表达，得到如下结果：首先从市售中国北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段，将此片段克隆于pGEM?-T Easy载体中，经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后，进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致，得到了编码正确的牛Enterokinase催化亚基基因全序列。然后利用基因重组技术将编码牛EKL的基因片段插入pET39b融合型表达载体，转化到大肠杆菌E.coli BL21（DE3）pLysS中，首次用融合的方式在原核系统中成功表达了带（His）8亲和标记的重组肠激酶催化亚基。经条件优化后，重组肠激酶催化亚基融合蛋白DsbA-EKL-（His）8可溶性表达量占裂菌上清总蛋白的18%以上。经镍亲和层析分离纯化后自催化切割产生的rEKL-（His）8达3.5mg/g湿菌，比活力1.34×107U/mg。与此同时，本文利用毕赤酵母表达系统对EKL基因编码序列进行了在真核细胞中的表达。将目的基因克隆到穿梭质粒pPIC9中，线性化后转染酵母Pichia pastoris，使之获得了分泌表达，表达量占培养液上清的32.8%。经大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）亲和层析纯化后得到活性rEKL 10.9ug/mL发酵液，酶的比活力2.88×107U/mg。本文还首次将融合蛋白DsbA-EKL-（His）8的自催化切割与酶解融合蛋白Trx-IL-11的过程偶联，酶切体系经一步镍亲和层析后rhIL-11纯度大于95%，为融合蛋白后处理工艺构建了一个崭新的技术平台，是我国生物制药领域在融合表达基因工程产品这一研究方向的先期工作。
董红霖[5]2005年在《抗人肝癌基因工程抗体单双价嵌合Fab的构建和在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达》文中提出目的: 抗体的高效表达是制备有应用价值的治疗性抗体的重要前提,目前小分子抗体在基础研究、临床诊断和治疗中的广泛应用使之成为研究热点。为了提高产量并获得高结合活性的抗人肝癌嵌合Fab抗体,我们利用大肠杆菌和巴氏酵母高效表达抗人肝癌嵌合Fab和F(ab’)_2两种形式的抗体形式,并分析其与相应抗原的结合活性,进而明确基因工程抗体大规模培养的可行性。产物经过鉴定和纯化,得到高表达的抗人肝癌嵌合Fab并为其下一步应用研究打下基础。 方法:根据研究目的,实验内容共分为四个部分: 1 抗人肝癌基因工程双价嵌合Fab抗体两种形式的载体构建和原核非融合表达及复性 以克隆载体pET32/cFab为模板,用设计的含有相应酶切位点的特异引物扩增cL、cFd基因,,并分别通过PCR延伸直接得到了Linker32和Lingker21连接序列,之后分别连接成两对匹配序列:①cL-Linker32-cL和cFd-Linker32-cFd,②cL-Linker21-cL和cFd-Linker21-cFd,之后对以上CL和cFd片段酶切,将cL序列克隆入原核表达载体pET21a后,而将cFd序列克隆入
曹如星[6]2012年在《拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达》文中提出植物在生长过程中，会遇到诸如干旱、低温和高盐等非生物逆境胁迫，此时植物会产生一系列的生理生化反应，感知、传递逆境胁迫信号，对环境刺激作出反应。在逆境胁迫下，植物表达的基因分为两类:（1）功能蛋白和酶类，如LEA，抗冻蛋白，解毒酶等;（2）传递信号和调控基因表达的转录因子，如bZIP，MYC，DREB等，其中转录因子对基因的转录调控起至关重要的作用。植物通过复杂的信号传导过程，将环境变化转变为细胞内部的信息，经过一系列磷酸化级联反应，最终激发转录因子，启动基因的转录和表达来抵御外界的胁迫伤害。ABA作为一种重要的植物激素和生长调节剂，介导了高等植物在营养生长阶段对各种外界环境的响应和适应。拟南芥ABI5是一个响应ABA信号的bZIP类转录因子，能开启一系列抗性相关基因的表达，在信号的传递、相关功能基因的表达调控以及胚胎发育阶段的调控中起着重要的作用，调节植物的生长发育和对非生物胁迫的耐性。大肠杆菌因为遗传背景清楚，代时短，易控制成为生产重组蛋白的主要工程菌。目前在利用原核系统表达重组蛋白的过程中常常遇到的几个难题是重组蛋白常常以包涵体的形式存在，表达量低和容易降解等。本研究克隆了拟南芥abi5基因，并将其连接于pET-32a载体上，构建融合蛋白表达载体，转化大肠杆菌BL21系列菌株，并对其进行诱导表达及表达条件的优化，主要结果如下:1.拟南芥abi5基因的分子克隆：根据NCBI数据库中收录的拟南芥abi5基因的cDNA序列及pET-32a载体序列设计上游引物和下游引物，用Pfu DNA聚合酶通过RT-PCR的方法从拟南芥RNA中扩增得到了拟南芥abi5基因。将其与克隆载体pMD-T Vector连接，得到重组质粒，命名为pUC19-ABI5，并进行测序。测序结果表明所克隆的拟南芥abi5基因全长1323bp，总共编码440个氨基酸。2.拟南芥abi5原核表达载体的体外构建及转化：按照设计在引物上的内切酶位点，用EcoR I酶切割重组质粒pUC19-ABI5，将得到的abi5基因克隆至pET-32a表达载体的多克隆位点，构建正确的原核表达载体pET32a-ABI5，根据对其基因序列的分析，选择经改造的BL21Star（DE3）作为宿主细胞进行转化，获得BL21/pET32a-ABI5原核表达菌株。3.原核表达鉴定及表达条件的优化：筛选阳性克隆进行原核表达，经SDS-PAGE电泳检测结果表明拟南芥abi5基因已经结合在pET-32a表达载体上，并形成了融合蛋白，该蛋白可在所选原核细胞中良好表达，并主要以可溶性形式存在，分子量约为67kDa。对BL21/pET32a-ABI5诱导表达的IPTG终浓度，温度及诱导时间各条件进行了优化，经SDS-PAGE电泳分析发现各条件下目标融合蛋白均主要以可溶性形式表达。其中在实验所设各IPTG终浓度和各温度条件下蛋白表达量没有明显的差异，随诱导时间的延长至9h,目标融合蛋白含量明显下降。实验得到目的蛋白可溶性表达的最优条件为：IPTG终浓度为0.3mmol/L，30℃下诱导3h。拟南芥abi5基因的克隆分析和表达为今后进一步研究该转录因子的调控机理奠定了重要的基础。
吴伊丽[7]2003年在《人骨形态发生蛋白4成熟肽DNA序列的克隆与表达》文中认为BMP-4(bone morphogenetic protein 4)是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一，具有促进软骨和骨组织形成的作用，在治疗骨折和骨缺损等方面具有极大的临床应用价值。因此本研究利用基因工程生产人BMP-4成熟肽。 采用细胞裂解液法自毛发提取基因组DNA，通过PCR法扩增出编码人骨形态发生蛋白4(BMP-4)成熟肽的DNA序列，克隆到载体pUCm-T中。在此基础上，将编码人骨形态发生蛋白4(BMP-4)成熟肽的基因片段分别克隆到pBV220、pGEX-3X和pET42a载体上进行原核表达，并且克隆到pIC9酵母分泌型表达载体上，为BMP-4的真核表达奠定基础。 重组的表达载体pBV220／hBMP-4转化到大肠杆菌DH5α中诱导表达。经条件优化后，非融合蛋白产量为29.7mg／L培养基，主要存在于包涵体中，包涵体溶解复性后占包涵体总蛋白的85.5％，占菌体总蛋白的17.4％。经Westernblotting鉴定在成熟肽相应部位有特异条带，体外实验证明复性后的重组bBMP-4具有生物活性。 重组质粒pGEX-3X／hBMP-4和pET42a／hBMP-4分别转化到大肠杆菌DH5α和E.coliBL21(DE3)pLysS中诱导表达。经条件优化后，可溶性融合蛋白产量分别为5.85mg／L培养基和18.00mg／L培养基，经Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化后并在Xa因子作用下，产生N端多叁个氨基酸的重组hBMP-4成熟肽和完整的重组hBMP-4成熟肽。通过Western blotting证明在成熟肽相应部位有特异条带，体外实验亦证明重组hBMP-4具有生物活性。 本实验结果显示： 1、自发根可以提取出满足PCR需要的DNA；产天津医科大学博士学位论 2、国人bmP一4基因中编码hBMp一成熟肤的DNA序列，与白种人的序列 无差别; 3、利用原核非融合表达系统成功的表达了重组hBMP一4成熟肤，复性后的 重组蛋白有良好的生物活性; 4、利用原核融合表达系统成功的表达了重组hBMP一4成熟肤，经切割去除 担体蛋白后具有良好的生物活性;
赵清涛[8]2007年在《1．人源肝癌单链抗体的表达及功能研究 2．COX-2在肝癌诱导肿瘤新生血管形成中作用机制研究》文中提出利用细胞融合技术成功制备的杂交瘤单克隆抗体(mAb)在疾病的预防和诊治等方面显示出了重要作用,但因为鼠源性抗体在人体应用时容易诱发HAMA,产生不良反应。抗体库技术为制备高亲和性的人源抗体提供了有力工具。该技术无需免疫即可制备全人源性抗体,可有效避HAMA。我实验室利用噬菌体抗体库技术,构建了全人源肝癌单链抗体噬菌体库,并筛选到了一株肝癌特异性单链抗体。目的构建单链抗体的原核表达系统,实现蛋白的高效表达,并鉴定其与肝癌组织结合的特异性及亲和力,为其下一步应用研究打下基础。方法1全人源肝癌单链抗体载体构建和原核非融合表达及复性,与肝癌细胞特异性结合鉴定。以肝癌单链抗体噬菌体载体pDAN5/ScFv-D25为模板,利用重迭延伸PCR,将VL和VH基因以(Gly4ser)3 linker连接成单链,将PCR产物连接入T载体并测序,将目的片段酶切插入表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测表达情况。对包涵体进行溶解、变性、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及亲合能力。2全人源肝癌单链抗体(D25)在大肠杆菌中的分泌表达及与人体肝癌组织特异性结合鉴定;酶切pGEM/D5载体,酶切片段插入表达载体pET32a+的酶切位点中,转化E. coli BL21trxB,蛋白表达, SDS-PAGE电泳检测表达情况。应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。利用63例肝癌组织芯片、5例正常肝组织及3例胰腺癌组织,免疫组化方法检测D25与人体肝癌组织特异性结合情况。结果1构建了D25原核表达载体,经IPTG诱导,成功获得了表达,表达蛋白相对分子质量32KD左右。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,细胞ELISA鉴定能与SMMC-7721细胞特异性结合,亲和常数为:3.6×107 L/mol。2构建了pET32/d25单链抗体载体,转化E. coli BL21trxB诱导表达后,成功获得目的蛋白与TrxB蛋白融合可溶性表达,表达产物主要存在于周质腔中。SDS-PAGE电泳检测结果表明:融合蛋白分子量为42KD左右。ELISA检测,表达产物与SMMC-7721细胞有很好的结合活性,利用组织芯片行免疫组化结果显示其与5例正常肝组织及3例胰腺癌组织无结合,而与人肝癌细胞结合阳性反应率68.3%(43/63),与前两组比较差异显着。结论通过噬菌体抗体库筛选得到的肝癌特异性单链抗体可以通过原核表达系统,实现蛋白的高效表达;肝癌特异性单链抗体能与肝癌SMCC-7721细胞系及人肝癌组织特异性结合,并且有较强的亲和力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。在亚洲、非洲地区,在患恶性肿瘤病人中,肝细胞肝癌(HCC)是导致患者死亡的主要原因,尽管目前对肝癌可以采取手术切除、动脉插管化疗、放疗及局部治疗等方法,但效果欠佳,人们一直在寻找一种有效治疗肝癌的途径,抑制肝癌血管生成是治疗肿瘤的新策略。目的肿瘤新生血管形成在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。本实验主要探讨COX-2在肝癌及其诱导血管形成过程中的作用机制及途径。方法1.构建COX-2小干扰RNA(siRNA)表达质粒,设计有小发夹结构的2条COX-2 siRNA对应模板DNA序列,煺火处理后克隆至pSIREN-Shuttle质粒,构建重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA,同样方法构建阴性对照质粒pSIREN/negative siRNA。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,酶切鉴定,再将pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative siRNA转染HuH-7细胞系,构建稳定转染细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot检测COX-2表达。采用PGE2试剂盒检查细胞培养液PGE2的变化情况。2.利用基因芯片技术观察COX-2特异性抑制剂SC-58635应用后HuH-7细胞系所表达的与血管形成相关的22条基因的变化情况。根据基因芯片法抽提细胞mRNA,进行反转录cDNA探针,与GEArray Q Series Human CancerPathway Finder Gene Array芯片进行杂交,并对结果进行分析。3.分别利用选择性COX-2抑制剂(SC-58635)和COX-2siRNA抑制HuH-7细胞系COX-2的表达,收集抑制前后HuH-7细胞培养液,研究以上培养液在体外对人脐静脉血管内皮细胞增殖能力、迁移能力及细胞小管形成能力的影响,以及在体内对血管生成的影响。结果1.酶切电泳证实,重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative siRNA载体构建成功,转染HuH-7细胞后,COX-2siRNA可以显着抑制HuH-7细胞的COX-2 mRNA及蛋白的表达,而对COX-1表达无影响。COX-2 siRNA抑制COX-2表达后可以使PGE2的合成量下降约72%。2.我们通过基因芯片技术观察了HuH-7在应用特异性COX-2抑制剂SC-58635后, 22条血管生成相关基因表达的变化情况,结果显示,血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、原纤维细胞生长因子2(FGF2)、血管生成素1(ANGPT1)及血管生成素2(ANGPT2)等促血管生成因子在COX-2抑制后表达下降超过2倍,VEGF下降达到4.5倍。3.选择性COX-2抑制剂SC-58635和COX-2siRNA抑制HuH-7细胞系COX-2的表达后,HuH-7细胞培养液明显抑制了HUVEC的增殖能力、迁移能力及细胞小管形成能力,在体内的血管生成也同样受到抑制。并且在细胞培养液中加入外源性PGE2后可以部分逆转这种对血管生成的抑制作用。结论体内及体外的血管形成实验均证实,COX-2抑制剂及COX-2 siRNA均可以通过抑制COX-2的表达从而抑制肝癌诱导的肿瘤血管形成。在HuH-7诱导血管形成过程中,COX-2促进PGE2合成,PGE2直接作用于血管内皮细胞促进血管形成。除了COX-2通过促进PGE2合成直接促进血管形成途径外,COX-2还可以通过促进PGE2的释放,刺激血管内皮生长因子等血管形成因子合成增加,促进血管形成。本实验说明:COX-2是肝癌诱导血管形成过程中的关键因素,COX-2使通过诱导PGE2合成,PGE2通过直接刺激血管形成以及促进血管形成相关因子的表达间接促进血管形成两种途径起作用。提示COX-2抑制剂在治疗肝癌反面是一个很有前途的化学药物。
剧海[9]2003年在《新型人降钙素基因在大肠杆菌中的表达》文中研究说明降钙素是一种重要的肽类激素，在肌体的钙磷代谢，骨的形成、分化和发育等相关的诸多环节中起着关键性作用。降钙素在临床上应用十分广泛，但其自然来源有限，必须以基因工程手段进行大规模生产才能满足需求。原核系统中表达出的降钙素无法完成C-末端的酰胺化，尚需体外处理才能具有较强的生物活性。 本文利用PCR技术扩增新型人降钙素基因编码序列hCT(将编码C-末端脯氨酸的密码子换为编码谷氨酰氨的密码子)，将此基因克隆入大肠杆菌非融合型表达载体pBV220及融合型表达载体pET42a中。重组表达载体pET42a／hCT转化到大肠杆菌BL21(DE3)plys中诱导表达，经SDS-PAGE证实细胞裂解物中含有与预期位置相同的融合蛋白，经Western Blot鉴定证明此融合蛋白具有人降钙素的免疫活性。表达条件优化后，可溶性蛋白的表达量占胞内总蛋白的10％。经超滤浓缩后，融合蛋白在Xa因子作用下产生重组的新型降钙素，进一步分离纯化得到该蛋白的初级纯品。大鼠体内降血钙试验表明新型降钙素具有降血钙活性。
杨芳[10]2005年在《人内皮抑素基因的克隆、重组表达、纯化和活性研究》文中指出研究背景 子宫内膜异位症(Endometriosis,简称内异症)是一种育龄妇女的常见病,发病率逐年上升,已达10%-15%,35%-50%的不孕妇女患有该病,由其引起的痛经、不孕、性交疼痛等症状严重影响着妇女的生活质量。内异症真正的病因和发病机制尚不明确。现有的治疗方法局限于激素类药物、手术或手术联合药物等,虽对缓解症状,提高妊娠率有一定帮助,但疗效有限,副作用大,复发率高。近年来的研究表明,脱落的子宫内膜附着在腹膜或其它部位时,异位内膜本身及其周围组织新的血供的建立和维持,是异位内膜种植存活和子宫内膜异位症发生的基本条件。血管生成机制已成为内异症公认的重要发病机制之一。因此,从血管生成理论出发,寻找内异症新的治疗途径,降低内异症复发和减少毒副作用已成为临床的迫切需要。内皮抑素作为目前已知最强的内源性血管形成抑制因子,在肿瘤的治疗方面已有大量研究及应用,但在内异症的治疗研究领域鲜有报道。目的 本研究旨在通过分子生物学技术,从胎肝组织克隆人内皮抑素基因,在大肠杆菌中表达,纯化后得到有生物学活性的重组蛋白质产物,为后续的动物实验奠定基础。 方法与结果 1.采用RT-PCR技术从胎肝中克隆人内皮抑素基因全序列,构建人内皮抑素
参考文献：
[1]. pESP15b/pARA-SP6表达载体的构建及应用研究[D]. 孙丽. 大连理工大学. 2005
[2]. 原核细胞非融合可溶性表达载体的构建及其应用[D]. 蔡启锋. 沈阳药科大学. 2004
[3]. 中国华东葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因的原核表达及抗体制备[D]. 林玲. 西北农林科技大学. 2006
[4]. 牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆、表达及表达产物的纯化和应用[D]. 黄鹤. 天津大学. 2003
[5]. 抗人肝癌基因工程抗体单双价嵌合Fab的构建和在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达[D]. 董红霖. 第四军医大学. 2005
[6]. 拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达[D]. 曹如星. 兰州理工大学. 2012
[7]. 人骨形态发生蛋白4成熟肽DNA序列的克隆与表达[D]. 吴伊丽. 天津医科大学. 2003
[8]. 1．人源肝癌单链抗体的表达及功能研究 2．COX-2在肝癌诱导肿瘤新生血管形成中作用机制研究[D]. 赵清涛. 第四军医大学. 2007
[9]. 新型人降钙素基因在大肠杆菌中的表达[D]. 剧海. 天津医科大学. 2003
[10]. 人内皮抑素基因的克隆、重组表达、纯化和活性研究[D]. 杨芳. 第一军医大学. 2005
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