薛万新[1]2001年在《白菜类蔬菜叶球发育相关基因的分子克隆及其转基因植物研究》文中提出根据大白菜BcpLH基因设计一对引物，以小白菜基因组DNA为模板，进行BcpLH同源基因扩增，扩增产物命名为BccLH基因。从基因组、cDNA、氨基酸、蛋白质结构等多个方面比较了大白菜BcpLH基因和小白菜BccLH基因的差异。BccLH基因序列全长为1544bp，与大白菜BcpLH基因序列同源性96.1％。Southern杂交结果显示，小白菜基因组中只有1个拷贝的BccLH基因。该基因与大白菜中BcpLH基因一样，也包含2个内含子和3个外显子，BccLH基因与大白菜BcpLH基因比较，第叁个外显子的基因序列存在较大的差异，发生多处碱基替换或者缺失，尤其是在ATG下游1427-1448bp处，有连续21个碱基缺失(对大白菜而言)，在其它叁个位置还分别有1、2、3个碱基缺失。此外，第叁个外显子内共有28处发生了碱基替换。序列其它位置则相对保守。因此，小白菜与大白菜在结球性状上的差异很可能是由于第叁个外显子内碱基的这种变化引起的。 BccLtt基因的cDNA序列为一全长cDNA，读码框包含852个碱基，比大白菜多出27个碱基。该cDNA与大白菜BcpLH基因cDNA同源性分别为93.3％，由BccLtt基因cDNA推导的氨基酸序列全长为283个氨基酸，比大白菜多9个氨基酸，其中从第248个氨基酸处开始，大白菜出现有7个连续的氨基酸序列缺失，即-P-E-N-A-E-T-M，此外，在其它一些位置还有12个氨基酸代换和2个氨基酸插入。两个基因的蛋白质序列之间的同源性为92.9％。通过数据库进行同源性比较，除了大白菜和结球甘蓝以外，还没有发现与BccLH基因高度同源的已知基因。但与大白菜一样，BccLtt基因的多肽链中有2个片段与双链RNA结合结构域(DRBM)一致，只是在第二个片段存在有一个氨基酸的差异。BccLH的两个DRBM与人类RNA结合蛋白TRBP的对应区域分别有51％和59％的一致性。BccLH基因的蛋白质二级结构与BcpLH基因蛋白质二级结构在第250个氨基酸之前完全一致，此后存在一定的差异。这也可能是导致大白菜与小白菜在发育过程中产生不同发育方向的重要原因之一。 根据BcpLH同源cDNA序列的同源性绘制了大白菜、小白菜、油菜、拟南芥、甘蓝、水稻等6种作物的8个同源基因的进化树。进化树与普通植物学分类基本一致，并从分子水平上揭示了它们的进化和分类关系。 通过非组织培养遗传转化方法将BcpLH正义基因和BcpLH反义基因分别转入小白菜和大白菜，研究BcpLH基因对叶球形态发生的调节功能。大白菜通过真空抽滤法转化频率达到0.63％；小白菜子房注射法转化频率达到1.8％。组培法初步筛选的抗性苗切去基部后，在MS+NAA0.5mg/L的培养基上可实现大量生根，生根苗移栽成活率大大提高。采用水培法筛选， 西北农林科技大学博士学位论文2并通过移栽后复选是一个较好的筛选方法，该法操作简便，单位时间筛选种子数多，筛选效率高。水培法筛选大白菜转化体时，卡那霉素适宜的浓度为 50ug／thl，小白菜为 40Ug／llil。所得抗性苗中7株经分子检测，有4株被确定有外源基因的导人。转p正义基因大白菜有提早提早包0的趋势，其性状有待进一步观察。转BoLH反义基因大白菜出现先期抽至变异。转正义基因小白菜无明显表型变化。 大白菜原位真空抽滤法遗传转化影响因素的研究表明，初花期的转化频率最高。大白菜种于经过 2℃低温处理 20天，并于 12月 8日播种，60天后可建成原位真空抽滤转化的适宜苗态。大白菜和小白菜经2M305断续抽滤，转化频率相对较高。不同的菌液浓度处理间抗性苗获得率无明显规律。真空抽滤转化中，渗人培养基中蔗糖是必需的，浓度为5％时转化频率最高。表面活性剂 Silwet L－77对转化频率有较大的影一，渗入培养基中用 0．02％Silwet L－77与 5％蔗糖配合，转化频率达2％。28℃转化效果明显优于20℃。去顶苔处理、重复抽滤等对转化频率的影响不大。
韩笑[2]2012年在《白菜浸花法转基因技术研究》文中指出白菜（包括结球白菜和不结球白菜）在亚洲特别是中国、日本和韩国是最重要的蔬菜。白菜的生产过程易受虫害侵扰，且需水量大。通过基因工程导入外源基因，可以创造出白菜的新种质，进而从根本上改变白菜种质资源。农杆菌介导的浸花（floral-dip）转化方法是近年发展起来的一种较简便的不依赖组织培养的转基因方法。该方法的优点在于可以避开组织培养和继代培养，直接获得转基因的种子，而且相对于真空转化，对仪器设备要求较低。因此，该转化方法适用于难以进行组织培养和离体再生的植物。本研究以携带pBBB-intron-gus质粒的农杆菌C58为转化用工程菌，对5个结球白菜品系（08-1083-2，08-1084-2，02-311，02-507，06-940）和不结球白菜四九菜心进行农杆菌介导的浸花转化，以期为探索功能基因导入白菜活体的方法提供一定的理论根据。其中大白菜品系08-1083-2收获了14棵抗性株，经鉴定后证明没有获得转化株，不结球白菜四九菜心获得4棵抗性株，GUS检测为非真实转化株。为了进一步探讨农杆菌通过浸花处理难以进入白菜花器官的可能原因，对拟南芥和四九菜心两种材料不同发育阶段的花蕾进行形态及解剖观察，以研究二者在花发育节律及形态结构上的差异。结果显示，两种材料均是幼嫩子房时成开口杯状，随着花蕾长大，心皮逐渐闭合；调查新生花蕾在花序总花蕾中所占的比例，四九菜心为20%，而拟南芥高达62.6%；综合形态及解剖观察结果，可以推断花蕾期心皮闭合至开花的时间，四九菜心约为15天，而拟南芥仅需3天。有研究指出，开放的心皮形成的孔道可能是是农杆菌进入供试材料体内的途径之一，而浸花法转化发生的部位大多在未成熟花蕾中。由此可以推断，过早闭合的心皮可能是造成农杆菌不能顺利进入四九菜心的原因之一，而新生花蕾占总花蕾比例较低造成四九菜心转化率的降低。为了证实这一推测，本研究对不结球白菜引心360和拟南芥进行了平行浸花实验，分析供试材料花器官中农杆菌数量的差异，试图阐释白菜转化率低的原因。首先以含0.225g/L ppt除草剂Basta的溶液喷施处理株收获的种子，对照材料获得了抗性株（3株），其植株转化率为20%，而引心360没有获得抗性株。GUS检测证明拟南芥抗性株中外源基因得以表达。然后采用细菌平板培养法，研究处理材料花蕾内农杆菌的数量差异。结果表明，在浸花处理后的6天内，在添加拟南芥花蕾提取物的筛选平板上，仍能培养出60-900的菌落数（s/g），而在加白菜花蕾提取液的平板上，菌落形成单位为0。这说明农杆菌很难通过浸花处理进入白菜花器官内，在一定程度上解释了为何白菜的转化频率远远低于拟南芥。
参考文献：
[1]. 白菜类蔬菜叶球发育相关基因的分子克隆及其转基因植物研究[D]. 薛万新. 西北农林科技大学. 2001
[2]. 白菜浸花法转基因技术研究[D]. 韩笑. 曲阜师范大学. 2012
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