陈敬[1]2004年在《VEGF在Lewis肺癌微转移灶形成中的作用及机制研究》文中研究说明肺癌是常见恶性肿瘤之一,严重着威胁人类的健康。早期诊断肺癌转移,尤其是肺癌亚临床转移和微转移(micrometastasis),对于提高肺癌的治愈率和生存率至关重要。目前有关肺癌微转移机理的研究日益受到重视,良好的实验模型是准确揭示癌细胞的侵袭、转移生长特性,进而阐明其机理的基础。绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein, GFP)是近年来发现的一种化学性能稳定的分子,己经在多种细胞中获得表达,用于定位蛋白及示踪细胞等研究。肿瘤血管生成及侵袭是肿瘤转移的必要条件。血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelial growth factor ,VEGF)是重要的血管生成因子,在人体多数细胞均有表达,通过其受体 FLT 和 KDR 诱导新生血管形成。sFLT 是其可溶性受体,为 VEGF 功能抑制剂。近年来研究发现,VEGF 在许多实体瘤中过量表达,与肿瘤血管生成、生长和转移密切相关。但 VEGF 与肿瘤微转移的关系尚未见报道。肿瘤转移是一系列复杂的事件,突破基底膜是肿瘤细胞进行浸润和转移的最初和最关键阶段,细胞外基质的降解是突破基底膜的必须环节。基质金属蛋白酶系统(matrix metalloproteinase,MMP)是组织基底膜和细胞外基质的主降解者,因而 MMP在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用,其中以基质金属蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的作用尤为重要。近来对血液性肿瘤和卵巢癌组织和等研究表明,VEGF 可通过上调肿瘤细胞MMP-2、9 的表达,继而促进肿瘤侵袭。VEGF 在肺癌中有无此作用尚未见报道。本研究并以 Lewis 肺癌细胞(lewis lung carcinoma,LLC)为研究对象,利用基因克隆技术,构建绿色荧光蛋白标记的含鼠 VEGF 或 sFLT 全长序列的真核双表达载体,用脂质体法转染高转移 Lewis 肺癌细胞株,观察转染前后的细胞系对细胞生长、血管生成能力及基底膜侵袭能力的改变,并检测 VEGF 对金属蛋白酶 MMP-2、MMP-9 表达的影响;将转染后的细胞接种于 C57BL/6J 纯系小鼠,复制实验性和自发性微转移模型,观察 VEGF 对微转移形成的影响和相关因子表达的变化。最后还进一步从临床观察肺癌患者血清 VEGF 的水平与微转移的关系。主要结果如下:1. 以绿色荧光蛋白为报告基因,构建重组质粒转染鼠 lewis 肺癌细胞,利用肿瘤细胞侵袭实验、RT-PCR 、Western blot 等技术,观察转染后 VEGF 和 sFLT 在体外对 lewis 肺癌细胞株(LLC)侵袭和血管生成能力的影响。发现: 5
郭伟华[2]2009年在《血管生成在Lewis肺癌生长转移过程中的作用》文中指出背景和目的肿瘤的生长、侵袭和转移是一个多因素参与、多基因改变和多步骤演进的复杂过程,它与肿瘤细胞本身和宿主基质细胞之间的相互作用、肿瘤血管生成和宿主免疫系统的反应等有关,在众多的因素中肿瘤诱导的血管生成倍受重视,目前认为它与肿瘤生物学行为的关系甚为密切。大量的研究证实,肿瘤在新生血管形成前,只能达到大约1-2mm~3的大小,而且少有远处转移灶形成。然而在新生血管形成后,肿瘤会成倍的增长,转移的几率也会随之增加。由此可知肿瘤血管生成不仅对原发瘤本身的生长至关重要,同时也是肿瘤呈侵袭性生长和发生远处转移的必备条件。肿瘤的血管生成是一个涉及基底膜降解、内皮细胞迁移、增殖的复杂过程。所有这些步骤均受多种生长因子及其受体、细胞因子调控,其中血管活性调节因子(血管生成促进因子和抑制因子)发挥着中心调控作用。当血管生成促进因子和抑制因子两者间的平衡被打破时,即会启动肿瘤血管生成的过程。在各种血管活性因子中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的作用最强的促血管生成因子,它能特异性地直接或间接作用于血管内皮细胞,进而促进血管新生。有研究发现,它在多种肿瘤的生长、转移中都起到重要作用。而目前调控VEGF表达的确切机制还不甚清楚,主要认为它可能与低氧调节、细胞因子调节、癌基因调节等有关。肿瘤细胞从原发瘤的增殖生长到远处转移灶的形成要经过漫长的过程和许多的生物学改变阶段,这个进展的过程在人体往往需要几年甚至几十年的时间,所以该过程的观察在人体身上不可能实现,要完整观察这个过程必须建立相应的动物转移模型,但大部分实验动物由于其在荷瘤状态下自身寿命的限制我们很难动态的、连续的观察到这个过程。在以往的实验研究过程中我们发现将Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞接种于C57BL/6近交系小鼠后,随着肿瘤传代次数的增加其肺转移发生的几率也逐渐升高,在此基础上我们通过Lewis肺癌荷瘤小鼠体内连续传代的方法模拟肿瘤在体内生长演变的过程,以期建立能够模拟肿瘤生长、侵袭和转移动态全过程的动物模型,寻找一种观察肿瘤生物学特征动态变化的新方法。在该动物模型建立的基础上本实验拟观察Lewis肺癌生长、侵袭和转移动态过程中肿瘤组织内血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子1a(hypoxia-inducible factor 1a,HIF-1a)和微血管密度(microvesseldensity,MVD)表达的变化,以揭示血管生成与肿瘤生长转移的关系及其可能机制。方法将LLC细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中,置于37℃、5%CO_2饱和湿度培养箱中培养。初次接种时将LLC细胞吹打成单细胞悬液,以1×10~6/0.2ml接种于C57BL/6小鼠右腋部背侧皮下,建立第1代荷瘤鼠模型。以后每次将传代2周的荷瘤鼠断颈处死,无菌条件下剥除肿瘤组织,制成瘤细胞悬液,以1×10~6/0.2ml接种于C57BL/6小鼠右腋部背侧皮下,在小鼠体内连续传代。分别于第2代、第8代和第15代接种C57BL/6小鼠15只作为早期组、中期组和晚期组。实验过程中观察各组小鼠的出瘤时间,自接种后第6日起隔日一次测量肿瘤大小,计算肿瘤体积。于接种后第28天以颈椎脱臼法处死小鼠,瘤体剥离后固定并观察其肺转移灶情况。采用免疫组织化学法(SP法)检测各组肿瘤组织内MVD、VEGF和HIF-1a的表达情况,并进行常规组织学观察。应用SPSS13.0统计软件对实验数据进行方差分析、x~2检验、非参数检验,相关分析采用二元变量的等级相关分析(Kendall'stau-b),以a=0.05作为检验标准。结果1.早、中、晚期各组小鼠的出瘤时间分别为(4.60±1.18)天、(3.73±1.03)天和(2.93±0.96)天,随着传代次数的增加早、中、晚期各组小鼠的出瘤时间缩短,差异有显着性(P＜0.01)。2.由早、中、晚期各组小鼠肿瘤生长曲线可以看出随着传代次数的增加,肿瘤的生长速度渐渐加快,差异有显着性(P＜0.05)。3.肿瘤大体观:随着传代次数的增加早、中、晚期各组荷瘤鼠肿瘤组织由苍白、质韧到红润、质脆,由局限生长到浸润皮肤导致皮肤破溃,浸润胸壁肌层甚至突破胸腔,瘤组织剖开后由坏死无出血到有明显出血。4.肺转移灶:早、中、晚期各组小鼠的肺转移率分别为13.3%(2/15)、60.0%(9/15)和100%(15/15),呈逐渐增高的趋势,差异有显着性(P＜0.01)。早期组仅有两只镜下可见由几十个异形肿瘤细胞构成的微转移灶;中期组肉眼可见肺转移灶,数目多在1-5个之间,直径多在2mm以下,镜下可见肿瘤组织呈巢团状散在分布;晚期组肺转移灶数目从4-30个不等,直径多在1-2mm之间,有些出现直径大于2mm的转移灶,镜下亦见呈巢团状,但多发,面积较大。5.早、中、晚期各组小鼠瘤组织中MVD计数分别为(24.73±10.38)、(41.27±13.50)和(55.80±21.31),随着传代次数的增加,肺转移率的升高,早、中、晚期各组小鼠瘤组织中MVD计数也逐渐增多(P＜0.01)。6.早、中、晚期各组小鼠瘤组织中VEGF的表达逐渐增多,转移肿瘤中VEGF的表达明显高于无肺转移者,差异有显着性(P＜0.05),且VEGF与MVD呈正相关(r=0.530,P＜0.01)。7.早、中、晚期各组小鼠瘤组织中HIF-1a的表达逐渐增多(P＜0.05),且VEGF与HIF-1a的表达成正相关(r=0.751,P＜0.01)。结论1.Lewis肺癌在C57BL/6小鼠体内连续传代过程中出瘤速度提前,生长速度加快,侵袭能力增强,同时肺转移发生的几率越来越高,转移灶数目从少到多,直径从小到大,基本上呈现了肿瘤生长、侵袭转移的动态全过程,为探讨血管生成在肿瘤生长、转移过程中作用的研究打下了基础。2.肿瘤细胞分泌的VEGF促进了血管生成,且其表达与肿瘤的恶性程度和转移潜能密切相关。3.血管生成在Lewis肺癌生长、转移的动态过程中发挥了重要作用。其可能机制为肿瘤的缺氧引起了HIF-1a的过表达,启动了VEGF的转录,在其它血管活性因子的参与下,促使了血管新生,从而使肿瘤细胞得以持续生长和扩散转移。
孙启峰[3]2016年在《CK19基因重组腺病毒转染树突状细胞在Lewis肺癌免疫治疗中作用的研究》文中研究指明当前无论在恶性肿瘤的发病率还是死亡率中,肺部恶性肿瘤均居首位。在临床工作中手术、化疗、放疗仍是其主要的治疗手段,但治疗后的生存率和预后仍很不理想。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前体内的抗原呈递能力最强大的细胞,具有诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte CTL)生成的能力。有研究表明恶性肿瘤的发生、发展及预后均与树突状细胞有一定关系。自身免疫逃逸是恶性肿瘤的发生的重要机制之一,其主要原因是因为DC细胞数量在瘤内及瘤旁组织中减少从而导致DC无法递呈肿瘤相关抗原、激活细胞毒性T淋巴细胞,诱导特异性免疫反应杀伤肿瘤细胞。因此我们认为,DC细胞在肺恶性肿瘤细胞的免疫逃逸机制中亦起到关键作用。肿瘤疫苗或肿瘤免疫治疗的基本原理是通过体外或体内给予患者肿瘤抗原来激发患者的被动或主动的免疫反应,从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。疫苗具备治疗特异性强,且在一定时间段内具有记忆性等优点,可以有效的预防肿瘤的复发或转移。当前,以DC细胞为载体制备的肿瘤疫苗,从而诱导精准的抗肿瘤的免疫治疗已成为肿瘤治疗的研究热点。同时,细胞免疫治疗较常规的放化疗的毒副作用小,对正常细胞及器官损伤降到最低。而细胞免疫治疗的关键是其精准地靶向治疗,既通过肿瘤特异性的抗原作为信号,从而诱发CTL效应。作为外来抗原肿瘤抗原具有免疫原性低的特点,但其识别是特异性细胞免疫治疗的基础。所以选择适合的肿瘤相关抗原成为精准肿瘤免疫治疗的关键。细胞角蛋白(Cytokeratin, CK)广泛存在于上皮癌的细胞中,为细胞骨架的组分之一。CK分子具有至少20个不同的亚型(CK1～CK20),其中CK19蛋白在上皮性癌细胞的表达最为特异,细胞角蛋白19(CK19)片段在恶性肿瘤诊断中最为重要,这也使得CK19成为肿瘤检测及细胞免疫治疗的可能靶点。在第一部分中我们通过实验证实CK19蛋白在Lewis肺癌细胞中表达增高,说明CK19蛋白在肺癌的发生中起到重要作用,CK19蛋白可以作为肿瘤细胞免疫治疗的靶向抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向性免疫治疗的细胞,其可用于体内和体外研究。因此我们选择CK19作为肺癌细胞免疫治疗的靶点具有十分良好的前景。目前于体外获取和培养DC细胞的技术口趋成熟,于体外通过将肿瘤抗原相关基因或抗原转入DC细胞中,从而制备肿瘤特异性疫苗越来越受到人们的关注和认可。通过重组腺病毒载体将目的基因转入DC细胞中是当前制备肿瘤免疫疫苗的最有效的方法,而构建含有靶向基因的重组腺病毒是转染DC细胞制备疫苗的前提条件。AdMax系统是目前制备重组腺病毒最为高效的方法之一,在我们实验设计的第二部分中,我们即利用通过AdMax系统构建携带肺癌靶向基因CK19的重组腺病毒。经过测序鉴定成功构建重组腺病毒后,在实验的第叁及第四部分分别将含有肿瘤靶向基因CK19基因的重组腺病毒(rAd-CK19)转染DC细胞后,检测DCs细胞表型变化,及CK19蛋白表达情况,确定制备成功rAd-CK19-DCs疫苗。在转染成功后将DC疫苗免疫接种到Lewis肺癌小鼠模型中,通过检测肿瘤体积及重量的变化来评价人工肿瘤免疫疫苗在抗Lewis肺癌中的治疗效果。第一部分检测小鼠Lewis肺癌细胞中CK19的表达[研究目的]第一部分拟通过实验证实CK19mRNA及蛋白可以作为细胞免疫治疗的靶向基因或抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向免疫治疗的实验细胞。[研究方法]通过PCR法检测Lewis肺癌细胞CK19 mRNA的表达,证明CK19在肺癌细胞中高表达；Western-blot法检测Lewis肺癌细胞CK19蛋白的表达,并使用免疫荧光检测CK19蛋白在Lewis肺癌细胞中的表达及定位。[结果]Lewis肺癌细胞CK19 mRNA阳性表达,且通过荧光染色显示CK19蛋白在其细胞膜上广泛表达,提示CK19蛋白可以作为免疫治疗的目标靶点。同时DC细胞CK19蛋白阴性表达,显然Lewis肺癌细胞中CK19蛋白表达水平明显高于DC细胞。[结论]第一部分实验采用Real-time PCR、Western-blot、免疫荧光的方法检测了Lewis肺癌细胞CK19显着表达。CK19蛋白可以作为肿瘤细胞免疫治疗的靶向抗原,同时证明Lewis肺癌细胞可以作为CK19靶向性免疫治疗的细胞,用于体内和体外细胞免疫治疗的研究。第二部分利用AdMax系统构建重组腺病毒rAd-CK19载体[研究目的]利用AdMax系统构建携带人CK19基因的重组腺病毒(rAd-CK19)载体,为下一步转染DC细胞制备肿瘤免疫疫苗做好准备。[研究方法]重组腺病毒(rAd)转移质粒载体pTR-UF5为基础构建CK19表达载体pTR-UF5/CK19。利用AdMax包装系统,首先以质粒PTR-EGFP-CK19为模板,通过PCR扩增人CK19基因cDNA片段,然后将所得的穿梭质粒pDC316-CK19和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre利用CaCL2方法共转染入293细胞(293细胞因其容易转染的特点,是目前研究外源基因最为常用的细胞株)中,得到重组腺病毒Ad/CK19。然后使用Cs CL梯度法离心和纯化重组成功的腺病毒,以及TCID50法来测定重组腺病毒的滴度。[结果]结果显示,通过双酶切法来检测腺病毒穿梭质粒pDC316-cmv-EGFP-CK19片断大小,根据测序插入的目的基因与Gene Bank中报告的CK19cDNA进行对比,完全符合CK19基因表达。然后,通过AdMax系统,利用构建好的穿梭质粒和辅助质粒构建了重组腺病毒rAd-CK19。[结论]我们成功构建了含有肺癌相关抗原基因CK19的重组腺病毒载体Ad/CK19。经过RT-PCR检测符合预期(138bp)大小的片断,从而证实重组病毒构建成功。为下一步重组腺病毒Ad/CK19转染DCs细胞制备肺癌免疫疫苗治疗肺癌打下了基础。第叁部分CK19基因修饰重组腺病毒转染树突状细胞后CK19表达分析及其表型改变[研究目的]在这一部分实验中我们将利用已构建成功的重组腺病毒rAd-CK19载体,将肿瘤靶向基因CK19通过重组病毒转入DCs细胞中,并检测转染后DCs细胞的表型变化,确定是否转染成功,从而制备为CK19基因修饰的DCs免疫疫苗。[研究方法]在该实验中,于转染的24h前将DC细胞接种于培养板,并加入不含抗生素的完全培养基。将pTR-UF5/CK19载体或pTR-UF5载体稀释于无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。在不含有抗生素和血清的培养液中加入Lipofectamine2000并稀释,然后缓慢摇匀后,于室温下进行孵育。然后使用PBS溶液清洗培养基内细胞。将清洗后的细胞复合物置入培养孔内均匀摇动以使其分布均匀。感染2小时后,收集感染细胞更换为含GM-CSF和IL-4的RMPI1640培养基,继续培养2天。转染后使用Real-time PCR、Western-blot、免疫荧光方法检测转染后DCs细胞中CK19的表达水平。另通过流式细胞仪检测DCs细胞在修饰后的表型(CD80,CD86, MHC-Ⅱ)改变。[结果]DCs细胞中CK19基因很弱的阳性表达,转染带有CK19基因腺病毒载体后CK19基因成高阳性表达,而空腺病毒载体对DCs细胞CK19基因表达没有影响。DCs细胞中CK19蛋白很弱的阳性表达,转染带有CK19基因腺病毒载体后CK19蛋白成高阳性表达,而空腺病毒载体对DCs细胞CK19蛋白表达没有影响(M0I200)。DCs细胞转染CK19以后DCs表面的CD80, CD86, MHC-Ⅱ均比转染前表达高。结果显示转染CK19有明显的促进DC细胞成熟的作用。[结论]本实验中利用同源重组原理构建CK19的重组腺病毒载体并纯化,为以CK19基因作为靶基因。然后,将携带Ad/CK19基因的合成腺病毒转染树突状细胞(DC),合成肺癌免疫疫苗rAd-CK19-DCs。为下一步体内实验利用DC细胞诱导特异性的细胞毒性T细胞(CTL)免疫反应治疗肺癌打下基础。第四部分转染CK19基因的DCs肿瘤疫苗在鼠体内抗瘤活性的研究[研究目的]根据《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》和《抗肿瘤药物药效学指导原则》的要求,评估在实验第叁部分中制备的肿瘤免疫疫苗(rAd-DC-CK19)对接种Lewis肺癌细胞的小鼠的治疗作用。[研究方法]通过体外应用携带CK19基因的rAd-CK19感染DCs细胞制成的特异性疫苗(rAd-CK19-DCs),继而免疫接种Lewis小鼠肺癌,来观察瘤体生长速度(测量肿瘤体积),评估其对小鼠肺癌肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。通过实验证实rAd-CK19-DCs疫苗可以有效抑制肺肿瘤的生长。[结果]结果显示：接种了特异性肿瘤疫苗(DC-CK19)后,实验制备的DC疫苗对肿瘤细胞的生长有着明显的抑制作用,在小鼠体内的肿瘤生长也明显延缓；rAd-CK19-DCs治疗组肿瘤体积也小于对照组(rAd-c DCs组或DCs组)的肿瘤体积。通过体内实验证实制备的rAd-CK19-DCs疫苗能诱导出小鼠CK19表位的肿瘤特异性免疫反应,并在小鼠体内产生明显的抗肺癌细胞生长的反应。[结论]实验证明我们制备的肿瘤疫苗(rAd-CK19-DCs)能够明显地抑制肺癌细胞在小鼠体内的生长。这一实验结果说明利用肿瘤特异抗原或基因为靶点,制备特异性肿瘤疫苗的方法将成为肺部恶性肿瘤精准治疗的有力武器。
王斯华[4]2007年在《舌癌原发灶对颈部转移灶血管生成的影响》文中提出实体肿瘤的发展、侵袭和转移依赖于瘤体内的血管生成，以提供所需的各种营养物质，而瘤体内血管生成的过程则受到多种因素的调节，其中有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等血管生成促进因子和内皮抑制素(Endostatin)等血管生成抑制因子。本实验中，通过对比研究舌癌原发灶、与原发灶同期切除的颈部淋巴结转移灶以及原发灶切除后发生的颈部淋巴结转移灶内微血管密度(MVD)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和内皮抑制素(Endostatin)的表达规律，进一步探讨口腔恶性肿瘤淋巴结转移灶的生长机制并为预防和治疗口腔恶性肿瘤的转移提供一个可能的途径。本实验应用免疫组织化学S-P法检测40例舌癌原发灶与其颈部淋巴结转移灶和20例行单纯舌癌原发灶切除术后发生的颈部淋巴结转移灶中的CD34、VEGF、PDGF和Endostatin的表达。结果发现舌癌原发灶和原发灶切除后发生的颈部转移灶内的MVD值明显高于与原发灶同期切除的颈部转移灶内的MVD值(P＜0.05)，叁者间VEGF和PDGF的表达无显着性差异(P＞0.05)；与原发灶同期切除的颈部转移灶内Endostatin的表达高于舌癌原发灶和原发灶切除后发生的颈部转移灶内Endostatin的表达(P＜0.05)，而舌癌原发灶和原发灶切除后发生的颈部转移灶内Endostatin的表达无明显差异(P＞0.05)。舌癌原发灶中，VEGF和PDGF的表达与MVD呈正相关(P＜0.05)，而Endostatin的表达与MVD不具相关性(P＞0.05)；在与原发灶同期切除的颈部淋巴结转移灶中，Endostatin的表达与MVD呈负相关(P＜0.05)，而VEGF和PDGF的表达与MVD不具相关性(P＞0.05)。综上所述，可得出以下结论：1．舌癌原发灶内的微血管密度高于其颈部淋巴结转移灶，前者Endostatin的表达弱于后者，但两组间VEGF和PDGF的表达无明显差异。2．舌癌原发灶切除后发生的颈部淋巴结转移灶内的微血管密度高于与原发灶同期切除的颈部淋巴结转移灶，前者Endostatin的表达弱于后者，但两组间VEGF和PDGF的表达无明显差异。3．舌癌原发灶与原发灶切除后发生的颈部淋巴结转移灶内的微血管密度、VEGF、PDGF和Endostatin的表达无明显差异。4．舌癌原发灶中，VEGF和PDGF的表达与MVD呈正相关，而Endostatin的表达与MVD不具相关性；在与原发灶同期切除的颈部淋巴结转移灶中，Endostatin的表达与MVD呈负相关，而VEGF和PDGF的表达与MVD不具相关性。5．舌癌原发灶可能通过分泌Endostatin等血管生成抑制因子抑制其转移灶内的血管生成，进而使其转移灶处于静止状态。原发灶被切除后，血管生成抑制因子作用减弱而促进因子的作用相对增强，从而导致其转移灶持续生长。
杨栋[5]2015年在《川芎嗪、丹参酮ⅡA对PG干细胞样细胞恶性生物学行为影响的研究》文中认为立题依据肺癌是国内外死亡率和发病率最高的恶性肿瘤类疾病,尽管针对肺癌的诊断手段和治疗方法不断革新,其远期生存期仍令人担忧,转移、耐药及疗后复发是导致其预后差的主要因素。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)理论的提出为肿瘤的发生、发展机制揭示了新的视角,为肿瘤的治疗带来了新的希望,CSCs被认为是具有异质性的肿瘤组织中的含量极少的细胞亚群,在肿瘤的发生、侵袭、转移及耐药等诸多方面都体现出强于已分化肿瘤细胞的恶性生物学特性,分选、鉴别并靶向杀伤CSCs是当前肿瘤学领域研究的热点。通过患者的临床症状、血液流变学异常、微循环障碍等表现,可以判断血瘀证是包括肺癌患者在内的恶性肿瘤患者证候群中的重要证素,血瘀证不仅是肺癌等患者常见的客观征象,也对恶性肿瘤的侵袭和转移产生协同促进作用。活血药是肺癌临床治疗处方中的重要构成部分,活血药不仅有效地改善患病机体血行状况、缓解临床症状,还对肿瘤细胞的增殖、周期、侵袭、转移等产生一定的影响。在前期研究中,我们已经证实了川芎、苏木、鸡血藤、水蛭等活血药对lewis肺癌的转移有一定的抑制作用,其抑制作用机理可能与影响CD44V6、p-选择素、CD29、E-Cad、HIF-1α等蛋白表达有关,同时,我们也发现苏木、鸡血藤等活血药可对肺癌细胞的增殖有一定的抑制作用,其抑制作用与细胞周期阻滞及促进凋亡有关。本研究即是在前期研究的基础上,结合现在备受关注的CSCs理论,观察前期研究所用活血药川芎、丹参的有效成分川芎嗪和丹参酮ⅡA对肺癌干细胞样细胞的增殖、凋亡、粘附、侵袭、耐药及血管生成等恶性生物学行为的影响,以期从影响肺癌干细胞的角度探索活血药的作用机理和可能的作用靶点,为完善肺癌的血瘀证理论及临床合理应用活血药提供科学依据。研究目的1、分选并鉴定高转移性人肺巨细胞癌PG(分为高转移亚系PG-BE1、低转移亚系PG-LH7)中的干细胞样细胞,并探索PG原代细胞及不同氧浓度下干细胞样细胞在粘附、侵袭、耐药、血管生成等方面的差异；2、研究活血药川芎、丹参的有效成分川芎嗪及丹参酮Ⅱ A对PG干细胞样细胞增殖、凋亡、粘附、侵袭、血管生成、耐药等的影响。研究方法1、采用无血清成球培养法分选PG-BE1、PG-LH7细胞系中的干细胞样细胞亚群,并采用平板克隆形成实验、细胞凋亡检测、细胞周期检测及干细胞相关标志(CD133、SOX-2、OCT-4、Nanog)检测等验证其干性；2、采用MTT实验观察不同浓度梯度川芎嗪、丹参酮ⅡA在24h、48h、72h等不同时间点上对PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞增殖的影响；3、采用人造基底膜粘附实验检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞的粘附能力,采用免疫荧光染色法检测上述各组细胞CD29、CD44V6蛋白的表达,采用Western blot法检测各组细胞CD29、CD44V6蛋白的表达量；4、采用Transwell小室侵袭实验检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞的侵袭能力,采用免疫荧光染色法检测上述各组细胞E-Cad、N-Cad、 Vimentin、MMP-2等蛋白的表达,采用Western blot法检测各组细胞E-Cad、N-Cad、 Vimentin、MMP-2等蛋白的表达量；5、采用ELISA实验检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BEl和PG-LH7干细胞样细胞的VEGF的表达,采用Western blot法检测各组细胞HIF-1α蛋白的表达量,采用RT-PCR实验检测各组细胞VEGF、HIF-1α mRNA的表达；6、采用MTT实验检测PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞对常用化疗药顺铂、吉西他滨及紫杉醇的耐受能力,采用Western blot法检测不同氧浓度下PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞、PG-BE1和PG-LH7原代细胞、活血药干预后PG-BE1和PG-LH7干细胞样细胞的耐药相关蛋白ABCG2的表达,采用RT-PCR实验检测各组细胞ABCG2 mRNA的表达。研究结果1、采用无血清成球培养法培养的PG-BE1及PG-LH7细胞在培养至第4天开始出现较规则的球体,培养至第6天球体表面颜色变暗、折光性降低；平板克隆形成实验结果显示PG-BEl成球细胞与原代细胞的克隆灶形成数目分别为(8.06±1.31)个、(3.94±1.06)个,两者差异有统计学意义(p<0.001)。PG-LH7成球细胞与原代细胞的克隆灶形成数目分别为(6.06±1.35)个、(2.67±1.33)个,两者差异有统计学意义(p<0.001)；PG-BE1成球细胞与原代细胞CD133表达分别为(7.158±4.209)%、(0.838±0.649)%,两者差异有统计学意义(p=0.028)。PG-LH7成球细胞与原代细胞CD133表达分别为(3.785±2.968)%、(0.653±0.311)%,两者差异无统计学意义(p=0.081)；PG-BE1成球细胞与原代细胞G0/G1期细胞比例分别为(84.04±5.27)%、(50.57±1.78)%,两者差异有统计学意义(p<0.001)。PG-LH7成球细胞与原代细胞GO/G1期细胞比例分别为(54.06±2.51)%、(55.71±1.29)%,两者差异无统计学意义(p=0.366)；PG-BE1成球细胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率均低于原代细胞,p值分别为：0.021、0.001、<0.001。PG-LH7成球细胞的早期凋亡率、中晚期凋亡率及总凋亡率亦低于原代细胞,p值均为0.002；PG-BE1成球细胞表面干细胞表面标志SOX-2、OCT-4及Nanog的表达强于其亲代细胞,p值分别为0.017、0.01、0.029；PG-LH7成球细胞表面干细胞表面标志SOX-2、OCT-4及Nanog的表达亦强于其亲代细胞,p值分别为0.001、0.032、0.044。2、川芎嗪作用PG-BE1干细胞样细胞24h、48h后,随药物浓度增加而抑制作用增强,当川芎嗪浓度达到300μg/ml后,抑制作用增强不明显。不同浓度的川芎嗪的抑制增殖作用均有时效关系；川芎嗪对PG-LH7干细胞样细胞的抑制作用在不同时间上均存在量效关系。10μg/ml、50μg/ml浓度川芎嗪在48h时作用最强,100μg/ml、300μg/ml、500μg/ml浓度组随时间延长,抑制作用增强；丹参酮ⅡA对PG-BE1干细胞样细胞的增殖抑制作用存在量效关系。浓度为0.25μg/ml、0.50μg/ml的丹参酮ⅡA随作用时间延长而有更强的抑制增殖能力；0.75μg/ml、1.00μg/ml、1.25μg/ml的丹参酮ⅡA在作用时间为48h时抑制作用最强；丹参酮ⅡA对PG-LH7干细胞样细胞的增殖抑制作用存在量效和实效关系。3.PG-BE1及PG-LH7干细胞样细胞的粘附能力均强于其原代细胞,其p值分别为0.013、0.005；PG-BE1及PG-LH7干细胞样细胞在不同氧浓度环境下的粘附能力均无差异,其p值分别为0.74、0.151；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1干细胞样细胞的粘附能力,且不同浓度川芎嗪的抑制作用呈现剂量依赖性,中、高浓度丹参酮ⅡA的抑制作用强于低浓度,中、高浓度之间抑制作用无差异(p=0.588)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-LH7干细胞样细胞的粘附能力,不同浓度川芎嗪的抑制作用无差异,中、低剂量丹参酮ⅡA的抑制作用弱于高剂量,中、低剂量之间抑制作用无差异(p=0.585)。PG-BE1干细胞样细胞的CD29及CD44V6表达均强于其原代细胞(p<0.001)；PG-BE1干细胞样细胞在不同氧浓度下的CD29表达无差异(p=0.188),PG-BE1干细胞样细胞在常氧环境下CD44V6的表达量高于低氧环境(p<0.001)；PG-LH7干细胞样细胞的CD44V6表达量高于原代细胞(p=0.028),CD29的表达与原代细胞无差异(p=0.302)；PG-LH7干细胞样细胞在常氧环境下CD29的表达量高于低氧环境(p=0.004),而CD44V6在不同氧环境下表达无差异(p=0.071)；不同浓度的川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1干细胞样细胞CD29的表达,川芎嗪及丹参酮ⅡA的抑制作用均无剂量依赖性；高浓度川芎嗪及不同浓度丹参酮ⅡA可抑制PG-BE1干细胞样细胞CD44V6的表达,丹参酮ⅡA的抑制作用存在剂量依赖性；不同剂量川芎嗪及丹参酮ⅡA对PG-LH7干细胞样细胞CD29的表达均无抑制作用。但可抑制CD44V6的表达,不同浓度之间的抑制作用无剂量相关性。4、PG-BE1及PG-LH7干细胞样细胞的侵袭能力均强于其原代细胞(p<0.001),低氧环境中的PG-BE1干细胞样细胞侵袭能力强于常氧环境(p=0.038),PG-LH7干细胞样细胞在不同氧环境下侵袭能力无差异(p=0.406)；PG-BE1干细胞样细胞E-Cad、N-Cad表达强于原代细胞(其p值分别为0.003、<0.001),PG-LH7干细胞样细胞Vimentin的表达强于原代细胞(p值为0.032)；低氧环境下mPG-BE1干细胞样细胞的E-Cad表达下调(p<0.001),N-Cad、Vimentin、MMP-2的表达上调(p值均小于0.05)。PG-LH7干细胞样细胞N-Cad、Vimentin、MMP-2的表达均上调(p值均小于0.05)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1干细胞样细胞的侵袭能力(各组与空白组相比,p值均小于0.05),不同浓度川芎嗪的抑制作用有剂量依赖性,中、低浓度丹参酮ⅡA的抑制作用弱于高浓度,低、中浓度之间比较差异无统计学意义(p=0.349)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可抑制PG-LH7干细胞样细胞的侵袭能力,川芎嗪及丹参酮ⅡA的抑制作用均无剂量依赖性。川芎嗪及丹参酮ⅡA对两种干细胞样细胞侵袭能力的影响与对E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表达有关。5、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞VEGF表达均显着强于原代细胞(p<0.001),低氧环境下PG-BE1、PG-BE1干细胞样细胞VEGF表达均显着强于常氧环境(p<0.001)。不同浓度川芎嗪与丹参酮ⅡA均对PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞的VEGF表达均有一定的抑制作用,且抑制作用有剂量相关性。PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞的HIF-1α的表达均强于其原代细胞(p<0.05),PG-BE1干细胞样细胞在低氧环境下的HIF-1α的表达强于常氧环境(p<0.05),PG-LH7干细胞样细胞在低氧环境下的HIF-1α的表达与常氧环境表达无差异(p=1.0)；不同浓度川芎嗪及丹参酮ⅡA均可对PG-BEl干细胞样细胞HIF-1α的表达产生抑制作用(p<0.05),不同浓度川芎嗪之间,抑制作用无差异(p>0.05),低、中浓度丹参酮ⅡA的抑制作用强于高浓度。不同浓度川芎嗪对PG-LH7干细胞样细胞HIF-1α的表达均无明显抑制作用。不同浓度丹参酮ⅡA均可对PG-LH7干细胞样细胞HIF-1α的表达产生抑制作用,高浓度丹参酮ⅡA的抑制强度强于低、中浓度组。川芎嗪及丹参酮ⅡA对两种细胞VEGF、HIF-1α表的抑制与其下调其mRNA表达相关。6、MTT结果显示,PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞对顺铂、吉西他滨、紫杉醇的耐受性普遍强于其原代细胞。PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞的化疗耐药性可能与其高表达ABCG-2有关(与原代细胞相比,p<0.001),此外,两种细胞在常氧环境中ABCG-2蛋白的表达量高于低氧环境(p<0.001)；川芎嗪与丹参酮ⅡA均可抑制ABCG-2蛋白表达,不同浓度抑制作用无剂量依赖性。除低剂量丹参酮ⅡA组外,各剂量川芎嗪及丹参酮ⅡA对PG-LH7干细胞样细胞ABCG-2蛋白的表达均有一定的抑制作用,不同浓度抑制作用亦无剂量依赖性。川芎嗪及丹参酮ⅡA对两种细胞ABCG-2表达的抑制与其下调其mRNA表达相关。研究结论1、采用无血清成球培养法可一定程度上分选肺癌细胞系中的CSCs亚群,可通过对其自我更新、细胞凋亡、细胞周期、表面标志等的检测验证其干性。2、川芎嗪和丹参酮ⅡA均可抑制PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞增殖,川芎嗪抑制作用较弱,两者的抑制作用有一定的量效、时效关系。3、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞有较其原代细胞更强的人造基底膜粘附能力,川芎嗪和丹参酮ⅡA可抑制其粘附作用,其抑制作用与影响CD29及CD44V6蛋白的表达有关。4、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞有较其原代细胞更强的侵袭能力,且其侵袭能力在低氧环境中更明显,川芎嗪和丹参酮ⅡA可一定程度上抑制其侵袭能力,其抑制作用与影响E-Cad、N-Cad、Vimentin、MMP-2等蛋白的表达有关。5、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞可能具有更强的促血管生成能力,川芎嗪和丹参酮ⅡA可通过抑制其HIF-1α及VEGF的表达而抑制其血管生成能力。6、PG-BE1、PG-LH7干细胞样细胞耐药性更强,这与其高表达ABCG-2蛋白相关,一定浓度的川芎嗪和丹参酮ⅡA可抑制ABCG-2蛋白表达。
李子骧[6]2018年在《肺癌Ⅰ号方对小鼠Lewis肺癌VEGF、COX-2和CD34作用机理的实验研究》文中提出【目的】以Lewis肺癌小鼠作为实验动物模型,运用免疫组织化学法检测Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)、环氧化酶-2(COX-2)以及CD34的作用机理,探究肺癌I号方的抗肿瘤机制,为其临床应用提供可靠的科学依据。【方法】以48只SPF级C57/BL Lewis肺癌小鼠建立动物模型,并将其随机分成4组,即:荷瘤对照组、中药组(肺癌I号方)、DDP组(顺铂)、中药联合DDP组。荷瘤对照组用NaCl灌胃(1天1次),腹腔注射NaCl(3天1次);中药组用肺癌I号方药液灌胃(1天1次),腹腔注射NaCl(3天1次);DDP组用NaCl灌胃(1天1次),腹腔注射DDP(3天1次);中药联合DDP组用肺癌I号方药液灌胃(1天1次),腹腔注射DDP(3天1次)。第13天行脊椎脱臼法处死模型小鼠,取出瘤组织并称取其重量。瘤组织固定后,包蜡、切片、染色,并采取病理组织学检查,采取免疫组织化学SP法检测肿瘤组织中血管内皮生长因子、环氧化酶-2以及CD34的表达情况。并选用SPSS 20.0软件进行数据统计分析。【结果】1.瘤重与抑瘤率1.1瘤重:结果显示,以荷瘤对照组作为比较对象,中药组的平均瘤重低于荷瘤对照组,差异有统计学意义(P<0.05),DDP组的平均瘤重低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01),中药联合DDP组的平均瘤重低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);以中药组作为比较对象,DDP组的平均瘤重低于中药组,差异有统计学意义(P<0.05),中药联合DDP组的平均瘤重低于中药组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);以DDP组作为比较对象,中药联合DDP组平均瘤重低于DDP组,差异显着,有统计学意义(P<0.01)。1.2抑瘤率:中药联合DDP组的抑瘤率为41.8%,在抑癌率方面疗效最优;DDP组抑瘤率为26.6%,在抑癌率方面疗效略弱;中药组抑瘤率为14.7%,在抑癌率方面疗效欠佳。2.血管内皮生长因子(VEGF)阳性表达:血管内皮生长因子的阳性表达以其平均光密度值为判定依据。结果显示,血管内皮生长因子的平均光密度值分别为:荷瘤对照组(0.1453±0.0036);中药组(0.1383±0.0035);DDP组(0.1252±0.0052);中药联合DDP组(0.1123±0.0065),中药组的VEGF平均光密度值低于荷瘤对照组,差异有统计学意义(P<0.05);DDP组的VEGF平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的VEGF平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);DDP组的VEGF阳性平均光密度值低于中药组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的VEGF阳性平均光密度值低于中药组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的VEGF阳性平均光密度值低于DDP组,差异显着,有统计学意义(P<0.01)。3.环氧化酶-2(COX-2)阳性表达:环氧化酶-2的阳性表达以其平均光密度值为判定依据。结果显示,环氧化酶-2的平均光密度值分别为:荷瘤对照组(0.1456±0.0060);中药组(0.1361±0.0041);DDP组(0.1119±0.0106);中药联合DDP组(0.1028±0.0082),中药组的COX-2平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);DDP组的COX-2平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的COX-2平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);DDP组的COX-2阳性平均光密度值低于中药组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的COX-2阳性平均光密度值低于中药组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的COX-2阳性平均光密度值低于DDP组,但该差异不具有统计学意义(P>0.05)。4.CD34阳性表达:CD34的阳性表达以其平均光密度值为判定依据。结果显示,CD34的平均光密度值分别为:荷瘤对照组(0.1481±0.0063);中药组(0.1353±0.0023);DDP组(0.1132±0.0077);中药联合DDP组(0.1041±0.0067),中药组的CD34平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);DDP组的CD34平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的CD34平均光密度值低于荷瘤对照组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);DDP组的CD34阳性平均光密度值低于中药组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的CD34阳性平均光密度值低于中药组,差异显着,有统计学意义(P<0.01);中药联合DDP组的CD34阳性平均光密度值低于DDP组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.肺癌组织切片观察:与荷瘤对照组相比,其余叁组癌细胞坏死区域增多,坏死面积较广,灶状或片状坏死居多,细胞水肿显着,且密度变低。细胞异型性相对减少。其他叁组之间相互比较,中药联合DDP组坏死区域面积较大,DDP组坏死区域面积相比于中药组较广。【结论】1.肺癌I号方可通过降低Lewis肺癌小鼠中VEGF、COX-2以及CD34的表达,抑制肿瘤组织血管的生成,从而抑制肿瘤的生长。2.肺癌I号方与化疗药物DDP联合使用时,抑制肿瘤组织血管生成的作用最为显着,可有效抑制肿瘤的生长。
张艳[7]2016年在《理冲生髓饮有效组分对卵巢癌血管生成影响及JAK2/STAT3信号通路调控的机制研究》文中研究表明目的：通过基因芯片筛选中药复方理冲生髓饮(LCSSY)有效组分作用裸鼠卵巢癌皮下移植瘤差异基因表达情况,探讨LCSSY有效组分治疗卵巢癌相关机制；以基因芯片筛选结果为基础,验证中药复方有效组分对卵巢癌血管生成影响及调控机制。方法：建立Balb/C裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为模型组、贝伐单抗组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,给以相应药物干预。给药期间测量卵巢癌组织体积变化；末次给药后分离皮下卵巢癌组织,称取瘤重。采用基因芯片技术筛选中药中剂量组与模型组差异基因表达,探讨中药复方潜在的作用机制；并计算各治疗组卵巢癌抑瘤率；采用免疫组化法检测各组卵巢癌组织中血管生成情况；qPCR检测各组卵巢癌组织中JAK2、STAT3、VEGFmRNA表达；蛋白印迹法检测各组卵巢癌组织中JAK2、STAT3、VEGF蛋白表达。验证理冲生髓饮有效组分抑制卵巢癌血管生成的作用及调控机制。结果：LCSSY有效组分不同剂量组及贝伐单抗组均可抑制卵巢癌组织生长,与模型组比较差异显着(P<0.01)；基因芯片筛选出与卵巢癌发生发展相关差异表达基因11条；基因芯片结果提示LCSSY有效组分作用机制与卵巢癌血管生成有相关性；免疫组化结果显示贝伐单抗能够显着降低卵巢癌组织中VEGF、CD34表达,减少MVD数量,与模型组比较差异显着(P<0.01)。LCSSY有效组分各剂量组均能够降低卵巢癌组织中VEGF、CD34表达,与模型组比较差异显着(P<0.01)；qPCR检测LCSSY有效组分各剂量组均能降低卵巢癌组织中JAK2、STAT3、VEGFmRNA表达,其抑制作用呈量-效相关(P<0.01)。蛋白印迹检测LCSSY有效组分各剂量组卵巢癌组织中JAK2、STAT3、VEGF蛋白表达量降低,随药量增加抑制作用增强,呈量-效相关(P<0.05)。结论：LCSSY有效组分能显着抑制卵巢癌组织生长,其抑制作用呈剂量依赖性；LCSSY有效组分能抑制卵巢癌组织中VEGF、CD34的表达,抑制卵巢癌血管生成；LCSSY有效组分能够调控卵巢癌组织中JAK2、STAT3mRNA及蛋白表达；LCSSY有效组分抑制卵巢癌血管生成作用与JAK2/STAT3信号通路相关。
柳玉红[8]2005年在《肺癌血管内皮生长因子（VEGF）及其受体KDR mRNA和蛋白的表达与转移和预后的关系》文中研究说明目的:探讨肺癌中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDRmRNA和蛋白的表达与转移及预后的关系。 方法:应用原位杂交技术及免疫组织化学PV-9000法分别检测30例新鲜肺癌标本及75例肺癌石蜡标本中VEGF、KDRmRNA及相应蛋白的表达。 结果:1、VEGF和KDR在肺癌组织中的表达较为广泛,主要位于肿瘤细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞,少量位于炎细胞的胞浆中;VEGFmRNA及蛋白的阳性率分别为66.67%(20/30)和61.33%(46/75),两种检测方法所得结果没有显着性差异(x~2=0.261,P>0.05);KDRmRNA及蛋白的阳性率分别为73.33%(22/30)和76.00%(57/75),两种检测方法所得结果亦没有显着性差异(x~2=0.082,P>0.05)。2、VEGF、KDRmRNA及相应蛋白在肺癌细胞中的表达均呈显着性正相关(原位杂交r=0.8528,免疫组化r=0.768,P均<0.05)。3、VEGF、KDR相应蛋白在肿瘤细胞中的阳性率在不同年龄、不同性别及不同病理类型、病理分级之间的差异均无显着性(x~2=0.04～3.06,P均>0.05);VEGF、KDRmRNA在肿瘤细胞中的阳性表达在不同病理类型、病理分级间差异也均无显着性(确切P=0.419～1.000)4、直径D>5cm组的VEGF、KDR相应蛋白在肺癌细胞的阳性表达率分别为90.32%和78.57%;直径3cm 蒋扬富[9]1999年在《肝癌复发、转移及抗血管治疗的实验研究》文中研究表明肝癌是我国的一种常见恶性肿瘤，随着外科技术的提高及介入治疗技术的开展，肝癌的近期疗效有了明显提高。但是，肝癌的长期疗效仍不满意，主要是由于复发、转移率较高。因此，研究肝癌复发、转移规律，寻找新的更有效的预测、早期发现和治疗肝癌复发、转移的途径是目前亟待解决的问题。本课题拟前瞻性地研究血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和内抑素(Endostatin)等基因在原发性肝癌中的表达及其与肝癌复发、转移的关系，寻找预测肝癌复发、转移的指标；研究外周血AFP mRNA表达诊断和预示肝癌复发、转移的敏感性和特异性以及介入、手术治疗前后AFP mRNA表达的变化，寻找早期发现肝癌血行播散的指标：克隆、表达一种血管内皮细胞生长抑制因子及研究几种抗血管形成剂对裸鼠移植瘤人肝癌BEL-7402的抑瘤作用和对肿瘤转移的抑制作用。 第一部分 VEGF、MMP-9及Endostatin等在原发性肝癌中的表达及与肝癌复发、转移的关系 收集手术切除的56例肝癌标本，采用半定量RT-PCR分析肿瘤组织及癌旁组织VEGF、MMP-9及Endostatin等基因的表达水平，并对这些患者进行随访。结果显示，在最长随访时间术后20个月内，共有22例患者(39.3％)肿瘤复发。MMP-9在肝癌组织中的表达率为67.9％(38／56)，癌旁肝组织为30.2％(16／53)。癌组织 韦露薇[10]2008年在《乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移关系的相关研究》文中研究说明卵巢癌死亡率在妇科肿瘤中居首位。尽管肿瘤减灭术及以铂类为基础的联合化疗在卵巢癌的治疗中起到了积极的作用,但因缺乏有效的早期诊断方法,70%的患者初诊时已为晚期患者。手术及化疗后复发率高、易出现耐药,因而患者的5年生存率长期停留在30%左右。乙酰肝素酶(Hpa)通过降解细胞外基质(ECM)在肿瘤的侵袭和转移中起了关键性的作用。因此,本课题探讨Hpa表达与卵巢恶性肿瘤发生、发展、转移及其预后价值。卵巢肿瘤组织中乙酰肝素酶mRNA表达与其临床病理的关系目的:探讨乙酰肝素酶(Hpa)mRNA在卵巢癌中的表达及与其临床病理的相关性。方法:应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测49例卵巢恶性肿瘤患者,23例卵巢良性肿瘤患者,22例正常卵巢组织中Hpa的mRNA表达,并分析其与卵巢癌临床病理相关性。结果:(1)恶性卵巢组织中Hpa mRNA阳性表达率为57.14%,良性组织Hpa mRNA阳性率为26.09%,正常组织Hpa mRNA阳性率为22.73%。癌组织Hpa mRNA阳性表达率显着高于良性组及正常组(P＜0.01)。良性组与正常组之间Hpa mRNA阳性表达率相比较,差异无显着性(P＞0.05)。(2)Ⅲ-Ⅳ期卵巢恶性肿瘤患者中Hpa mRNA的阳性表达率显着高于Ⅰ-Ⅱ期患者(P＜0.05)。低分化肿瘤组织中Hpa mRNA的阳性表达率显着高于中、高分化者(P＜0.05)。(3)Long-rank分析显示Hpa mRNA表达阳性者的累积生存率明显低于阴性者,相比较差异有显着性(P＜0.05)。经Cox模型多因素生存分析,Hpa及腹水量多少可作为卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:卵巢癌中Hpa mRNA阳性表达率明显增高,并与卵巢癌病情进展有关,可作为卵巢癌预测转移和预后的一个重要指标。卵巢肿瘤组织中乙酰肝素酶蛋白表达与其临床病理的关系目的:探讨Hpa蛋白在卵巢癌中的表达及与其临床病理的相关性。方法:应用SABC免疫组织方法检测50例卵巢恶性肿瘤患者,20例卵巢良性肿瘤患者,20例正常卵巢组织中Hpa蛋白的表达。并同时分析Hpa与恶性卵巢肿瘤组织学类型、分化程度、FIGO分期、腹水、淋巴结转移等临床病理因素的关系。并进行单因素生存分析及Cox回归模型分析。结果:恶性卵巢组织中Hpa蛋白阳性表达率为80%,显着高于良性组(30%)及正常组(20%),差异均有显着性,P＜0.05。良性组与正常组之间Hpa mRNA阳性表达率相比较,差异无显着性(P＞0.05);在卵巢恶性肿瘤中,Hpa蛋白的表达与恶性肿瘤组织学来源、FIGO分期、腹水的多少、有无肝、大网膜转移无关;与病理分化程度、术后残余灶、有无淋巴结转移有关。低分化肿瘤组织中Hpa蛋白阳性表达率显着高于高、中分化者,比较差异有显着性(P＜0.05);淋巴结转移组Hpa蛋白阳性表达率为85.71%,明显高于淋巴结阴性组72.41%,差异有显着性;残余灶＞2cm肿瘤组织中Hpa蛋白阳性率显着高于残余灶＜2cm者,差异亦有显着性(P＜0.05);经Cox模型多因素生存分析,大网膜有无转移可作为卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:Hpa蛋白在卵巢恶性肿瘤组织中的表达增加,并与卵巢癌病情进展有关,可作为卵巢癌预测转移和预后的一个重要指标。卵巢肿瘤患者外周血乙酰肝素酶测定及临床价值目的:探讨卵巢肿瘤患者外周血乙酰肝素酶的表达及与其临床病理的相关性。方法:采用ELISA酶联免疫吸附法检测了51例卵巢恶性肿瘤、17例卵巢良性肿瘤及16例正常对照的血清中Hpa的表达和10例卵巢恶性肿瘤患者术前、术后血清中Hpa的表达。将结果与临床及病理资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox回归模型分析。结果:恶性卵巢肿瘤患者血中Hpa的表达显着高于良性组及正常对照组,差异有显着性p＜0.05);同一患者术前、术后血清Hpa的表达亦有显着性(P＜0.05);在恶性卵巢肿瘤患者血清中,Hpa的表达与肿瘤的临床分期、病理分化程度、腹水量和有无肝转移有关,与组织学类型、有无淋巴结、大网膜转移无关;相关分析显示Hpa与CA125呈正相关(r=0.293,P=0.015);即随Hpa含量增高,CA125含量亦增高。结论:Hpa的表达与卵巢恶性肿瘤的发生,发展有关,并与恶性肿瘤的浸润转移有关。认为Hpa有望在临床上成为判断侵袭、转移的指标之一。 [1]. VEGF在Lewis肺癌微转移灶形成中的作用及机制研究[D]. 陈敬. 第叁军医大学. 2004 [2]. 血管生成在Lewis肺癌生长转移过程中的作用[D]. 郭伟华. 郑州大学. 2009 [3]. CK19基因重组腺病毒转染树突状细胞在Lewis肺癌免疫治疗中作用的研究[D]. 孙启峰. 山东大学. 2016 [4]. 舌癌原发灶对颈部转移灶血管生成的影响[D]. 王斯华. 四川大学. 2007 [5]. 川芎嗪、丹参酮ⅡA对PG干细胞样细胞恶性生物学行为影响的研究[D]. 杨栋. 中国中医科学院. 2015 [6]. 肺癌Ⅰ号方对小鼠Lewis肺癌VEGF、COX-2和CD34作用机理的实验研究[D]. 李子骧. 云南中医学院. 2018 [7]. 理冲生髓饮有效组分对卵巢癌血管生成影响及JAK2/STAT3信号通路调控的机制研究[D]. 张艳. 黑龙江中医药大学. 2016 [8]. 肺癌血管内皮生长因子（VEGF）及其受体KDR mRNA和蛋白的表达与转移和预后的关系[D]. 柳玉红. 青岛大学. 2005 [9]. 肝癌复发、转移及抗血管治疗的实验研究[D]. 蒋扬富. 中国协和医科大学. 1999 [10]. 乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移关系的相关研究[D]. 韦露薇. 广西医科大学. 2008 标签：肿瘤学论文; 肿瘤细胞论文; 血管生成论文; 肺癌论文; 肺癌转移论文; 肿瘤异质性论文; 基因合成论文; 细胞转染论文; 腺病毒论文; 川芎嗪论文; 癌症论文; 干细胞论文; 参考文献：