杨溪瑶[1]2003年在《肢体电刺激对脑梗死后大鼠脑不同部位功能重建及大鼠早期运动功能恢复的影响》文中认为功能重组可能是中风后功能恢复的基本原因，它包括系统内重组和系统间重组。目前早期康复及未受累半球的激活受到重视。本实验对脑梗死大白鼠前肢腕部进行左侧、右侧、及双侧电刺激过程中两侧半球不同部位的血流情况进行研究，以探讨脑梗死早期运动功能重建的机制，并通过采取不同电刺激的治疗方式了解患肢功能恢复的情况，以证实不同电刺激的差异性。 材料和方法：对Wistar大鼠(成年雄性，270-300g)进行大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的建立。使用5分法判断模型是否制作成功。取符合2和3分的大鼠作为实验对象。 一、第一阶段 1．分组 筛选术后大鼠，将成功制成脑梗死模型的大鼠随机分成2组(3天组和14天组)，每组又分为4个亚组(患侧电刺激组、健侧电刺激组、双侧电刺激组及对照组)。 2．测定不同电刺激时的脑不同部位的放射性计数 分别在梗死后第3天和第14天各取第1、2及3组大鼠8只，用6805-C电针仪对其前肢腕部进行患侧、健侧和双侧电刺激15分钟，第10分钟时尾静脉注入~(99m)Tc-ECD100Ci。5分钟后迅速取脑，分离、两侧运动皮质区、坏死中心区及其镜像区、两侧小脑及两侧大脑半球，计算脑组织放射性占注射剂量的比值ID％/g。 二、第二阶段 1．分组 将成功制成脑梗死模型的大鼠随机分成3组(患侧电刺激组、双侧电刺激组、无电刺激组)，每组20只。 2．电刺激治疗及行为学测试 用6805-C电针仪对第1组和第2组大鼠分别进行患侧和双侧电刺激(4-5V，0.sms，3Hz)，每日1次，每次3伽min，7天为1个疗程，停1天后可进行下一疗程，做4个疗程。每一疗程后进行走横木实验，观察大鼠的运动功能的变化。 叁、组织学 在第二阶段的大鼠中，在各疗程结束后各组取2只鼠采用国墨进行灌注，用切片机以100 pm厚切片，置于显微镜下进行图像采集，测量脑梗死中心区、周边区、下区及大脑健侧与损伤相对应区的血管网面积密度，进行血管灰度密度的定量分析。对不同疗程后大鼠脑冠状切片成7片，后进行TTC染色，计算大脑梗死体积占对侧半球体积的百分比。 四、统计学方法 用SPSS统计学软件进行统计学分析，所有资料用(x士s)表示，均数间的比较用单因素方差分析和t检验。 实验结果: 一第一阶段放射性计数的测定结果 在实验组，术后3天，刺激患肢引起两侧半球和运动皮质的激活都增加，以未受损半球和运动皮质增加明显。双侧刺激引起受损半球及运动皮质的激活增加更明显。与单侧刺激相比较，双侧刺激对双侧小脑的激活数值明显增加。 术后2周，患肢对受损半球和运动皮质的激活要比术后3天明显的多，而对健侧半球和运动皮质的影响要比术后3天明显减少。而同时刺激双侧前肢对受损半球及运动皮质的激活不再增强。双侧刺激对双侧小脑的激活与单侧刺激相比较无显着差异。 二.第二阶段行为学测试的结果 运用走横木测试方法进行测试:患侧刺激组和双侧刺激组的功能恢复较无刺激组的运动功能恢复明显。双侧刺激组的运动功能恢复较患侧刺激组的功能恢复明显。 叁.组织学的结果 1.血管网面积密度 梗死后1一2周，双侧刺激和患侧刺激都使梗死周围皮质血管网的面积密度增加，但与患侧刺激相比，双侧刺激使血管网密度明显增加。3一4周时，3组的血管网密度无明显差别。在梗死区下部，患侧刺激和对照组在梗死后2一3周逐渐增加;梗死后2一3周，与对照组相比，双侧刺激使血管网面积密度明显增加。在梗死中心及其镜像区，3组中梗死中心区的血管网面积密度无明显差别。在梗死后1一2周，与对照组相比，患侧刺激使健侧镜像区的血管网面积密度明显增加，而在梗死后3一4周时则无明显差别。 2.梗死体积 患侧刺激组、双侧刺激组和无刺激组的梗死体积大小占健侧大脑半球的比值无显着差异。 结论: 一在脑梗死恢复早期，双侧肢体的电刺激使受累半球和运动皮质的激活增加。在行为学测试中，与患侧肢体的电刺激相比，双侧肢体的电刺激使运动功能的恢复显着。 二.本实验的结果为临床脑梗死病人的康复提供了方便而实用的治疗方法:即患肢和健肢的同时电刺激治疗或同时的运动锻炼更有助于运动功能的恢复。
杨溪瑶, 何祥[2]2005年在《肢体电刺激对脑梗死后大鼠脑不同部位功能重建及大鼠早期运动功能恢复的影响》文中研究表明本实验对脑梗死大白鼠前肢腕部进行左侧、右侧及双侧电刺激过程中两侧半球不同部位的血流情况进行研究,以探讨脑梗死早期运动功能重建的机制。并通过采取不同电刺激的治疗方式了解患肢功能恢复的情况,以证实不同电刺激的差异性。1材料和方法对Wistar大鼠(成年雄性,
李影[3]2016年在《不同频率电针对脑梗死大鼠大脑皮层SYP及GAP-43表达影响的研究》文中进行了进一步梳理目的：通过观察不同频率电针刺激脑梗死大鼠的“前叁里穴”和“外关穴”对缺血区GAP-43、SYP表达的影响,以及对脑梗死大鼠上肢运动功能进行行为学评估,进一步探讨不同频率电针对脑梗死作用机制,优化治疗方案。方法：采用线栓法制成大脑中动脉(MCAO)闭塞脑缺血模型。将SD雄性大鼠,随机分为空白组、假手术组、模型组、2Hz组、50Hz组、100组Hz,每组10只。造模2周前采取前肢抓取预训练。动物造模苏醒后2h对每只大鼠的神经功能进行Longa评分,评分在1-3分认为造模成功。电针组采用2Hz、50Hz、100Hz及连续波电流为1 mA的电针治疗,模型组、假手术组、空白组不予电针治疗。每组按照实验术后第1、3、7、14、21d五个时间点,进行网屏实验进行各时间段组间及组内对比观察。各组在实验术后21d进行灌注取脑,免疫组化观察各组脑缺血周围皮质SYP及GAP—43的表达。结果：1行为学比较：结果显示：空白组、假手术组大鼠的网屏实验评分为0,提示手术操作不影响大鼠的神经功能；各组数据与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。术后1、3天,模型组、2Hz组、50Hz组和100Hz各组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、2Hz组、50Hz组和100Hz组分别与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。术后7天,50Hz组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。术后14天,50Hz组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；50Hz组与100Hz组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；2Hz组与50Hz组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。术后21天,2Hz组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；50Hz组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)；2Hz组与50Hz组比较,差异有统计学意义(P<0.01)；50Hz组与100Hz组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。2免疫组化表达比较：SYP：脑梗死后SYP表达明显下降,电针治疗后SYP表达明显上升。假手术组、50Hz组分别与空白组比较,P>0.05；其余各组与空白组比较,P<0.01；2Hz组与模型组比较,P<0.05；50Hz组、100Hz组分别与模型组比较,P<0.01；50Hz组与2Hz组比较,P<0.01；100Hz组与2Hz组比较,P<0.05。GAP-43：脑梗死后GAP-43应激性升高,之后逐渐降低,电针治疗可以使GAP-43维持在较高水平。假手术组与空白组比较,P>0.05,其余各组与空白组比较,差异有统计学意义P<0.01；50Hz组与模型组比较,P<0.01；2Hz组、100Hz组分别与模型组比较,P>0.05；100Hz组、50Hz组分别与2Hz组比较,P<0.05,50Hz组与100Hz组比较,P<0.01。结论：1.不同频率电针均可改善脑梗死后神经功能缺损症状,50Hz组优于2Hz、100Hz。2.不同频率电针刺激均可促进缺血区SYP及GAP-43的表达,50 Hz电针组效果显着。3.电针治疗脑梗死的作用机制,可能与其上调缺血区SYP和GAP-43的表达有关。
刘彬[4]2014年在《Gadd45b对大鼠脑缺血后轴突可塑性和运动功能恢复的调控机制研究》文中认为背景与目的：缺血性脑卒中是世界范围内引起死亡和瘫痪的主要病因，并给家庭和社会造成沉重的经济和社会负担。目前仍缺乏有效的治疗药物帮助脑卒中患者恢复受损的神经功能。成年动物大脑损伤后脑组织神经可塑性有限，脑卒中患者常遗留有明显的神经功能障碍。促进大脑神经可塑性是促进缺血性脑损伤后神经功能恢复的重要途径。近年来多项研究发现生长抑制与DNA损伤修复基因b (growtharrest and DNA-damage inducible gene b, Gadd45b)可能为影响神经可塑性相关基因，Gadd45b极有可能成为具有治疗潜力的分子指标。本研究探讨调控内源性Gadd45b表达对实验性缺血性卒中后轴突可塑性和运动功能恢复的影响及其信号调控通路，同时研究小脑顶核电刺激对脑梗死后内源性Gadd45b表达及其神经功能恢复的影响，为脑梗死后神经功能康复病理生理机制的了解和临床干预提供理论基础。方法：第一部分：构建针对大鼠Gadd45b基因的慢病毒介导的RNA干扰载体，并检测该RNA干扰载体的转染效率和干扰效率。将高、中、低叁种不同滴度(剂量)的慢病毒载体和阴性对照病毒载体立体定向至大鼠脑组织。采用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein, GFP)的表达；采用荧光定量PCR (Q-PCR)检测叁种不同滴度慢病毒载体对大鼠脑组织Gadd45b mRNA的抑制效率。通过以上检测筛选出慢病毒载体的最佳转染滴度。第二部分：采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠实验性缺血性卒中模型。通过立体定向脑内注射生物素葡聚糖胺(biotinylated dextranamine, BDA)追踪MCAO大鼠皮质红核束(corticorubral tract, CRT)的新生神经轴突出芽。通过检测生长相关蛋白43(Growth associatedprotein-43, GAP43)表达变化反映脑缺血后轴突再生。采用“楼梯测试”和“平衡木实验”评价大鼠脑缺血后瘫痪前肢运动功能。我们采用RNA干扰技术抑制内源性Gadd45b表达研究其对MCAO模型大鼠轴突可塑性和运动功能恢复的影响。第叁部分：采用MCAO建立成年大鼠实验性缺血性卒中模型。采用RNA干扰抑制大鼠脑内Gadd45b内源性表达。通过免疫组化、Q-PCR和Western Blot分别检测脑缺血后2天和14天脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的免疫反应、mRNA和蛋白表达水平。通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫组化和Western Blot检测大鼠脑缺血后2天和14天缺血侧脑组织cAMP/PKA/pCREB信号通路表达水平。采用Q-PCR和Western Blot分别检测脑缺血后2天和14天ROCK mRNA和蛋白表达水平。藉此探讨Gadd45b调控轴突可塑性的信号调控通路。第四部分：采用MCAO建立成年SD大鼠实验性缺血性卒中模型。脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)后立即给予1小时小脑顶核电刺激(fastigial nucleus electrostimulation, FNS)研究其对大鼠脑缺血后Gadd45b表达和神经功能恢复的影响。采用免疫组化、Q-PCR和Western blot检测Gadd45b表达水平。藉此研究小脑顶核电刺激对脑梗死后Gadd45b表达变化的影响，探讨小脑顶核电刺激应用于临床促进脑梗死后功能康复的分子机制。结果：第一部分：成功构建出针对大鼠Gadd45b基因的慢病毒介导的RNA干扰载体。激光共聚焦结果显示，高、中、低叁种不同剂量组大鼠皮层和海马组织注射点周围均出现GFP阳性表达。高滴度和中滴度组GFP阳性表达高而低滴度组GFP阳性表达较低。Q-PCR结果显示，与正常对照组相比，高滴度和中滴度组Gadd45b mRNA表达下降超过70%(P<0.05),高滴度和中滴度组之无明显差异(P>0.05)，低滴度组与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。第二部分：免疫荧光结果显示，与假手术组(sham)相比，脑缺血后2d和14d缺血侧皮质GAP43阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组(LV-Control)与缺血组(MCAO)相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组(LV-shGadd45b)大鼠GAP43阳性细胞数则明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d和14d缺血侧皮质GAP43mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠GAP43mRNA和蛋白水平明显下降(P<0.05)。BDA神经示踪结果显示，与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠脑缺血后皮质红核束代偿性的新生轴突明显下降(P<0.05)。与单纯缺血组相比，Gadd45b-RNAi干预处理明显抑制大鼠脑缺血后的运动功能恢复(P<0.05)。第叁部分：免疫组化结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d及14d缺血侧皮质BDNF阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45bRNA干扰组大鼠BDNF阳性细胞数明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后2d和14d缺血侧皮质BDNF mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠BDNF mRNA和蛋白水平明显下降(P<0.05)。免疫组化结果显示，与假手术组相比，脑缺血后2d及14d缺血侧皮质PKA和pCREB阳性细胞数明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠PKA和pCREB阳性细胞数均明显下降(P<0.05)。 ELISA结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质cAMP和PKA蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠cAMP和PKA蛋白水平明显下降(P<0.05)。Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质pCREB蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠pCREB蛋白水平明显下降(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血再灌注损伤后2d和14d缺血侧皮质ROCK mRNA和蛋白水平明显增加(P<0.05)，阴性病毒对照组与缺血组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，Gadd45b RNA干扰组大鼠ROCK mRNA和蛋白水平进一步明显增加(P<0.05)。第四部分：免疫组化结果显示，与假手术组相比，大鼠脑缺血后缺血侧皮质Gadd45b阳性细胞数在缺血后6h至3d均表达升高(P<0.05)，缺血组和假刺激组相比无明显差异(P>0.05)。与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠缺血侧皮质Gadd45b阳性细胞数进一步增加(P<0.05)。Q-PCR和Western blot结果显示，与假手术组相比，大鼠Gadd45b mRNA和蛋白水平在脑缺血再灌注后6h开始增加，24h达高峰，3d下降到比较低的水平但仍高于假手术组(P<0.05)。与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠Gadd45bmRNA和蛋白水平在脑缺血后各时间点进一步明显增加(P<0.05)。此外，与缺血组相比，小脑顶核电刺激组大鼠脑缺血损伤后神经功能评分显着下降(P<0.05)。结论：慢病毒载体能高效地转染大鼠脑组织，有效地进行大鼠Gadd45b特异性shRNA基因转导。Gadd45b-RNAi有效抑制了大鼠脑组织内源性Gadd45b表达。Gadd45b-RNAi干预处理同时还抑制cAMP/PKA/pCREB信号通路激活并促进ROCK表达。因此，Gadd45b可通过调控BDNF-cAMP/PKA-CREB信号通路激活抑制ROCK通路，从而对脑缺血后的轴突可塑性发挥作用。脑缺血后电刺激小脑顶核可能是通过激活Gadd45b促进功能恢复。
客蕊[5]2006年在《头穴透刺法对急性脑梗死大鼠缺血半暗带SYN及GAP-43表达的影响》文中提出目的 阐述头穴透刺法对急性脑梗死治疗作用的机制。 方法 运用血管内栓线法制备wistar大鼠局灶性脑缺血的动物模型,模拟人类急性脑缺血损伤的病理变化,以神经功能评分,病理形态学,电镜观察梗死灶边缘区神经元结构,突触的数目、形态突触后致密物质,电镜观察纹状体和丘脑腹后外侧核SYN阳性表达以及GAP43mRNA阳性表达,进行了术后7d、14d、28d各组间及组内的对比观察。 结果 (1) 治疗前造模组与头穴透刺治疗大鼠神经功能评分,无明显差异,28天头穴透刺治疗能够提高脑梗死大鼠平衡、行走及抓握能力改善患侧肢体功能。 (2) 头穴透刺组、造模组缺血半暗带SYN的阳性细胞数目与假手术组相比有显着性差异(P<0.01);而在不同时间窗内头穴透刺组与造模组比较有极显着性差异(P<0.01),表明头穴透刺组能够促进这种阳性信号的表达。 (3) 头穴透刺组,造模组缺血半暗带GAP-43的阳性细胞数目与假手术相比有显着性差异(P<0.01);而在不同时间窗内,头针透刺组与造模组比较有极显着性差异(P<0.01),表明头穴透刺组能够促进这种阳性信号的表达。 结论 头穴透刺能减少脑缺血性损伤所造成的细胞死亡,增强突触联系,对神经元具有保护作用,因而能提高神经功能,促进肢体功能康复,增加SYN和GAP-43mRNA的表达,发挥对脑组织神
徐涛[6]2007年在《经颅重频磁刺激对SD大鼠大脑中动脉梗塞再灌注损伤模型的影响研究》文中研究说明背景和目的:缺血性脑血管病是临床常见病和多发病,致残率和病死率高。如何采取合理的措施预防和治疗脑梗死,恢复受损神经细胞功能,降低致残率和病死率,一直是医学界关注的热点问题。缺血性脑水肿是脑缺血后继发性损伤的一大因素,也是缺血性脑血管病患者急性期死亡的一个主要原因,如果能够采取有效的治疗措施及时抑制或减轻脑水肿的发生、发展,势必可以阻止损伤进一步加重,挽救受损的神经细胞。另一方面,如何采取有效手段激发或增强脑缺血后的神经重塑作用,促进神经功能的恢复,也逐渐成为神经科学者尤其是神经康复学者的兴趣所在。经颅重复频率磁刺激(rTMS)是将一定频率和强度的磁脉冲以成串刺激的方式以一定间隔连续发放。由于其独特的生物学效应,目前临床上用于对重症抑郁、运动障碍类疾病的治疗。但rTMS对于缺血性脑血管病的影响仍处于研究阶段。本实验旨在观察大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤后24h神经功能情况、脑含水量以及水通道蛋白4(AQP4)表达的变化,探讨rTMS对脑梗死后水肿的影响;同时观察损伤后7d时生长相关蛋白-43(GAP-43)、突触素(SYN)表达的变化,结合大鼠神经功能情况,探讨rTMS对梗死后可塑性的影响。方法:制作雄性SD大鼠右侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)1.5h后再灌注模型,于再灌注即刻开始,给予不同频率和强度的rTMS,即5Hz、100%MT(低频低强);5Hz、200%MT(低频高强);20Hz、100%MT(高频低强);20Hz、200%MT(高频高强),同时设立假刺激组和假手术组进行对照。观察rTMS对大鼠脑缺血再灌注24h内神经功能缺损的影响以及脑组织的含水量、AQP4表达的变化;同时观察连续7d应用rTMS后脑组织GAP-43、SYN表达的变化及大鼠神经功能的变化。结果:发现脑缺血再灌注大鼠出现局灶性梗死灶、不同程度的脑水肿及神经功能障碍,24h内死亡率较高。rTMS可以使大鼠脑组织内的AQP4的表达下降,脑水肿减轻,降低24h内死亡率,20Hz、200%MT的rTMS(高频高强组)作用突出,各项指标与假刺激组比较均有统计学显着性差异(P＜0.05)。连续7d给予rTMS可以明显改善大鼠神经功能障碍的程度,上调脑组织GAP-43、SYN表达,20Hz、200%MT的rTMS(高频高强组)作用突出,各项指标与假刺激组比较均有统计学显着性差异(P＜0.05)。结论:不同频率和强度的rTMS对脑缺血再灌注损伤的大鼠具有神经保护和神经重塑的双重作用。rTMS可以降低脑缺血再灌注损伤后急性期死亡率,促进肢体恢复。rTMS可以减轻脑缺血再灌注损伤后大鼠的脑水肿,这一过程可能与减少AQP4蛋白的表达有关。连续rTMS可以促进脑缺血再灌注损伤后大鼠的神经功能的恢复。连续rTMS可以促进脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织内源性GAP-43和SYN的表达,发挥神经重塑作用。高频高强rTMS上述作用最显着。
任秀君[7]2007年在《针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响》文中研究指明研究目的:高脂血症(hyperlipidemia,HLP)由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致,表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等,属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素,有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国死于脑血管病者居叁大死因首位。其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的“叁高”特点,是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。为了减少和延缓中风的发生,减轻中风后机体状态,从高血脂阶段早期进行针刺干预,是针刺防治中风的新视角,具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风,神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分,本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型,并观察针刺的影响,探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预,是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌,从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,促进脑损伤的修复和再生。研究方法:应用大鼠喂养经典高脂饲料,化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组:正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针叁阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组,先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针叁阴交、丰隆穴10天后,两组同时电针叁阴交、丰隆穴,针刺人中、百会穴,7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达情况。用酶联免疫法(ELISA)检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)浓度。实验结果:1高血脂合并脑缺血模型的建立本实验选用经典高脂饲料喂养6周造成高脂血症大鼠模型,在此基础上用大脑中动脉FeCl3刺激血栓性闭塞法造成局灶性脑缺血,最终造成高血脂合并脑缺血模型。预实验结果显示,与同时段正常对照组比较,高血脂组4周、6周CHO、LDL-C、TG升高有显着差异,P<0.01,HDL-C没有显着差异。说明高脂饲料喂养4-6周可以造成大鼠高血脂模型。由于高血脂形成时间较长,饲养6周的高血脂症大鼠模型更近似于人类高血脂症的病理变化,正式实验定为6周。正式实验,42天,高脂饮料喂养的各组大鼠的CHO和LDL-C、TG与正常对照组大鼠比较,升高有显着性差异,P<0.01。HLD-C降低有显着性差异,P<0.01。证明高血脂症大鼠造模成功,可以进行实验。52天脑缺血造模后,在MCAO清醒(术后约1h)后,在1～2h内观察模型动物有脑缺血模型出现的神经功能缺失症状,各组大鼠在造模后1～2h的神经症状行为在评定上均有阳性反应,与正常对照组比较均有显着性差异p<0.01。HE染色结果可见,实验组动物脑缺血造模后,缺血灶出现在额叶,位置比较恒定,缺血灶内细胞排列散乱,并见大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,海马区大量神经元变性坏死,排列紊乱,各组有不同程度的神经元脱失现象等病理改变,说明本实验的脑缺血模型制作是成功的。本实验首次建立高血脂合并脑缺血的动物模型,此模型成功率高,死亡率小,重复性好,充分模拟了人类疾病的病理及生理改变。2正常大鼠血脂、HE染色结果、神经干细胞、NSE、神经营养因子的表达正常大鼠CHO 51.92±9.46mg/dL, HDL-C 26.80±8.16 mg/dL,LDL-C 30.50±8.19 mg/dL,TG47.98±12.18 mg/dL。HE染色结果显示,大鼠右侧海马区和额叶皮层神经细胞排列清楚,细胞形态清晰。神经干细胞标志,nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,在正常大鼠右侧脑内表达较少,在前脑背外侧伸展、侧脑室外侧壁可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞(背外侧伸展nestin:阳性细胞数63±9.40;面密度0.62±0.10%;光密度0.50±0.03%。PCNA:阳性细胞数185±10.60;面密度1.93±0.11%;光密度1.22±0.07%。vimentin:阳性细胞数95±6.31;面密度0.61±0.04%;光密度0.34±0.02%。Tuj-1:阳性细胞数56±7.69;面密度0.96±0.13%;光密度0.22±0.03%。侧脑室外侧壁:nestin:阳性细胞数41±5.61;面密度0.35±0.05%;光密度0.23±0.03%。PCNA:阳性细胞数114±22.79;面密度1.25±0.25%;光密度0.94±0.19%。vimentin:阳性细胞数48±11.85;面密度1.05±0.26%;光密度0.58±0.14%。Tuj-1:阳性细胞数35±4.69;面密度0.88±0.12%;光密度0.45±0.06%。)正常对照组大脑右侧额叶皮层相应区域表达更少。(nestin:阳性细胞数14±3.47;面密度0.11±0.03%;光密度0.09±0.02%。PCNA:阳性细胞数58±6.52;面密度0.64±0.07%;光密度0.39±0.04%。vimentin:阳性细胞数56±6.46;面密度0.22±0.03%;光密度0.11±0.01%。Tuj-1:阳性细胞数13±5.14;面密度0.08±0.03%;光密度0.05±0.02%。)右侧大脑匀浆中NSE(41.70±3.47 ng/dL)及神经营养因子NGF(79.36±7.07 pg/ml)、BDNF(5.66±0.86μg/L)、bFGF(51.20±6.05 ng/L)含量呈基础表达。3针刺对实验性高血脂大鼠的治疗作用3.1针刺对实验性高血脂大鼠血脂的作用经针刺治疗后,和高血脂模型组相比,高血脂治疗组大鼠的CHO、LDL-C、TG降低有极显着差异,P<0.01。HLD-C升高有极显着差异,P<0.01。说明针刺能降低实验性高血脂大鼠CHO、LDL-C、TG,升高HLD-C,调节血脂水平。3.2针刺对实验性高血脂大鼠右侧大脑SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1在实验性高血脂造模后大鼠脑内表达较少,在室管膜下区SVZ、背外侧角可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞,额叶皮质表达更少,与正常对照组相比,其阳性细胞数、面密度、光密度没有显着差异,P>0.05。针刺对实验性高血脂大鼠nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达影响不大。3.3针刺对高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中NSE的作用高血脂造模后,右侧脑匀浆中NSE浓度与正常脑匀浆中NSE浓度没有显着差异,P>0.05,说明高血脂本身不能影响右侧脑组织中NSE的分泌与合成。高血脂大鼠治疗组和模型组之间没有显着差异,说明针刺不能影响实验性高血脂大鼠NSE的分泌。3.4针刺对实验性高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组比较,高血脂模型组大鼠大脑匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显降低,P<0.05或P<0.01;与高血脂模型组比较,针刺治疗组BDNF显着升高,P<0.05,NGF、bFGF没有显着差异,P>0.05,但有升高的趋势。实验结果提示高血脂可降低大鼠大脑中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成,针刺可升高高血脂状态某些神经营养因子的含量,如BDNF。4针刺对实验性脑缺血大鼠的治疗作用4.1针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用59天,与正常对照组比较,脑缺血模型组和脑缺血治疗组神经症状评分升高有极显着性差异,p<0.01;与脑缺血模型对照组比较,脑缺血治疗组的神经症状评分降低有极显着性差异,p<0.01。HE染色结果显示,脑缺血治疗组缺血区周围组织水肿减轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。4.2针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用脑缺血后,大鼠缺血侧前脑室管膜下区(背外侧伸展、侧脑室外侧壁)、缺血区额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1强表达,并有多层阳性细胞,背外侧角可见大量的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,并向外形成了背外侧伸展,脑缺血区可见散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。与正常对照组比较,脑缺血模型组、治疗组nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组各项升高均有极显着差异,P<0.01。脑缺血后存在神经干细胞的增殖,并有一部分神经干细胞有向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化的趋向。针刺后各项指标高于脑缺血组。说明针刺可提高实验性脑缺血大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。针刺结果显示,针刺可促进大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。4.3针刺对实验性脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常组相比,脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组大脑匀浆中NSE含量降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示:脑缺血后,脑匀浆中NSE浓度显着升高,说明出现脑损伤。针刺可降低NSE浓度,从而减轻脑损伤。4.4针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常组相比,脑缺血模型组缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显上升,有显着性差异,P<0.05;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组缺血侧脑组织匀浆中NGF、bFGF含量升高有显着差异,P<0.05或P<0.01。实验结果提示脑缺血后,缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF浓度显着升高,说明脑缺血后,自身可分泌神经营养因子,从而产生一定的脑保护作用。针刺可通过促进缺血侧大脑NGF、bFGF的分泌与合成,加强脑保护作用。5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠的治疗作用5.1针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠血脂的作用经针刺治疗后,与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO、LDL-C升高有极显着性差异,P<0.01;高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅱ组TG升高,有极显着性差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组CHO、TG、LDL-C降低有显着性差异,P<0.01或P<0.05,治疗Ⅱ组没有显着差异,P>0.05;与治疗Ⅰ组比较,治疗Ⅱ组CHO、LDL-C、TG没有显着差异,P>0.05;HDL-C,各组之间比较没有显着差异,P>0.05,但与42天比较,治疗Ⅰ组HDL-C升高有显着差异,P<0.01。本实验表明,针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,高血脂合并脑缺血模型治疗治疗Ⅰ组疗效好于治疗Ⅱ组,从而说明从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平。5.2针刺对实验性高血脂合并脑缺血脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用与合并模型组比较,合并治疗组神经症状评分显着降低,p<0.05;与合并治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组没有显着差异,p>0.05,说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。针刺后缺血区HE结果显示,针刺后缺血区周围组织水肿减轻。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组水肿程度最轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明电针在高血脂成模后积极治疗可减轻脑损害。5.3针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用高血脂合并脑缺血模型组前脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、额叶缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达弱于单纯脑缺血模型组。与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅱ组各项降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示高血脂可减弱脑缺血后nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达。即高血脂可减弱脑缺血后神经干细胞的增殖,迁移和分化。针刺可提高高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比Ⅱ组各项表达要强,说明在高血脂阶段介入治疗,更能提高nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。针刺结果显示,针刺可促进高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。说明在高血脂阶段介入治疗,更能促进神经干细胞的增殖,分化和迁移。5.4针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常对照组和脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量显着上升,有显着性差异,P<0.05,P<0.01。与正常对照组相比,合并各组缺血侧大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与合并模型组比较,合并治疗Ⅰ组、Ⅱ组下降有显着差异P<0.01,P<0.05;与高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显着差异P<0.05。实验结果提示,高血脂合并脑缺血可加重脑缺血后脑损伤,针刺可减低高血脂合并脑缺血大鼠的脑损伤,尤其在高血脂阶段介入针刺治疗的治疗Ⅰ组疗效远远好于治疗Ⅱ组。5.5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组、脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组NGF、BDNF、bFGF降低有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组NGF、bFGF上升有显着差异P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组NGF、BDNF降低有显着差异P<0.01。实验结果提示:高血脂可降低脑缺血后脑自身的保护作用,针刺可通过促进NGF、BDNF、bFGF的分泌和合成,从而起到脑保护的作用。针刺治疗Ⅰ组的NGF、BDNF高于Ⅱ组,说明在高血脂阶段积极进行针刺治疗可更好的提高神经营养因子分泌,从而起到脑保护的作用。实验结论:1高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。2高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑匀浆中NSE的表达,但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子,如NGF、BDNF、bFGF的分泌。3脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。4高血脂合并脑缺血,可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织NSE的分泌,降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,减弱大脑的自我保护作用。5针刺“丰隆”、“叁阴交”,可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C,升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑组织中NSE的分泌,但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。6针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,降低缺血侧NSE的分泌,增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。7针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。8从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平,改善脑缺血状态,明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧大脑NSE的分泌,促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。9针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,降低NSE分泌,促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示,神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后,神经营养因子含量的升高,往往同神经干细胞的增殖同时出现,所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明,针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌,从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化,尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤,促进神经元的修复与再生。
陈剑豪[8]2015年在《IL-10对脑缺血大鼠内源性干细胞增殖及分化的影响》文中研究表明【目的】IL-10在脑缺血后的神经保护作用已普遍被国内外学者接受。本研究采用建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型后1小时对SD大鼠侧脑室注射重组IL-10过表达慢病毒载体(促进1L-10表达)和重组IL-10-RNAi慢病毒载体(抑制IL-10表达),观察大鼠神经损伤情况,检测伤侧脑组织中IL-10水平以及脑组织中Nestin、DCX表达情况,探讨IL-10对脑缺血大鼠神经再生机制。【方法】1、重组IL-10过表达慢病毒载体以及重组IL-10-RNAi慢病毒载体的构建和包装。2、采用线栓法建立大鼠MCAO脑缺血模型。重组IL-10过表达慢病毒载体(促进1L-10表达)和重组IL-10-RNAi慢病毒载体(抑制IL-10表达)用PBS溶解后于造模后1小时经侧脑室注射进行干预。采用ELISA检测IL-10表达情况,判断慢病毒转染是否成功。3、采用Longa 5分制NDS法、修正的神经行为学评分(mNSS)和改良贴纸去除试验评价各组大鼠神经功能变化。TTC染色并计算脑梗死体积判断脑缺血后IL-10是否具有抑制凋亡作用。4、造模7天后取脑,经Western-Blot检测Nestin、DCX表达情况。【结果】1、ELISA结果显示,重组IL-10过表达慢病毒载体干预后大鼠脑组织IL-10表达增加,重组IL-10-RNAi慢病毒载体干预后则减少,提示两者均成功转染SD大鼠。2、重组IL-10过表达慢病毒载体干预MCAO大鼠后能够促进神经功能的恢复,抑制脑梗死体积。重组IL-10-RNAi慢病毒载体干预后会加重神经损伤和脑梗死体积。3、重组IL-10过表达慢病毒载体干预可明显增加大鼠脑缺血后Nestin、DCX的表达。重组IL-10-RNAi慢病毒载体干预后则相反。【结论】IL-10对脑缺血大鼠的神经功能有保护作用,其机制可能与诱导内源性神经干细胞再生有关。
参考文献：
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