周业江[1]2002年在《1.抑癌基因PTEN/MMAC_1/TEP_1蛋白、整合蛋白α_5β_1在胃癌的表达及其意义 2.胃癌局部免疫状态及其影响因素的研究》文中认为目的 探讨抑癌基因PTEN/MMAC_1/TEP_1(以下简称PTEN)蛋白和整合蛋白α_5β_1在胃癌组织的表达状况及其与生物学行为和血管生成的关系。 方法应用免疫组织SP法检测35例胃原发癌，10例淋巴转移性胃癌及8例慢性胃炎组织中PTEN蛋白、整合蛋白α_5β_1的表达水平及微血管密度(MVD)。 结果 (1)与良性病变组织比较，胃癌PTEN蛋白表达呈显着下降(t=2.45，P＜0.05)而整合蛋白α_5β_1表达呈显着增加(t=3.32，P＜0.01)，MVD也显着增加(t=2.30，P＜0.05)，PTEN蛋白和整合蛋白α_5β_1在胃原位癌的表达较良性组织无显着改变(t=0.4、0.15，P＞0.05)而两者在进展期胃癌的表达较胃原位癌均有显着差异(t=1.85，1.90，P＜0.05)；(2)PTEN蛋白表达下降与胃癌淋巴结转移及年龄有关(t=2.92、2.26，P＜0.01、0.05)而整合蛋白α_5β_1表达增加仅与浸润深度相关(t=2.29，P＜0.05)；在淋巴转移癌，PTEN的表达与相应原发癌基本一致，而整合蛋白α_5β_1则显着增加(t=2.45，P＜0.05)。(3)MVD与胃癌浸润深度，淋巴结转移及TNM分期均显着相关(t=3.07、2.48、2.94，P＜0.01、0.05、0.01)，但原位癌MVD与CSG表达重庆医科大学硕士学位论文相似，PTEN蛋白阴性表达者k八勺较PTEN阳性表达者显着增加(户2.60，尸<。.05)，且两者呈显着负相关(犷，=众35，P<0.05)而整合蛋白。，p，表达水平与入fvl)无明显相关(Y厂0.21，P>o.05)。(4)p不巳N蛋白与整合蛋白a、p，表达水平间无显着相关(犷厂0.189，P>0.os)，PTEN蛋白失表达伴整合蛋白。、p，过表达者其浆膜浸及率()T3)，淋巴结转移率·TNMlll/IV期率及高MVD率均较其他胃癌有显着增加(P=住002，0.07，0.供1，0.041)o 结论胃癌组织，尤其是进展期胃癌存在显着的抑癌基因PTEN蛋白失表达，整合蛋白a，刀，过度表达及Mvl)增加;叁者的表达状态对胃癌的生物学行为均有重要影响并有判断预后的价值，1勺，EN(一)/整合蛋白a，刀，(+)的胃癌具有更强的组织侵袭和转移的潜能而预后更差;PTEN基因失活与胃癌血管生成增加显着相关。
李昉璇[2]2012年在《胃癌患者外周血及肿瘤微环境记忆性T细胞及其亚群的分布特征及其意义》文中研究表明研究目的：作为T细胞免疫的主要群体,记忆性T细胞的特殊性及其在胃癌中的重要意义现在尚无定论。本研究的目的是探讨胃癌患者记忆性T细胞及其亚群的分布特征,观察胃癌患者与健康人记忆性T细胞分布的差异；探讨肿瘤局部浸润的记忆性T细胞的分布特征；并分析记忆性T细胞在外周血与肿瘤微环境中的分布与胃癌临床病理特征的关系；并进一步探讨外周血及肿瘤微环境中记忆性T细胞及其亚群与抗原提呈细胞——树突细胞DC分布的相关关系。方法：1、收集天津医科大学附属肿瘤医院2010年3月至2011年6月收治的胃癌患者82例,取术前及术后空腹外周静脉血,流式细胞仪检测在外周血中记忆性T细胞亚群(CD4+T效应性记忆T细胞,CD4+中央型记忆T细胞,CD8+效应型T细胞及CD8+中央型记忆T细胞)和树突状细胞亚群(DC1, DC2)的分布。同时抽取70例健康志愿者的外周静脉血作对照。收集同期天津医科大学附属肿瘤医院有完整资料的胃癌患者72例新鲜胃癌标本,网搓法制成单细胞悬液,流式细胞仪检测记忆性T细胞亚群和树突状细胞亚群的分布。2、检测胃癌患者外周血及微环境中记忆性T细胞及亚群的分布,同时检测健康对照组外周血中记忆性T细胞及其亚群的分布,比较两者的差异。比较胃癌患者在根治性切除术前后记忆性T细胞的分布变化,分析外科手术去除肿瘤负荷对记忆性T细胞分布的影响。分析胃癌患者外周血及肿瘤微环境中记忆性T细胞及其亚群分布与临床病理特征的关系。检测患者外周血及肿瘤微环境中抗原提呈细胞——树突细胞亚群(DCl及DC2)的分布,并探讨树突细胞分布与记忆性T细胞亚群的关系。结果：1、胃癌患者中CD4+Tm及CD8+Tm在总T细胞中所占的百分比比健康对照组明显降低,差异有统计学意义。胃癌患者外周血中CD4+Tcm及CD8+Tcm百分比显着低于健康对照组。但是胃癌患者CD4+Tem及CD8+Tem百分比显着高于健康对照组(P均<0.05)。2、CD4+Tcm及CD8+Tcm的百分比在根治性切除后明显升高,而CD4+Tem及CD8+Tem在根治性切除后明显降低。CD8+Tm的百分比在胃癌根治性切除术后显着降低(P均<0.05)。3、肿瘤微环境中的CD4+Tm及CD8+Tm的亚群的分布中,CD4+Tm以CD4+Tem为主,而CD8+Tm中CD8+Tcm及CD8+Tem两亚群的分布并无显着差异。4、无论在外周血或肿瘤微环境中CD4+Tm及CD8+Tm表达与胃癌分期呈明显相关,在Ⅲ+Ⅳ期胃癌患者中CD4+Tm及CD8+Tm百分比较低,Ⅰ+Ⅱ期患者CD4+Tm及CD8+Tm百分比明显增高(P均<0.05)。在CD8+Tm的两个亚群中,CD8+Tcm与淋巴结转移与否及胃癌分期呈显着相关。有淋巴结转移的患者CD8+Tcm明显低于无淋巴结转移的胃癌患者。5、在外周血及肿瘤微环境中,CD4+Tcm及与CD8+Tcm与DC1细胞分布显着相关。而在肿瘤微环境中除CD4+Tcm及与CD8+Tcm外,CD4+Tm及CD8+Tm也与DC1的分布呈正相关。结论：1、在胃癌局部释放的免疫耐受相关因子及大量肿瘤抗原释放双重作用下胃癌患者记忆性T细胞形成了特征性分布。去除肿瘤负荷对记忆性T细胞有显着影响。2、记忆性T细胞的分布与胃癌分期密切相关。CD4+Tm及CD8+Tm、 CD4+Tcm及CD8+Tcm均与肿瘤分期呈负相关；而在肿瘤微环境中CD4+Tcm及CD8+Tcm也与分期呈负相关,而且CD8+Tcm的分布与淋巴结转移与否也密切相关,有淋巴结转移的患者其百分比显着降低。3、DC1是肿瘤微环境内提呈抗原的重要的抗原提呈细胞,其分布与肿瘤较好的预后及较早的疾病分期密切相关。它将抗原信息提呈给记忆性T细胞,对记忆性T细胞发挥杀伤功能有着重要意义。
郭苹[3]2008年在《胃癌组织中树突状细胞和记忆T淋巴细胞浸润与患者预后关系的研究》文中进行了进一步梳理目的探讨胃癌组织中树突状细胞和记忆T淋巴细胞浸润与患者预后的关系。方法采用免疫组化方法检测102例胃癌组织中树突状细胞(DC)、记忆T淋巴细胞的浸润数量及分布,将实验结果与临床病理资料结合进行统计学分析,分析胃癌局部免疫细胞的类型、数量及分布与患者预后的关系。通过胃癌组织中DC和CD45RO~+T淋巴细胞浸润数量的中位数进行联合分组,分成3组。A组:DC和CD45RO~+T淋巴细胞均≥中位数;B组:DC≥中位数而CD45RO~+T淋巴细胞＜中位数或DC＜中位数而CD45RO~+T淋巴细胞≥中位数;C组:DC和CD45RO~+T淋巴细胞均＜中位数。结果免疫组化结果显示,102例胃癌组织中,浸润DC的数量范围为0.5～57.1个/HPF,中位数7.7个/HPF。胃癌组织中浸润DC的数量在不同患者年龄、性别间未见显着性差异,在不同肿瘤大小(最大径)、肿瘤分化程度、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期间有显着性差异。相关分析显示浸润DC的数量与肿瘤大小(最大径)、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期呈显着负相关;与肿瘤分化程度呈显着正相关。DC浸润与患者的预后密切相关,DC高浸润组和DC低浸润组的中位生存时间分别为77个月和35个月,DC高浸润组5年生存率高于DC低浸润组,分别为79.1%、15.2%,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。102例胃癌组织中,浸润CD45RO~+T淋巴细胞的面积百分比范围为0.36%～69.14%/5HPF,中位数为12.34%/5HPF。胃癌组织中浸润CD45RO~+T淋巴细胞数量在不同患者年龄、性别、分化程度间未见显着性差异,在不同肿瘤大小(最大径)、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期间有显着性差异。相关分析显示CD45RO~+T淋巴细胞的数量与肿瘤大小(最大径)、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期呈显着负相关。CD45RO~+T淋巴细胞浸润与患者的预后密切相关,CD45RO~+T淋巴细胞高浸润组和低浸润组的中位生存时间分别为58个月和39个月,CD45RO~+T淋巴细胞高浸润组5年生存率高于低浸润组,分别为65.3%、30.3%,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。胃癌组织中浸润DC数量与CD45RO~+T淋巴细胞数量呈显着正相关(r=0.446,P=0.000),胃癌组织中DC浸润多者,CD45RO~+T淋巴细胞浸润也多。生存分析结果表明,浸润DC与CD45RO~+T淋巴细胞数量均多者(A组:DC≥7.7个/HPF和CD45RO~+T淋巴细胞≥12.34%/5HPF)术后生存率高,中位生存时间和5年生存率分别为77个月和84.9%。而两者浸润均少者(C组:DC＜7.7个/HPF和CD45RO~+T淋巴细胞＜12.34%/5HPF)术后生存率低,中位生存时间和5年生存率分别为34个月和14.3%。A组和C组的生存曲线比较,差异有显着性意义(P＜0.001)。多因素Cox Regression生存分析显示,DC浸润数量(P=0.000;OR,0.893;95%CI,0.850-0.939)和淋巴结转移(P=0.006;OR,2.236;95%CI,1.257-3.976)可作为影响预后的独立因素。结论胃癌组织中DC浸润数量是影响预后的独立因素,可作为有效的预后指标之一。而联合检测胃癌组织中DC和CD45RO~+T淋巴细胞能更准确的反应胃癌微环境的免疫状态。胃癌组织中浸润DC与CD45RO~+T淋巴细胞数量均多者术后生存率高,预后好,提示DC和CD45RO~+T淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫反应中具有重要作用。实验结果为胃癌临床治疗策略与方案的选择提供实验依据。
李晨[4]2013年在《胃癌患者术前中性粒细胞淋巴细胞比率（NLR）与淋巴结转移相关性临床研究》文中研究表明目的:探讨胃癌患者术前中性粒细胞淋巴细胞比率(NLR)与淋巴结转移的关系，来指导胃癌术中淋巴结的清扫，以减少对肿瘤微环境局部免疫状态的破坏。方法:选取2006年1月至2008年12月于我科行胃癌根治术患者244例做回顾性研究，其中男性184例(75.4％)，女性60例(24.6％)，平均年龄58.3岁(29岁-85岁)。收集患者术前中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、血小板计数。以NLR=4为临界点将患者分为高NLR组及低NLR组。收集患者术中切除淋巴结数，计算淋巴结转移率、转移度。按清扫总数是否大于15枚分为≥15枚组及<15枚组。收集患者术后病理TNM分期情况并随访。按肿瘤大小、临床病理分期、Borrmann分型及术中淋巴结清扫进行分层分析。以NLR为因变量对胃癌患者临床病理分期及术中淋巴结检出情况进行多因素回归分析，比较两组患者的5年生存率，分析NLR是否为胃癌患者预后的独立预测指标。结果:1.术前NLR与淋巴结转移相关。淋巴结转移率（度），NLR≥4组高于NLR<4组。淋巴结转移≥N1，NLR≥4的患者比例明显较高，淋巴结分期增高(P<0.05)。2.NLR与肿瘤大小、临床分期及Borrmann分型相关。NLR均值高，肿瘤直径≥4cm，BorrmannⅢ、IV型患者增加。NLR均值随着胃癌临床分期的进展增高，病理分期偏晚。3.术前NLR与淋巴结清扫范围相关。术中淋巴结清扫总数，术前NLR均值偏高者大于术前NLR均值偏低者，差异有统计学意义(P<0.05)。4.术前NLR与预后相关。高NLR组患者5年生存率明显较低NLR组差(32％VS54％，P<0.05)。肿瘤浸润超过肌层，淋巴结转移，远处转移的患者NLR较高(P<0.05)。影响预后的相关临床病理因素的单因素分析结果提示：肿瘤浸润深度，淋巴结转移及远处转移是影响预后的高风险因素，多因素分析显示：高NLR是影响术后肿瘤患者预后的独立危险因素(HR1.036-2.288，P<0.05)。结论:1.胃癌患者术前NLR的高低，可以在一定程度上预测淋巴结转移的程度，对患者术前淋巴结分期有提示作用，可以作为术前淋巴结分期的补充，有利于提高术前淋巴结分期的准确性。2.胃癌患者术前NLR的高低，对术中淋巴结清扫有指导意义，可以做为术前确定淋巴结清扫范围和清扫数量的参考指标之一，对避免过度清扫或清扫不足有重要帮助。3.NLR值可以做为一个独立风险因素，对预测胃癌患者预后有一定的价值。增高的NLR提示肿瘤的预后不良。4.NLR是机体免疫状态重要的反映指标之一，也是反映肿瘤状态最简明的生物学标志物。临床应用方便、经济、实用、可操作性强。
宋振川[5]2004年在《胃癌局部免疫状态及共刺激分子4-1BBL的基础与临床研究》文中研究指明根据卫生部卫生信息统计中心公布的资料，2001年居我国城市死因第一位的是恶性肿瘤，死亡率为135.59/10万，其中胃癌居肿瘤死因的第叁位。虽然目前对胃癌采取了多手段的综合治疗，且生存率较以往有所提高，但仍无大的治疗突破。其难以治愈的原因之一与肿瘤的免疫逃逸有关,本研究旨在通过监测胃癌患者局部和全身的免疫状况,进一步探讨肿瘤的免疫逃逸机制,寻找一个新的有效的治疗方法,以提高肿瘤病人的生存率。人体的抗肿瘤免疫是以T细胞介导的细胞免疫为主，T细胞的活化需双信号刺激：第一信号由T细胞抗原受体（TCR）与抗原提呈细胞（APC）上的抗原肽MHC分子复合物结合提供，第二信号由APC上的共刺激分子与T细胞上的相应配体提供，只有双信号共同刺激才能有效激活特异性的T细胞，完成细胞免疫，消灭肿瘤细胞。大量研究证实肿瘤细胞可通过缺乏共刺激分子的方式逃避机体免疫。共刺激分子包括：B淋巴细胞激活抗原（B7）、细胞间粘附分子(ICAMs)、淋巴细胞功能相关抗原(LFA-3)、血管内皮粘附分子（VCAM-1）、热稳定抗原（HSA），以及近期发现的4-1BB等。它们与其相应的配体结合，发挥共刺激作用。自1989年Know等首次发现4-1BB，直到1996年在日本召开的国际CD命名大会上将hu4-1BB统一命名为CD137，人们对4-1BB及其配体4-1BBL进行了大量的研究，发现4-1BB属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，4-1BBL属肿瘤坏死因子(TNF)超家族。4-1BB是一种存在于细胞膜表面的Ⅱ型膜糖蛋白，它不仅表达于活化的Ｔ淋巴细胞，亦可表达于单核细胞、粒细胞及树突状细胞(DC)等细胞上；其配体4-1BBＬ(hu4-1BBL)是存在于细胞表面的Ⅱ型膜蛋白，表达于经CD3单抗活化的CD4+Ｔ细胞克隆PL11、EBV转染的Ｂ细胞系MP1、单核细胞系THP1、MOTE以及神经细胞瘤SKNSH，也表达于脑、胎盘、肺、骨骼，在心脏、肝脏、胰腺等器官亦有少量表达。4-1BB/4-1BBL是除CD28/Ｂ7之外的另一对关键的共刺激信号，在细胞间相互作用、细胞粘附、抗原递呈、Ｔ细胞共刺激以及信号传导中<WP=5>起不同的作用。虽然4-1BB的发现仅有15年，但4-1BB及其配体(4-1BBL)在复杂的细胞免疫网络中所起的作用越来越受到重视。目前对共刺激分子在胃癌中的研究已经成为研究的焦点之一，尤其是B7分子、细胞间粘附分子(ICAMs)、血管内皮粘附分子（VCAM-1）和热稳定抗原（HSA）国内均有报道，另外有关4-1BBL的研究，国内少有报道，仅见关于肝癌的研究，但未见胃癌4-1BBL基因的研究报道。胃癌患者免疫状况（CD4+、CD8+T细胞的含量及NK细胞活性、IL-18和IFN-γ等）的研究国内外多是测定外周血中的含量，本研究用灵敏度极高的RT-PCR方法测定胃癌及癌周组织（胃粘膜、大网膜、小网膜、腹膜及淋巴结）内的4-1BBL、IL-18表达，用流式细胞术测定胃癌、癌周组织及外周血中的CD4+、CD8+T和NK细胞的含量，更加进一步说明胃周局域免疫问题，以指导临床对胃癌的局部和全身的免疫治疗。目前国内外尚未见此类报道。通过基因工程技术，人们已经将各种细胞因子基因或MHCI类、II类分子基因导入各种肿瘤细胞，以其能增加肿瘤细胞的免疫原性，激活机体抗肿瘤免疫效应。研究表明通过基因导入的方法增强4-1BBL/4-1BB相互作用，可显着放大T细胞介导的抗肿瘤免疫效应，显示了良好的应用前景。本实验首次应用脂质体方法把4-1BBL基因转染入小鼠胃癌MFC细胞，以探讨4-1BBL基因对荷胃癌小鼠在肿瘤的形成、生长以及其全身免疫功能的影响，为将来的基因治疗奠定理论和实验基础。第一部分 胃癌、癌周淋巴结、网膜及腹膜中T淋巴细胞亚群和NK细胞分布的研究目的: 恶性肿瘤患者常存在免疫功能障碍，且多表现在细胞免疫方面，并随着肿瘤的发展而逐渐加重。本文通过检测胃癌手术患者的胃癌、癌周正常胃粘膜、胃周淋巴结、大网膜、小网膜、腹膜组织及外周血中T淋巴细胞亚群和NK细胞数以探讨胃癌局部及全身的免疫状况。方法: 选取2003年3月~2003年6月我院胃癌住院手术患者<WP=6>40例，术中取新鲜胃癌组织、癌周正常胃粘膜、胃周淋巴结、大网膜、小网膜、腹膜组织各1.0g左右，同时抽取患者外周血1ml，肝素抗凝。利用流式细胞术测定胃癌患者的癌组织、癌周正常胃粘膜、胃周淋巴结、大网膜、小网膜、腹膜及外周血的CD4+、CD8+ T细胞及NK细胞的含量。取22例良性疾病患者的胃粘膜和外周血做对照。结果: 良性疾病对照组的CD4+、CD8+、NK细胞计数和CD4+/CD8+比值在胃粘膜中的含量分别为42.09%±4.13、24.68%±2.43、22.08%±3.06和1.72±0.20，在外周血中的含量分别为41.56%±3.68、20.98%±2.97、29.34%±3.81、1.98±0.36；良性疾病对照组的CD4+、CD8+、NK细胞计数和CD4+/CD8+比值均高于胃癌患者（P<0.01）。本组所取淋巴结经病理证实有转移的为18枚，无转移的有22枚。转移组淋巴结组织内的CD4+、CD8+、NK细胞计数和CD4+/CD8+比值分别为23±6.23、18.57±3.97、11.41±2.72及1.24±0.19；无转移组淋巴结组织内的CD4+、CD8+、NK细胞计数和CD4+/CD8+比值分别为25±6.44、19.91±4.42、12.67±3.69及1.25±0.22(Fig.3)。与转移组相比，无转移组的CD4+、CD8+、NK细胞计数和CD4+/CD8+比值均显示出较高?
王李杰[6]2014年在《胃癌患者机体免疫相关细胞因子预测化疗疗效及生存期的前瞻性研究》文中研究指明背景与目的：胃癌患者机体免疫状态在肿瘤的生长过程中发挥着重要作用。检测外周血中免疫因子蛋白水平、mRNA水平，分析胃癌患者免疫状态及与临床病理特点之间的关系，观察化疗过程中机体免疫状态的变化趋势，判断机体免疫状态对化疗疗效、预后的影响，寻找能够预测化疗疗效、复发风险及预后的免疫标记物。方法：第一部分，纳入2013年01月至2014年01月在我科住院治疗的胃癌患者，ELISA和RT-PCR方法检测外周血中IL-2、IL-6、TGF-β、HIF-1α、PD-1、PD-L1、CTLA-4的蛋白水平和mRNA水平，分析胃癌患者免疫状态及其与临床病理特征的关系；第二部分，采用前瞻性研究设计，收集胃癌术后患者每周期化疗前外周血，检测上述指标在辅助化疗过程中的表达水平，观察化疗过程中机体免疫功能的变化趋势；第叁部分，检测晚期胃癌患者上述指标在一线治疗过程中的表达水平，判断治疗过程中机体免疫功能及变化趋势，分析免疫指标与近期疗效、预后的关系。结果：1、共纳入116例胃癌患者，外周血中IL-2、PDL-1蛋白含量低于健康对照组（P<0.01），CTLA-4高于健康对照组（P<0.01）；mRNA水平检测中HIF-1α、PD-1高于健康对照组（P<0.01），PD-L1低于健康对照组（P<0.01）；健康对照组免疫指标间表达水平呈正相关（R>0.60，P<0.01），各免疫因子蛋白含量与mRNA水平呈正相关（R>0.90，P<0.01）；胃癌患者各免疫指标在蛋白水平均呈正相关（R>0.40，P<0.01）；IL-2、IL-6、TGF-β、PD-1、PDL-1、CTLA-4间mRNA呈正相关（P<0.01），HIF-1α与TGF-β、PDL-1呈负相关（P<0.05）；IL-2、IL-6、TGF-β、PDL-1、PD-1、CTLA-4蛋白水平与mRNA水平呈正相关（R>0.50，P<0.01），HIF-1α表达呈负相关（R=-0.49，P<0.01）。2、胃癌患者免疫指标与临床病理特点关系的研究中，IL-6、TGF-β、HIF-1α、CTLA-4、PD-1蛋白含量，男性低于女性患者（P<0.05）；肝转移者IL-6、TGF-β、HIF-1α、PDL-1的蛋白水平低于无肝转移者（P<0.05）。在mRNA水平检测中，男性患者HIF-1α的表达低于女性（P<0.01）；肝转移患者HIF-1α、PD-1的mRNA水平低于无肝转移者（P<0.05）。3、胃癌术后辅助化疗过程中各免疫指标变化呈一定的趋势，IL-2、IL-6、TGF-β、HIF-1α、PD-1、PD-L1蛋白水平总体上呈现出先下降后上升的趋势，CTLA-4呈锯齿状的变化趋势；mRNA水平变化滞后于蛋白水平，IL-2、IL-6、TGF-β、PD-L1、CTLA-4mRNA在第2周期上升，第3或4周期下降至最低点，之后迅速上升，HIF-1α、PD-1mRNA水平呈先上升后下降变化。4、晚期胃癌患者化疗过程中各免疫指标蛋白水平变化呈先下降后上升的变化趋势；mRNA水平在化疗过程中显示出先上升后下降的过程，滞后于蛋白水平。5、化疗达到PR的胃癌患者，IL-2、IL-6、TGF-β、PDL-1、CTLA-4蛋白水平高于PD患者，HIF-1α、PD-1则低于PD患者；在mRNA水平检测中，PR患者IL-2、IL-6、TGF-β、PD-1高于PD患者，HIF-1α、PDL-1、CTLA-4则低于PD患者（P>0.05）。6、治疗有效（PR+SD）的患者免疫指标在化疗过程中变化趋势相对一致，呈现先下降后上升，变化幅度较大；治疗无效（PD）患者整体变化较平稳。结论：1、无论健康人还是胃癌患者，个体之间免疫功能独立性强、差异性大，机体内部各免疫指标关系密切、变化一致；2、胃癌患者机体免疫处于抑制，女性患者在胃癌发病过程中机体免疫反应较强，男性免疫功能易受到抑制；肝转移患者免疫功能降低更明显；3、胃癌术后辅助化疗过程中早期联合免疫治疗可能提高患者免疫功能；4、IL-2、IL-6、TGF-β、PDL-1蛋白水平升高患者可能化疗疗效更好，免疫指标变化幅度大提示治疗有效。
雷晓晔[7]2010年在《GrB和PFP在胃癌中表达及意义与局部免疫状态的初步研究》文中指出研究背景和目的：胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤,其发生是一个复杂的过程。一般认为,胃黏膜上皮经慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和非典型性增生之后,可能会发展为胃癌。当肿瘤发生后,机体可通过免疫效应机制发挥抗肿瘤作用。近年来认为,在抗肿瘤免疫效应中,细胞免疫是抗肿瘤免疫的主力,体液免疫通常起协同作用。细胞免疫的效应细胞主要为活化的细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL)和自然杀伤细胞(Nature killer cell, NK),它们可通过穿孔素(perforin, PFP)/颗粒酶B(granzymeB, GrB)介导的细胞毒途径和Fas/Fas-L介导的细胞凋亡途径发挥作用,其中PFP/GrB介导的细胞毒作用是主要途径。GrB是CTL和NK细胞中含量最丰富、发挥细胞毒作用最快且有效的颗粒酶,是主要的效应分子。PFP是发挥细胞毒作用的另一特征性标志物,它与GrB共存于活化的CTL和NK细胞胞浆中。GrB与PFP主要表达于CD4+ CTL、CD8+CTL及NK细胞,其中以CD8+CTL和NK细胞为主,故在肿瘤组织中浸润的GrB+和PFP+的淋巴细胞密度可直接反映肿瘤局部免疫状态。近年来国内外研究发现,GrB和PFP不仅存在于CTL和NK细胞中,而且也存在于其它一些细胞中,尤其值得关注的是在肿瘤细胞中发现GrB和PFP的表达。目前研究显示,它们不仅可在一些淋巴肿瘤细胞中表达,而且也发现GrB、PFP在人体乳腺癌和肺癌等上皮源性癌细胞中的表达。我们先前研究发现,GrB在胃良恶性组织中也有表达,并认为胃癌组织中表达的GrB可能发挥其细胞毒作用抑制周围的局部免疫反应,但GrB+的胃癌细胞是否具有细胞毒淋巴细胞(CLs)的生物学特征尚不清楚。胃黏膜是由多种不同结构和功能的细胞所构成的一种十分复杂的上皮组织,由此发生的恶性肿瘤—胃癌是如何发生的?起源于哪一种细胞?起始部位何在?发生发展过程如何?这些问题的解决有赖于进行胃癌组织发生的研究。近年有研究显示,胃癌细胞还可能起源于骨髓源性细胞(BMDC)提出了胃癌细胞非上皮起源的新学说。在我们先前研究基础上,本研究旨在探讨GrB和PFP在胃癌中的表达情况及意义与局部免疫状态的关系。全文分两部分：在第一部分,主要探讨PFP在良恶性胃上皮细胞是否亦有表达?其表达是否与GrB有共表达关系?旨在揭示GrB+胃癌细胞是否具有细胞毒淋巴细胞样的生物学表型特征。从而可能为胃癌细胞的非上皮起源学说提供了强力佐证,为进一步研究GrB+胃癌生物学功能奠定基础。在第二部分,主要探讨在胃癌患者其胃切缘-癌旁-癌组织中浸润的PFP+ TIL细胞密度的变化,从而揭示胃癌局部免疫状态的变化及其意义。方法：选取术前未进行放疗、化疗、免疫治疗及其它治疗,经外科行胃癌根治性或姑息性切除术后患者标本35例,收集其相应完整的临床及病理学资料。采用免疫组织化学PV法同步检测胃癌患者的切缘组织-癌旁组织-癌组织-相应转移淋巴结组织中GrB与PFP蛋白的表达情况以及肿瘤周围浸润PFP+ TIL细胞数量及分布情况并结合临床病理进行分析。结果：第一部分：1、GrB蛋白在胃切缘组织、癌旁组织、癌组织中均有表达,阳性率分别是40.00%(14／35),42.86%(15／35),48.57%(17／35),相互之间差异无显着意义(P>0.05)；同步检测PFP,发现在所有患者的胃切缘、癌旁、癌组织中PFP均为阴性表达,仅见胃不同部位组织间质中PFP+ TIL细胞有散在表达可作阳性内对照；同时发现GrB+与GrB胃癌组织对应胃切缘组织、癌旁组织GrB表达率均有显着性差异；2、GrB在胃癌组织中的表达水平与患者的年龄、组织分化程度、浸润深度及TNM分期病理因素无显着差异,(P>0.05)；而与患者的性别、淋巴结转移两组间的差异显着,(P<0.05)。3、GrB在淋巴结转移灶胃癌细胞中也有表达,35例胃癌患者中共有23例淋巴转移,GrB在淋巴结转移灶胃癌中表达率为52.2%(12／23)。而相应的原发癌灶中GrB表达率为26.1%(6／23),两者之间无显着差异,(P>0.05)。第二部分：1、在胃切缘组织、癌旁组织、癌组织中均可看到不同程度浸润于组织间质中的PFP+ TIL细胞。切缘与癌旁比较(P<0.01)；癌组织与癌旁比较(P<0.01)；切缘与癌组织比较(P>0.05)。2、胃癌组织周围浸润的PFP+TIL细胞密度在浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有显着性差异, (P<0.05)。结论：根据目前实验结果GrB阳性胃癌细胞不与PFP共表达,即GrB在良恶性胃上皮细胞表达不依赖于PFP,未能证实GrB+胃癌细胞具有淋巴毒细胞表型,对于胃癌非上皮起源学说(BMDC起源)尚不能提供强有力的佐证,需进一步大样本量的研究。GrB可能参与GrB+胃癌发生的全过程,是胃癌形成的早期事件,具体作用机制尚需进一步研究。PFP+ TIL细胞在癌旁中的密度显着高于癌巢中的,提示胃癌组织局部PFP+ TIL细胞数量减少,局部免疫能力下降,有助于肿瘤的增殖和转移。PFP+ TIL细胞在肿瘤间质浸润密度与预后可能成正相关密度高的患者预后可能较好,但具体作用机制需进一步阐明。
刘羽[8]2012年在《应用蛋白质组学技术鉴定胃癌分化相关蛋白及Serpin B1表达与机制的研究》文中指出胃癌是常见的恶性肿瘤，其致死率居全球癌症死亡原因的第二位，而在我国胃癌居恶性肿瘤死亡原因的首位。即使患者接受了标准的根治性切除手术，术后进行规范化的治疗，进展期胃癌的5年生存率仍然徘徊在30%～40%左右。影响胃癌预后的因素很多，其中肿瘤细胞的分化程度起着十分重要的作用。不同分化程度的胃癌细胞，其增殖分化、侵袭转移的能力有所不同，肿瘤细胞的分化程度也可随肿瘤的进展而发生变化，如果这个过程可以通过干预某些基因或者信号通路达到抑制甚至逆转的目的，将会对患者的预后起到积极的作用，这是本实验设计的初衷。蛋白质组学（proteomics）及其相关技术是近年来新兴的分子生物学分支，是以基因编码的所有蛋白质组为研究对象，在整体水平上分析细胞内动态变化的蛋白质的组成成份、表达水平及修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，从而揭示蛋白质功能及其与细胞生命活动规律的关系以及基因表达调控机制的一个新的研究领域，其核心技术是以双相凝胶电泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE）为主的蛋白质分离技术和以质谱（mass spectrometry, MS）、生物信息学（Bioinformatics）为主的蛋白质鉴定技术。这些技术具备高通量、高灵敏度、高分辨率、可重复性强、高度自动化等优势，非常适合对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，配合相应分析软件和数据库，可以在短时间内处理大量的数据。正因为如此，蛋白质组学技术在肿瘤研究中的应用成为热点，针对胃癌患者细胞、组织、血清、胃液的蛋白质组学研究屡见报道，内容也覆盖诊断、治疗、功能机制等多个方面。研究发现，胃癌的某些基因及其表达产物确会随疾病的发生发展而产生变化，并通过特定途径影响肿瘤的侵袭、转移等一系列过程。但在针对组织进行的研究中，大多是将胃癌组织和正常组织进行对比，如Jing等发现核基质蛋白hnRNP-A2/B1在胃癌组织中高表达，其可能通过影响某些促癌基因和抑癌基因的相互作用而影响胃癌的发展，是胃癌潜在的诊断标志物之一；Cai等发现胃贲门癌易出现转移，可能与糖代谢途径中某些酶类代谢异常有关，受此影响丙酮酸进入叁羧酸循环的量明显增多，并促进肿瘤细胞的生长和转移，抑制该途径可为胃癌治疗提供潜在的靶点。除此之外，蛋白质组学技术应用于不同分化胃癌组织的对比研究却非常少见，因此本实验在前期工作的基础上进一步对不同分化程度胃癌组织中的差异蛋白进行分离鉴定，具有较强的先进性及临床实用价值。实验的第一部分到第二部分使用先进的双向荧光差异凝胶电泳技术（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）结合LTQ离子阱型质谱仪对不同分化程度胃腺癌组织的差异表达蛋白质进行筛选鉴定，去除结构蛋白及功能非特异性蛋白后确定6种可能与胃癌分化有关的蛋白质，为丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（serine protease inhibitor,clade B, member1，Serpin B1），钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3），转录因子Nm23-H1，腺嘌呤磷酸核糖基转移酶APRT （AdeninePhosphoribosyltransferase In Apo And Amp），谷胱甘肽巯基转移酶Pi-1（GST-π-1），抗菌肽Dermcidin-lL，这为今后研究奠定了基础。第叁部分对Serpin B1、annexinA3、Nm23-H1、APRT在不同分化胃癌组织中的表达进行了验证。考虑到丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（Serpin B1）在肿瘤中的研究相对较少，并可能与一些肿瘤的侵袭和转移能力有关，因此第四至第五部分对Serpin B1进行了更深入的研究，进一步验证了Serpin B1在胃癌细胞及组织中的表达并探讨了Serpin B1与胃癌临床生物学行为的关系并就Serpin B1对人胃癌细胞侵袭能力影响的机制进行了初步研究。结果发现Serpin B1在胃腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常胃组织并与某些临床生物学行为有关，提示Serpin B1可能通过某些通路参与了肿瘤的进展并与其恶性程度存在潜在联系，Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞BGC823后对其中Serpin B1蛋白表达有明显抑制作用，并可有效降低胃癌细胞的侵袭及迁移能力，此过程可能是通过调节某些因子的表达实现的。虽然本实验证实Serpin B1的表达影响了胃癌细胞的侵袭转移能力，但是恶性肿瘤的发生和进展是多种基因和蛋白质相互作用的结果，任何单个基因均难以全面说明肿瘤复杂的生物学行为，且Serpin B1在胃癌中更深层次的机制仍需深入研究。今后的研究中，我们将继续利用蛋白质组学技术对不同样品的整体蛋白质表达情况进行检测，研究对象将不只限于组织和细胞，具有不同分化转移潜能的胃癌患者的血液、体液均可以作为研究对象，通过研究对比蛋白表达的差异及相互关系来阐明肿瘤可能的发生发展机制，并对其功能进行深入探讨，这种全面地、动态地、定量地分析，对阐明肿瘤发病机制、判断治疗效果、评估预后等方面都将具有潜在的重要价值。本课题五部分的具体内容如下：第一部分双向荧光差异凝胶电泳分离不同分化胃癌组织中的差异蛋白目的：将不同分化程度的胃癌组织中的蛋白质进行分离，找到其中的差异点，通过分析这些差异蛋白的功能与相互关系，可能达到的目的：①寻找潜在的诊断指标；②为肿瘤机制研究提供理论依据；③通过干预这些差异蛋白的表达，将有可能达到逆转肿瘤恶性行为的目的；④以此作为药物的分子靶标，有可能通过阻断相关信号通路、控制基因突变、阻止肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的生长增殖而起到治疗肿瘤的作用。另外本实验还可验证双向荧光差异凝胶电泳技术在胃癌组织研究中的实用价值。方法：以不同分化程度的胃癌组织为研究对象，将纯化后的蛋白质应用双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）法进行蛋白质分离，电泳后进行荧光扫描并用Deep Purple进行后染色，采用Typhoon TRIO扫描，扫描得到的数字化图像用DeCyder Differential Analysis Software进行分析，找到差异明显的点，生成pick list导入Ettan spot picker进行挖点。结果：1.分化好、分化差两组胃癌组织标本分别用不同颜色的荧光染料标记，共胶分离后其各自的特异高表达蛋白将以各自所标记的荧光色彩呈现，结果显示不同分化程度胃癌组织中的确存在一些明显的差异蛋白质点，某些特异蛋白在分化差的腺癌中明显高表达，而另外一些则在分化好的腺癌中明显高表达。还有一些点表现为两种荧光染色的重合，可以认为是在不同分化类型胃癌中均有表达，这些蛋白质点虽不属于不同分化类型胃癌组织的差异蛋白，但有可能特异的存在于胃癌组织中，对今后的实验仍有潜在价值。2.选取背景清晰、分辨率高、重复性好的胶图，应用DeCyderDifferential Analysis Software选取39个差异明显的蛋白点，这些蛋白质点在分化好的样品中上调的有18个，下调的有21个（分化差的样品中则反之）。用Ettan spot picker进行挖点，以备第二部分实验使用。结论：1.以2D-DIGE作为分离技术对不同分化程度胃癌组织进行差异蛋白的分离，实验灵敏度高、结果准确、重复性好，但过程复杂，专业性强，实验成本高，说明2D-DIGE虽适用于临床组织学样本的研究，但广泛推广仍需过程。2.实验从不同分化的胃癌组织中分离出多个差异明显的点，说明不同分化程度的胃癌组织蛋白表达具有差异性，值得进一步研究。第二部分应用液相色谱-质谱联用技术鉴定双向荧光差异凝胶电泳分离出的差异蛋白质目的：应用通量高、速度快的LTQ离子阱型质谱仪配合相应分析软件和数据库对实验第一部分分离出的差异点进行鉴定，将鉴定出的差异蛋白质进行筛查，选取其中可能与分化密切相关的蛋白质作为进一步研究的对象并对其功能进行初步分析。方法：将第一部分实验中分离得到的差异蛋白点，通过胶内酶解制成待测样品，采用top-down技术，对差异表达的蛋白利用LTQ XL增强型离子阱型质谱仪，通过nanoESI-LC-MS/MS的分析方法进行蛋白质组学研究。LC-MS/MS数据使用Data dependent模式，操作软件为Xcalibur2.0Software。应用BioWorks3.3.1软件中的SEQUEST运算方法进行数据库检索。FASTA形式的蛋白数据库采用人类蛋白序列数据库，反库利用全部NCBI蛋白数据来生成，以确定其假阳性率。结果：1.双向荧光差异凝胶电泳中切取差异明显的蛋白质点39个，共鉴定出48种蛋白质，筛选后经功能分析确定6种可能与肿瘤分化有关的蛋白质，为丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（serine protease inhibitor, clade B,member1，Serpin B1），钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3），转录因子Nm23-H1，谷胱甘肽巯基转移酶Pi-1（GST-π-1），腺嘌呤磷酸核糖基转移酶APRT，抗菌肽Dermcidin-lL。2.对比胶图发现Serpin B1、annexinA3在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而APRT、Nm23-H1、GST-π-1、Dermcidin-lL则在分化好的胃腺癌中表达增强。结论：1.双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）结合LTQ XL离子阱型质谱仪，通过nanoESI-LC-MS/MS的分析方法进行蛋白质组学研究，非常适合临床蛋白质标本的大规模的平行分离和分析，该质谱仪具有高度自动化、高通量、高速度扫描等优势，可以在短时间内进行大规模数据处理。2. Serpin B1、annexin A3在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而APRT、Nm23-H1、GST-π-1、Dermcidin-lL则在分化好的胃腺癌中表达增强，提示这些蛋白的表达与分化程度密切相关，可能直接或间接影响着胃癌的侵袭转移等特质，值得深入研究。3.初步分析显示这些差异蛋白质在细胞信号传导、维持细胞形态及正常防御功能、促进细胞分裂增殖及细胞凋亡、侵袭转移等方面具有重要价值，但在胃癌中的作用尚待研究。4.经鉴定得出的48种蛋白质，并非均为分化相关蛋白质，有些是结构蛋白或功能非特异性蛋白，说明鉴定结果的特异性仍有待提高，这些蛋白在进一步实验前予以筛除。一些差异点未鉴定出对应的蛋白质，这可能与实验过程中蛋白磷酸化（中性丢失）、甲基化等修饰作用有关或是这些蛋白酶解后没有形成理想的适宜质谱鉴定的片断，另外也可能与SEQUEST算法的问题有关。第叁部分应用Western blot及qRT-PCR技术验证不同分化胃癌组织中选定差异蛋白质的表达目的：对鉴定出的丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（serine protease inhibitor,clade B, member1，Serpin B1），钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3），转录因子Nm23-H1，腺嘌呤磷酸核糖基转移酶APRT（Adenine Phosphoribosyl-transferase In Apo And Amp）在胃癌中的表达进行验证，观察组织中这些因子的表达情况是否与蛋白质组学鉴定的结果相符。方法：1.应用qRT-PCR法对检出的因子在mRNA水平上进行验证，以GAPDH为内参照基因，计算得到目的基因表达的相对定量值，经对比P <0.01或0.05有统计学意义。2.提取总蛋白，应用Western blot法对检出的差异蛋白进行验证，以GAPDH为内参照。利用BioRad图像分析系统测定蛋白条带的积分光密度值，以目的蛋白与内参照蛋白的IOD值的比值表示目的蛋白的表达水平。结果：1.应用qRT-PCR技术对不同分化程度胃癌组织中四种差异蛋白的mRNA表达水平进行验证，结果显示：丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（SerpinB1）、钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3）在分化差的胃腺癌组织中表达增强，转录因子Nm23-H1、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）则在分化好的胃腺癌中表达增强（P均<0.01），与蛋白质组学所得结果符合。2.应用Western blot技术对不同分化程度胃癌组织中四种差异蛋白的表达水平进行验证，结果显示：丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（Serpin B1）、钙磷脂结合蛋白Ⅲ（annexin A3）在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而转录因子Nm23-H1、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）则在分化好的胃腺癌中表达增强，结果也与蛋白质组学所得结果吻合。结论：1.无论从mRNA或蛋白水平上进行验证，Serpin B1、annexinA3、Nm23-H1，APRT在不同分化胃癌组织中的表达结果均与蛋白质组学鉴定结果相符合，即Serpin B1、annexin A3在分化差的胃腺癌组织中表达增强；Nm23-H1、APRT则在分化好的胃腺癌组织中表达增强。这说明本研究的可信性较高，所得蛋白质点确与胃癌分化密切相关。2.对SerpinB1、annexin A3、Nm23-H1，APRT的分析显示，这些蛋白质在胃癌细胞信号传导、维持细胞形态及正常防御功能、促进细胞分裂增殖及细胞凋亡、侵袭转移等方面具有重要价值，并同时涉及胃癌的其他生物学特性，这些蛋白的表达与胃癌细胞分化类型的不同密切相关，进一步研究有可能找到关键的分化相关因子，通过干预这些因子的表达有可能抑制甚至逆转胃癌细胞的恶性分化，以其作为靶标开发治疗药物，将有望提高胃癌的治疗效果并改善预后。第四部分胃癌组织中Serpin B1的表达情况及其与胃癌临床生物学行为的关系目的：检测Serpin B1在胃腺癌组织与胃正常组织中的表达水平是否存在差异，分析Serpin B1在胃腺癌组织中的表达及其与临床生物学行为之间的关系，探讨Serpin B1在胃癌诊断、疗效监测、预后评价上的实用价值及其与肿瘤进展之间的内在联系并为进一步研究奠定基础，初步分析Serpin B1作为胃癌治疗靶点的可能性。方法：收集临床病理资料完整的80例胃腺癌组织作为实验组，40例胃正常组织作为对照组，参照2010版WHO胃肿瘤临床病理学分类及分期方法将临床病理资料分组，应用免疫组织化学方法检测胃腺癌组织与胃正常组织中Serpin B1的表达情况，用统计学软件SPSS13.0分析Serpin B1蛋白的表达与胃癌临床病理参数之间的关系。结果：1.Serpin B1在胃腺癌组织中的阳性表达率71.25%，而正常组织表达率为15%，两组之间有显着差异（P<0.01）。2.胃癌组织中SerpinB1蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位、是否远处转移等均无明显关系（P>0.05），但与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及临床分期等关系密切（P <0.01或0.05）。结论：1. Serpin B1蛋白在胃腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常胃组织，说明Serpin B1在胃癌中的表达具有一定的特异性，可作为胃癌的肿瘤标志物进一步开展临床研究。2. Serpin B1蛋白表达与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期、脉管瘤栓等关系密切，提示Serpin B1阳性表达可能与肿瘤的侵袭、转移等特性有关，Serpin B1参与的某些功能可能加速了病情的进展，干扰Serpin B1的表达有望作为胃癌靶向治疗的手段。第五部分Serpin B1对人胃癌细胞株侵袭能力影响的机制研究目的：探讨Serpin B1在不同分化程度胃癌组织和细胞中的表达及对胃癌细胞侵袭能力的影响并对其相关机制进行分析。方法：蛋白印迹技术检测胃癌组织、癌旁正常组织及胃癌细胞株中Serpin B1表达情况；合成针对Serpin B1的siRNA并转染胃癌细胞株BGC823；细胞划痕实验及Transwell小室侵袭实验观察Serpin B1-siRNA转染BGC823胃癌细胞后对其侵袭和迁移活性的影响；检测转染前后侵袭和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9、ICAM-1及TIMP-1表达的变化。结果：1. Serpin B1在胃腺癌组织和细胞中的表达明显高于在癌旁正常组织中的表达，且随分化程度的降低而显着升高（P均<0.01）。2. SerpinB1-siRNA转染BGC823细胞株后对细胞株中Serpin B1表达有明显抑制作用，且抑制效果在剂量浓度为80nmol/l，作用时间为48小时最为明显。3.细胞划痕实验显示，Serpin B1-siRNA转染后（80nmol/l，48h）的BGC823细胞，修复划痕的能力在各时间点较Control组均明显降低（P均<0.01）。Transwell小室侵袭实验结果显示，Serpin B1-siRNA转染后的BGC823细胞，迁移到膜对侧的细胞数较Control组明显降低（P<0.01）。两实验均提示转染后的胃癌细胞株侵袭和迁移活性受到明显的抑制。4. SerpinB1-siRNA转染的胃癌细胞株BGC823经48h后，侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、ICAM-1mRNA及蛋白表达和活性明显降低，而TIMP-1mRNA及蛋白表达则显着增加。结论：1. Serpin B1不仅在分化差的胃癌组织中的表达明显高于分化好的胃癌组织，在胃癌细胞株中也是如此，说明组织和细胞的同源性和相似性。2. Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞BGC823后对其中Serpin B1蛋白表达有明显抑制作用，并可有效降低胃癌细胞的侵袭迁移能力。3. SerpinB1-siRNA转染胃癌细胞后致其侵袭迁移活力降低可能是通过下调ICAM-1、MMP-2、MMP-9，上调TIMP-1而发挥作用的。综合上述五部分内容，本研究小结如下：1.双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）结合LTQ离子阱型质谱仪，通过nanoESI-LC-MS/MS的分析方法进行蛋白质组学研究非常适合临床蛋白质标本的大规模的平行分离和分析，实验具有高度自动化、高通量、高灵敏度、结果准确、重复性好等优点，值得临床推广。但整体实验过程较复杂，专业性强，实验成本较高，临床研究中广泛应用仍需过程。2.实验证实不同分化程度的胃癌组织中蛋白表达确存在着明显差异，本研究从39个差异明显的蛋白质点中鉴定得到48种蛋白质，个别经质谱仪鉴定未得出数据的蛋白质点可能与实验过程中蛋白的磷酸化、甲基化等影响有关，去除结构蛋白及功能非特异性蛋白后确定6种可能与肿瘤分化有关的蛋白质，它们在不同分化程度的胃癌组织中表达各有不同。应用qRT-PCR及Western blot法对其中4种进行验证，所得结果与蛋白质组学结果符合，说明本研究的可信性较高，鉴定出的蛋白质点确与胃癌分化密切相关。3.分化相关蛋白Serpin B1、annexin A3在分化差的胃腺癌组织中表达增强，而APRT、Nm23-H1、GST-π-1、Dermcidin-lL则在分化好的胃腺癌中表达增强，初步分析这些蛋白质在胃癌细胞信号传导、维持细胞形态及正常防御功能、促进细胞分裂增殖及细胞凋亡、侵袭转移等方面具有重要价值，并同时涉及胃癌的其他生物学特性，这些蛋白的表达与胃癌细胞分化类型的不同密切相关，进一步研究有可能找到关键的分化相关因子，通过干预这些因子的表达有可能抑制甚至逆转胃癌细胞的恶性分化，以其作为靶标开发治疗药物，将有望提高胃癌的治疗效果并改善预后。4. Serpin B1蛋白在胃腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常胃组织，说明Serpin B1在胃癌中的表达具有一定的特异性，可作为胃癌的肿瘤标志物进一步开展临床研究。Serpin B1蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位、是否远处转移等无明显相关性，而与肿瘤的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期、脉管瘤栓等关系密切，提示SerpinB1阳性表达可能与肿瘤的侵袭、转移等特性有关，Serpin B1参与的某些功能可能加速了病情的进展，干扰Serpin B1的表达有望作为胃癌靶向治疗的靶标。5.应用qRT-PCR及Western blot法对Serpin B1在不同分化程度胃癌细胞株（BGC823、SGC7901、MKN28）中的表达进行验证，结果进一步说明了Serpin B1在胃癌组织和细胞中表达的一致性，其在分化程度差的组织和细胞中的表达均明显升高，可作为胃癌诊断及分化判断的特异蛋白质。6. Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞BGC823后对其中Serpin B1蛋白表达有明显抑制作用，并可有效降低胃癌细胞的侵袭迁移能力，虽然该研究尚处于初步阶段，但在一定程度上预示了其临床实用价值，以此作为治疗手段有可能抑制胃癌的恶性行为，提高患者生存期。7. Serpin B1-siRNA转染胃癌细胞后致其侵袭迁移活力降低可能是通过调节金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9及其抑制剂TIMP-1之间的平衡、干扰细胞间粘附分子ICAM-1而发挥作用的，确切的机制仍需进一步研究。
刘辉[9]2013年在《胃癌局部微环境吲哚胺2，3-双加氧酶表达与记忆性T细胞及其亚群分布相关性研究》文中研究说明研究目的：肿瘤可以通过多种方式逃避免疫系统的监控,其中IDO和记忆性T细胞是近年来在肿瘤免疫逃逸机制中备受关注的两个重要因素,两者在肿瘤的发生发展过程中都起着重要作用,且Treg细胞对两者的调控都有明显影响,但两者之间是否具有相关性目前尚无定论。本研究的目的是探讨胃癌患者肿瘤局部微环境中IDO及Treg细胞标记分子Foxp3的表达情况,并分析胃癌组织记忆性T细胞及其亚群的分布特征,进一步探讨胃癌肿瘤微环境中IDO的表达与记忆性T细胞是否具有相关性。材料与方法：1、收集天津医科大学附属肿瘤医院2011年1月至2011年6月收治的胃癌患者50例,取胃癌局部组织,免疫组化方法检测胃癌局部IDO及Foxp3的表达情况,流式细胞仪检测胃癌局部记忆性T细胞及其亚群的分布情况。2、分析IDO及Foxp3的表达与临床病理特征的关系,探讨两者之间是否具有相关性；分析记忆性T细胞及亚群分布特征,其与IDO表达及Treg细胞的关系,探讨IDO与记忆性T细胞之间是否存在关联。结果：1、在胃癌微环境中,IDO的表达水平与肿瘤浸润深度有关(x2=5.773,P=0.016)：Foxp3的表达水平与年龄(F=4.071,P=0.049)及肿瘤浸润深度有关(F=5.303,P=0.026)。2、IDO表达与胃癌微环境中Foxp3的表达有相关性。其中(-)组与(++)组均值差异有统计学意义(F=I.76,P=0.02)；(-)组与(+++)组差值有统计学意义(F=3.91,P=0.034)；(+)组与(++)组均值差异有统计学意义(F=1.65,P=0.041)；(+)与(+++)组均值差异有统计学意义(F=3.80,P=0.039)。3、胃癌局部Foxp3的表达与癌组织中的CD8+Tem的分布正性相关(r=0.583,P<0.05),直线回归方程为y=1.831+0.079x。4、在胃癌局部记忆性T细胞及其亚群中,随着IDO表达水平的不断增强,CD8+Tem的表达呈上升趋势,而CD8+T以及CD8+Tcm细胞的表达无规律性。结论：1、IDO的表达水平与局部肿瘤的浸润深度相关,提示随着肿瘤侵犯正常组织的增加,肿瘤组织内IDO的表达水平也会相应增加；Foxp3的表达水平与年龄及肿瘤浸润深度有关；胃癌局部组织中,IDO的高表达可能通过Treg细胞介导的免疫抑制来发挥作用。2、胃癌组织局部,Foxp3的表达与癌组织中的CD8+Tem的分布正性相关；随着IDO表达水平的增强,CD8+Tem细胞也呈现上升趋势,提示IDO与CD8+Tem细胞之间存在着一定关系,而以Foxp3为标记分子的Treg细胞可能介导两者之间的调控。
王龙跃[10]2013年在《免疫细胞和sIL-2R等细胞因子及HER-2蛋白在胃癌患者中的表达研究》文中研究表明目的：通过检测胃癌患者外周血各淋巴细胞亚群和CD4+CD25+CD127LowTreg细胞以及sIL-2R、TSGF等相关细胞因子水平,同时分析与胃癌患者的病理类型、临床分期的关系分析,探索胃癌患者中Treg细胞、sIL-2R、TSGF与胃癌发生发展的失衡,为我们进一步研究Treg细胞在胃癌进展中的作用,提供一定依据,进一步为胃癌相关诊断及治疗提供新的思路。方法：采用流式细胞仪和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测137例胃癌患者、50例健康人外周血中淋巴细胞亚群、Treg细胞占CD4+T细胞的比例,以及相关细胞因子sIL-2R、TSGF的表达水平。分析研究对象的临床资料,包括：性别、年龄、胃癌肿瘤部位、肿瘤大小、病理分化类型、术后病理分期、淋巴结转移情况、肿瘤浸润深度及脉管、神经侵犯情况、是否有远处转移等相关水平关系。探讨胃癌患者外周血淋巴细胞亚群以及sIL-2R、TSGF细胞因子和Treg细胞比例分布与研究对象各项主要临床指标间的关系。采用SPSS18.0统计软件对实验数据进行统计分析。结果：1.胃癌患者外周血CD3+T细胞水平为70.4891±10.36%(n=137),高于健康对照组69.7820±6.90%(n=50)(P>0.05),胃癌患者外周血CD4+T细胞水平为37.1876±7.98%(n=137),低于健康对照组39.3540±6.38%(n=50)(P>0.05)。两者差异均无统计学意义。2.胃癌患者外周血CD8+T细胞水平为30.5489±11.35%(n=137),显着高于健康对照组24.8180±6.18%(n=50)(P<0.05)。3.胃癌患者外周血CD4+/CD8+水平为1.2015±1.92%(n=137),显着低于健康对照组为2.2064±3.54%(n=50)(P<0.05)。4.胃癌患者外周血Treg调节性T细胞占CD4+细胞的比例为7.0496±2.41%(n=137),显着高于健康对照组(6.1120±1.22%)(n=50)(P<0.05)。5.胃癌患者中sIL-2R为345.3577±100.07u/ml与对照组相比(326.4523±95.75u/ml),具有统计学差异(P<0.05)。6.胃癌患者中TSGF为66.3285±9.29u/ml与对照组相比(58.3175±6.21u/ml),具有统计学差异(P<0.05)。7.胃癌患者外周血NK细胞水平为5.8577±4.22%(n=137),显着低于健康对照组为9.9600±4.26%(n=50)(P<0.05)。8. NK细胞在不同分期胃癌患者外周血中检测0、Ⅰ、Ⅱ期、Ⅲ、Ⅳ期水平逐渐降低,0+Ⅰ期(n=17)NK细胞水平为7.8357±4.42%,Ⅱ期(n=23)为5.4000±3.78%,Ⅲ期(n=82)为5.5575±4.22%,Ⅳ期(n=15)为4.6125±2.76%,健康对照组为9.9600±4.26%(n=50),Ⅰ、Ⅱ期、Ⅲ、Ⅳ期均显着低于健康组(P<0.05)。9.胃癌外周血Treg表达在淋巴结转移阳性患者组为7.5425±2.53%(n=99),高于淋巴结转移阴性患者组,但无统计学差异,(6.8427±2.35%,n=38)(P>0.05)。10.有淋巴结转移的胃癌患者血浆中TSGF水平为67.5455±9.24(n=99),显着高于无淋巴结转移者63.1579±8.75(n=38)(P<0.05)。11.有淋巴结转移的胃癌患者血浆sIL-2R水平为351.2626±87.80u/ml(n=99),显着高于无淋巴结转移329.9737±126.69u/ml(n=38)(P<0.05)。12.胃癌外周血Treg细胞和TNM分期有着显着的相关性(r=0.283,P<0.05),TNM分期越晚,Treg细胞表达率越高。胃癌患者血浆中TSGF水平与胃癌TNM分期正相关(r=0.219, P<0.05), TNM分期越晚,TSGF表达水平越高。胃癌患者血浆中sIL-2R水平与胃癌TNM分期正相关(r=0.19,P<0.05),TNM分期越晚,sIL-2R表达水平越高。13.胃癌患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比率与NK细胞比率呈负相关(r=-0.203,P<0.05),随着Treg细胞增加,NK细胞水平降低。胃癌外周血Treg细胞比率与血浆中sIL-2R水平无相关性,胃癌外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比率与血浆中TSGF水平无相关性。结论：1.胃癌患者外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞降低、CD8+T细胞升高和CD4+/CD8+T细胞比例降低,NK细胞水平降低,通过以上各个指标,能够反应肿瘤患者机体细胞免疫的整体改变。对于CD4+T/CD8+T细胞亚群,都包含有调节性/抑制性T细胞,因此其检测结果可能不能全面反应患者免疫状况,联合Treg的检测可能是一个较好的选择。2. Treg细胞在胃癌患者的外周血中表达较健康对照组显着增高,胃癌外周血中Treg细胞比例分布与肿瘤TNM分期密切相关,而且Treg细胞的百分比随TNM分期增加而增加且成正向直线相关的关系,胃癌肿瘤细胞分泌肿瘤抑制细胞因子可能促进Treg细胞分化和增殖,胃癌肿瘤细胞会促使获得性Treg细胞的产生,使其具有Treg细胞的特征性表型,去除或减少肿瘤患者的Treg细胞,可能会提高免疫治疗效果。3.胃癌患者外周血CD4+CD25+CD127loWTreg细胞比率与患者血浆NK细胞呈负相关,提示Treg细胞发挥免疫抑制作用可能是通过调节NK细胞水平和通过抑制CD4+T细胞和NK细胞等有关抑制机体的抗肿瘤免疫功能。4.胃癌患者血清中sIL-2R和TSGF水平明显高于良性对照组,且与胃癌肿瘤临床TNM分期相关,提示胃癌患者存在免疫功能抑制,sIL-2R和TSGF水平与胃癌严重程度和预后有密切关系,提示胃癌发病和分期与免疫功能受抑有密切关系。5.胃癌患者外周血CD4+CD25+CD127loWTreg细胞比率、CD8+T细胞、CD4+T细胞等代表患者免疫水平的淋巴细胞,同时联合sIL-2R以及TSGF等与胃癌和细胞免疫功能有关的细胞因子水平,如果把这几项指标联合检测来反映患者的免疫状态可能更准确。这不仅从免疫学上可以判断肿瘤的恶性程度及发展特征,还可以从机体的免疫状态上了解肿瘤的发展状况。对疾病的控制,治疗方案的制定有重要的意义。
参考文献：
[1]. 1.抑癌基因PTEN/MMAC_1/TEP_1蛋白、整合蛋白α_5β_1在胃癌的表达及其意义 2.胃癌局部免疫状态及其影响因素的研究[D]. 周业江. 重庆医科大学. 2002
[2]. 胃癌患者外周血及肿瘤微环境记忆性T细胞及其亚群的分布特征及其意义[D]. 李昉璇. 天津医科大学. 2012
[3]. 胃癌组织中树突状细胞和记忆T淋巴细胞浸润与患者预后关系的研究[D]. 郭苹. 广西医科大学. 2008
[4]. 胃癌患者术前中性粒细胞淋巴细胞比率（NLR）与淋巴结转移相关性临床研究[D]. 李晨. 中国人民解放军医学院. 2013
[5]. 胃癌局部免疫状态及共刺激分子4-1BBL的基础与临床研究[D]. 宋振川. 河北医科大学. 2004
[6]. 胃癌患者机体免疫相关细胞因子预测化疗疗效及生存期的前瞻性研究[D]. 王李杰. 中国人民解放军医学院. 2014
[7]. GrB和PFP在胃癌中表达及意义与局部免疫状态的初步研究[D]. 雷晓晔. 泸州医学院. 2010
[8]. 应用蛋白质组学技术鉴定胃癌分化相关蛋白及Serpin B1表达与机制的研究[D]. 刘羽. 河北医科大学. 2012
[9]. 胃癌局部微环境吲哚胺2，3-双加氧酶表达与记忆性T细胞及其亚群分布相关性研究[D]. 刘辉. 天津医科大学. 2013
[10]. 免疫细胞和sIL-2R等细胞因子及HER-2蛋白在胃癌患者中的表达研究[D]. 王龙跃. 山西医科大学. 2013
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