(广西医科大学 广西 南宁 530021)
【摘要】 目的：观察地塞米松对中性粒细胞性哮喘（neutrophilic asthma，NA）模型小鼠气道炎症的影响。方法：C57BL雌性小鼠随机分成NA组、NA地塞米松干预（neutrophilic asthma treating with dexamethasone，NAD）组和正常（NC）组，每组8只。NA、NAD组予卵蛋白、脂多糖致敏并卵蛋白激发；NAD组激发前腹腔注射地塞米松；NC组不做处理。小鼠肺功能仪检测气道阻力，以阻力倍增值评价气道反应性；检测支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）有核细胞浓度及分类比例；流式细胞术检测脾脏Th17细胞及ki-67+Th17细胞比例；ELISA检测BALF IL-17浓度。结果（1）NA组气道阻力倍增值显著高于NC组（P<0.05）。（2）NAD组BALF有核细胞浓度、NEU%、EOS%均显著低于NA组，但仍高于NC组（均P<0.05）。（3）NAD组脾脏Th17细胞比例显著低于NA组，但仍高于NC组（均P<0.05）；NA、NAD组脾脏ki-67+Th17细胞比例均显著高于NC组（均P<0.05），但NA、NAD组间差异无统计学意义。（4）NAD组BALF IL-17浓度显著低于NA组，但仍高于NC组（均P<0.05）。结论：地塞米松可能通过抑制Th17细胞及IL-17表达，减轻NA模型小鼠气道炎症；Th17细胞增殖功能增强且不受地塞米松影响可能与气道炎症持续存在有关。
【关键词】哮喘；中性粒细胞；气道炎症；地塞米松
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）08-0345-03
Effect of dexamethasone on airway inflamation in the mouse model of neutrophilic asthma
【Abstract】Objective To observe the effect of dexamethasone on airway inflammation in the mouse model of Neutrophilic Asthma.Methods Female C57BL mice were randomly divided into NA, NAD and NC group.NA、NAD mice were sensitized by ovalbumin OVA and LPS and challenged by OVA. NAD mice were treated with dexamethasone at beginning of each challenge.NC mice without treatment.Airway resistance were measured and fold increase were caculated as an assessment for AHR.Total white blood cell concentration and classification of proportion were determined in the BALF.Percentages of Th17 cells and Ki-67+Th17 cells in the spleen were determined by FCM.BALF IL-17 concentration were determined by ELISA. Results (1) Fold increase of airway resistance in the NA group were higher than that of the NC group (each P<0.05).（2）BALF total cell count, neutrophil and eosinophil percentages in the NAD group were lower than that of the NA group (each P<0.05), but were higher than that of the NC group(each P<0.05). (3) Th17 cell percentages in the spleen of the NAD group were lower than that of the NA group, but were higher than that of the NC group(each P<0.05). Ki-67+Th17 cells percentage in the spleen of the NA and NAD group were higher than that of the NC group(each P<0.05);Hoever,no difference were found in the NA group compared with that of the NAD group（4）BALF IL-17 concentration in the NAD group were lower than that of the NA group, but were higher than that of the NC group(each P<0.05). Conclusions Airway inflammation in the mouse model of NA were improved by dexamethasone via its inhibition on the exspression of Th17 cells.The enhanced function of Th17 cells proliferation not influenced by dexamethasone，may be responsible for the persistence of the inflammation.
【Keywords】Asthma; Neutrophil;Airway inflammation; Dexamethasone
哮喘是最常见的慢性呼吸道疾病，其本质是多种细胞及细胞组分共同参与的慢性气道炎症。气道反应性增高、可逆性气流受限、气道黏液高分泌及不可逆性气道重塑是其特点。糖皮质激素抗炎作用良好，被广泛用于治疗哮喘。Schwartz等首先发现一组激素治疗不佳的患者，并率先提出哮喘“激素抵抗”的概念 [1]。研究表明，哮喘存在嗜酸细胞性哮喘和非嗜酸细胞性哮喘两个亚型，非嗜酸细胞性哮喘中有超过半数为中性粒细胞性哮喘，表现为中性粒细胞浸润为主的气道炎症 [2]。中性粒细胞性气道炎症被认为与哮喘发作、重症哮喘及激素抵抗均有关 [3-5]，其机制仍在研究。
Th17细胞是能够分泌IL-17的辅助性T细胞亚群，IL-17可诱导多种靶细胞分泌相关细胞因子，趋化中性粒细胞局部浸润 [6]。Th17细胞介导中性粒细胞局部浸润的作用可能与哮喘中性粒细胞性气道炎症的发生有关[7]。Wilson等发现，气道炎症以中性粒细胞浸润为主的模型小鼠，存在着强烈的Th17细胞反应，提示Th17细胞可能介导该模型小鼠中性粒细胞性气道炎症的发生[8]。McKinley等将Th17细胞灌输给小鼠并予OVA激发，小鼠气道中性粒细胞浸润明显，且不受地塞米松抑制，提示Th17细胞可能不仅介导中性粒细胞性气道炎症，还可能与激素抵抗有关[9]。基于上述研究情况，本研究参照刘晓微等方法[10]，建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型，并予地塞米松作用，观察地塞米松对模型小鼠气道炎症的影响，并探讨Th17细胞的作用。
1.材料与方法
1.1 实验对象及分组
SPF级C57BL雌性小鼠，随机分入NA组、NAD组和NC组，每组8只。
1.2 主要试剂和器材
脂多糖、卵蛋白，地塞米松磷酸钠注射液，Diff-Quik染液，FACS Calibur型流式细胞仪及抗体，ELISA 试剂盒，光学显微镜，细胞甩片机，雾化泵及喷雾器，小鼠肺功能仪等。
1.3 中性粒细胞性哮喘小鼠模型制备
NA、NAD组小鼠均于第0、6、13天经气道滴入100μg 卵蛋白及0.1μg脂多糖致敏，共3次；于第21、22、23天，均雾化吸入1% 卵蛋白激发，每天1次，每次60min；NAD组小鼠每次激发开始前30min按1mg/kg经腹腔注射地塞米松。
1.4 标本收集及指标检测
小鼠均于最后一次雾化结束后第24小时收集标本或检测指标。
1.4.1气道阻力检测 小鼠予50mg/kg 1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，气管插管，小鼠肺功能仪上依次雾化10ul倍增浓度乙酰甲胆碱（methacholine，Mch）并检测总气道阻力，以上机开始时的平稳阻力为基础阻力值R(baseline)，以吸入乙酰甲胆碱后的最高值为各浓度激发时的阻力值R(response)，以气道阻力倍增值（=[R(response)- R(baseline)]/R(baseline)）评价气道反应性。
1.4.2 BALF收集及检测 静脉留置针气管插管，0.5ml冷PBS反复灌洗支气管肺泡两次，回收BALF（回收率达80%）。血球计数板上检测有核细胞浓度，适量BALF甩片后Diff-Quik染色，光镜下分类计数并计算分类比例。
1.4.3流式细胞术检测脾脏Th17细胞及ki-67+Th17细胞的比例 取脾脏，制备脾脏单细胞悬液,PMA、离子霉素于培养箱（5%CO2，37℃）孵育刺激5小时,再经①细胞外染PerCP-Cy?5.5 Rat Anti-Mouse CD4、APC Rat Anti-Mouse CD8，②Fix/Perm Buffer细胞破膜，③细胞内染PE Rat Anti-Mouse IL-17A、FITC Mouse Anti-Human Ki-67，④1%多聚甲醛固定，流式细胞仪上机检测。
注：与NC组比较aP<0.05；与NAD组比较bP<0.05。
3.讨论
哮喘是多种细胞及细胞组分共同参与的慢性气道炎症性疾病，气道反应性增高、可逆性气流受限、气道黏液高分泌和不可逆性气道重塑是其特点。由于伦理及方法的限制，哮喘研究需借助动物模型，成功的模型制作是该类研究的基础。气道炎症和气道高反应性是哮喘最重要的两个特点，可以作为评价哮喘模型成功与否的依据。本研究参照刘晓微等 [10]的方法，建立NA小鼠模型。本研究显示，NA组小鼠在激发过程中均出现不同于NC组的行为表现，提示本研究造模措施有效。NA组小鼠BALF有核细胞浓度、NEU%、EOS%均高于NC组，且NEU%高于EOS%，表明NA组小鼠产生以中性粒细胞浸润为主的气道炎症。此外，予不同浓度Mch激发时，NA组小鼠气道阻力倍增值均高于NC组，表明NA组小鼠气道反应性增高。本研究模型小鼠具备了中性粒细胞浸润为主的气道炎症和气道高反应性，提示本研究成功建立了中性粒细胞性哮喘小鼠模型。
糖皮质激素抗炎作用良好，目前仍是控制哮喘气道炎症最常用的药物。Schwartz等发现了一组对激素治疗反应不佳的患者，并率先提出哮喘“激素抵抗”的概念 [1]。诱导痰细胞研究表明，哮喘存在嗜酸细胞性哮喘和非嗜酸细胞性哮喘两种亚型，且超过半数非嗜酸细胞性哮喘又为中性粒细胞性哮喘，患者气道炎症以中性粒细胞浸润为主 [2]。中性粒细胞性气道炎症与哮喘急性发作、重症哮喘及哮喘控制不佳均有关 [3-5]，且激素疗效不佳的患者多为中性粒细胞性哮喘[11,12]。本研究显示，予地塞米松作用后，NA组小鼠BALF有核细胞浓度、NEU%、EOS%均降低，但仍高于NC组，表明予地塞米松作用后，NA模型小鼠气道炎症虽显著减轻，但仍残留着炎症，提示在本研究中，中性粒细胞性哮喘气道炎症存在一定程度的抵抗。
Th17细胞是能够分泌IL-17的辅助性T细胞亚群，IL-17可诱导多种靶细胞分泌相关细胞因子，最终趋化并激活中性粒细胞至靶细胞局部发挥作用[6]。McKinley等人将外源性Th17细胞灌输给小鼠，发现小鼠气道中性粒细胞浸润明显增多，且地塞米松未能抑制这种由外源性Th17细胞引起的中性粒细胞性气道炎症 [9]，提示Th17细胞不仅与中性粒细胞气道浸润有关，还可能与中性粒细胞性气道炎症激素抵抗有关。本研究显示，NA组小鼠脾脏Th17比例及BALF IL-17浓度均高于NC组，表明NA组小鼠脾脏Th17细胞及气道IL-17细胞因子均增加，提示Th17细胞及IL-17可能与NA模型小鼠气道炎症的发生有关。与NA组小鼠相比，NAD组脾脏Th17细胞比例及BALF IL-17浓度均降低，表明予地塞米松作用后，NA组小鼠脾脏Th17细胞及气道IL-17均减少，提示地塞米松对NA模型小鼠脾脏Th17细胞及气道IL-17的表达均有抑制作用，并可能是地塞米松减轻NA模型小鼠气道炎症的途径。但是，NAD组小鼠脾脏Th17细胞比例及BALF IL-17浓度仍均高于NC组，表明予地塞米松作用后，NA组小鼠脾脏Th17细胞和气道IL-17仍处于异常水平，提示在本研究中，地塞米松抑制NA模型小鼠脾脏Th17细胞及气道IL-17表达的作用是有限的，Th17细胞持续表达，并可能通过分泌IL-17发挥作用，可能是NA模型小鼠气道炎症存在抵抗的原因。
Ki-67是一种与细胞增殖状态有关的核抗原，无组织特异性，可以作为细胞增殖的标志[13]。本研究显示， NA组小鼠脾脏ki-67+Th17细胞比例高于NC组，表明NA组小鼠脾脏中处于增殖状态的Th17细胞增多，提示NA模型小鼠脾脏Th17细胞增殖功能可能增强。并且，予地塞米松作后， NA组小鼠脾脏ki-67+Th17细胞比例未见显著降低，提示地塞米松可能对NA模型小鼠脾脏Th17细胞增强的增殖功能无明显抑制作用，Th17细胞增殖功能增强且不受地塞米松影响，可能是本研究中NA模型小鼠Th17细胞及IL-17持续表达的原因。
综上所述，本研究通过建立NA小鼠模型，并予地塞米松作用后发现，地塞米松能够减轻NA模型小鼠气道炎症，但Th17细胞增殖功能可能增强且不受地塞米松影响，可能是NA模型小鼠气道炎症持续存在的原因。
【参考文献】
[1] Schwartz HJ, Lowell FC, Melby JC. Steroid resistance in bronchial asthma[J]. Annals of internal medicine.1968;69(3):493-499.
[2]张毓娴,农光民,廖竞等.诱导痰液细胞学分析在儿童支气管哮喘临床分型中的应用[J].实用儿科临床杂志.2010,02:129-132.
[3] Ordonez CL,Shaughnessy TE,Matthay MA,et al.Increased neutrophil numbers and IL-8 levels in airway secretions in acute severe asthma:Clinical and biologic significance.Am J Resp Crit Care.2000; 161:1185-90.
[4]Louis R，Lau LCK，Bron AO,et al.The relationship between airways inflammation and asthma severity. Am J Resp Crit Care 2000;161(1):9-16.
[5]Ito Kazuhiro,Herbert Cristan,Siegle Jessica S,et al.Steroid-Resistant Neutrophilic Inflammation in a Mouse Model of an Acute Exacerbation of Asthma.AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY CELL AND MOLECULAR BIOLOGY.2008;39(5);543-550.
[6]Korn T, Bettelli E, Oukka M,et al.IL-17 and Th17 Cells[J]. Annu Rev Immunol.2009;27:485-517.
[7]Newcomb Dawn C,Peebles R,Stokes Jr,et al.Th17-mediated inflammation in asthma. CURRENT OPINION IN IMMUNOLOGY 2013;25( 6);755-760.
[8]Wilson RH, Whitehead GS, Nakano H,et al.Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness.Am J Resp Crit Care.2009;180(8): 720-30.
[9]McKinley L, Alcorn JF,Peterson A,et al.TH17 cells mediate steroid-resistant airway inflammation and airway hyperresponsiveness in mice.Journal of immunology(Baltimore, Md : 1950) 2008; 181(6): 4089-97.
[10]刘晓微,蒋敏,农光民等.中性粒细胞性支气管哮喘小鼠模型的建立及其气道高反应规律的研究[J].中华哮喘杂志(电子版).2013,03:1-5.
[11] Tonnel AB,Gosset P,Tillie-Leblond I.Characteristics of the Inflammatory response in bronchial lavage fluids from patients with status asthmaticus[J].Int Arch Allergy Immunol.2001; 124(1-3):267-71.
[12]Basyigit I,Yildiz F,Ozkara SK,et al.Inhaled corticosteroid effects botheosinophilic and non-eosinophilic inflammation in asthmatic patients[J].Mediators Inflamm.2004;13(4):285-291.
[13]Gerdes J,Lemke H,Baisch H,et al.Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67[J].J Immunol.1984;133(4):1710-1715.
论文作者:詹文杰
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第8期供稿
论文发表时间:2015/7/3
标签：小鼠论文; 细胞论文; 气道论文; 粒细胞论文; 哮喘论文; 炎症论文; 脾脏论文; 《医药前沿》2015年第8期供稿论文;