刘勇[1]2000年在《轮状病毒VP7基因修饰、表达及免疫原性研究》文中认为轮状病毒(Rotavirus，RV)是婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体，每年引起全世界约87万婴幼儿死亡。轮状病毒主要中和抗原VP7对发展基因工程疫苗具有重要意义。本文就如何提高VP7基因的免疫原性进行了一些探索。 首先，通过改造基因3’端，删除VP7成熟蛋白C端的1／3，利用pGEX-KG原核表达载体在大肠杆菌BL-21中实现了稳定高效表达，表达产物占菌体总蛋白的30％左右，利用Glutathione Sepharose 4B谷胱甘肽亲和纯化系统对表达产物进行分离纯化。Western Blot实验表明，表达产物可被抗轮状病毒SA11的抗体特异识别并结合。将纯化的重组抗原免疫家兔或小鼠，诱导机体产生了抗SA11病毒的中和抗体，证明原核系统表达的SA11 VP7重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。 然后，为提高VP7基因的免疫原性，对VP7基因进行修饰。用流感病毒血凝素(influenza virus hemagglutinin)信号肽替换VP7野生型信号肽，促使VP7分泌表达；通过在分泌型VP7基因下游融合流感病毒血凝素膜锚和胞质结构域编码序列，构建了表达后可锚定于宿主细胞膜表面的VP7基因。将修饰前后的VP7基因在Hela细胞中进行表达检测，免疫荧光实验证明，VP7分泌和跨膜基因修饰达到了预期效果。把野生型、分泌型和膜锚定型VP7基因分别插入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3的CMV启动子下游，构建DNA疫苗。用携带三种不同形式VP7基因的DNA疫苗分别免疫小鼠，比较其免疫原性。在此基础上，用VP7 DNA疫苗和大肠杆菌表达的VP7抗原联合免疫小鼠，探讨重组抗原蛋白对VP7 DNA疫苗免疫原性的影响。三种VP7基因DNA免疫以及和重组VP7抗原蛋白的联合免疫均在小鼠体内诱导产生了SA11中和抗体。无论有否蛋白抗原同时使用，VP7基因分泌或跨膜修饰都未能显著增强其
刘馨[2]2004年在《重组轮状病毒VP4抗原的表达及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理由于轮状病毒(Rotavirus，RV)引起的婴幼儿腹泻至今没有特效治疗药物，因此研制疫苗仍是预防该疾病的热点。目前轮状病毒疫苗的研制有减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，遗传重组疫苗，核酸疫苗以及基因工程载体疫苗。无论何种形式的疫苗，其目的都是要刺激机体产生特异性免疫反应。作为消化道感染性疾病，特别希望能诱导局部分泌性免疫。本论文就轮状病毒重要中和抗原(Viral Protein 4，VP4)基因做了基因修饰，及原核和真核系统的表达研究；对修饰后表达产物免疫原性进行了评价。 VP4是轮状病毒的外壳蛋白，具有血凝素、病毒吸附、决定病毒毒力等多种功能。我们的研究选择了轮状病毒SA11株VP4基因作为目的基因。SA11株的VP4基因长度为2363个碱基对(bp)，成熟蛋白有776个氨基酸(aa)，分子量为87kD左右。为了探讨提高抗原免疫原性的可能性，我们通过两种方式修饰了VP4基因。第一种修饰是在VP4基因的5′端引入来自于小鼠IgH链的分泌信号肽序列SG(139bp)，记为SG-VP4，目的是为了使野生型VP4基因获得糖基化；第二种修饰是除在5′端引入信号肽序列，还在VP4基因3′端引入来自人HLA Ⅰ类分子α链的3′端部分TM(750bp)，记为SG-VP4-TM，目的是使获得糖基化的VP4向胞外分泌，并停留于细胞膜，拟提高免疫原性。两种修饰基因都以基因组的构型引入，信号肽序列有一个内含子，而转膜基因含有两个内含子。表达之后，19个氨基酸的信号肽序列将被切除，而转膜基因的64个氨基酸将保留下来。表达之后，由于存在信号肽的作用，VP4被糖基化，分子量增至97kD左右。 我们将修饰后的VP4基因克隆至穿梭质粒中，与腺病毒载体共转染
参考文献：
[1]. 轮状病毒VP7基因修饰、表达及免疫原性研究[D]. 刘勇. 中国协和医科大学. 2000
[2]. 重组轮状病毒VP4抗原的表达及免疫原性研究[D]. 刘馨. 中国协和医科大学. 2004