（上饶市人民医院血液科 江西 上饶 334000）
【摘 要】目的： 研究尿多酸肽（CDA-2）在耐药急性白血病中的作用。方法：MTT法检测CDA-2对K562及K562/A02细胞增殖的影响，流式细胞术研究细胞凋亡及细胞内阿霉素浓度的改变。结果：CDA-2能显著抑制两种细胞株的生长，呈时间依赖性和浓度依赖性。CDA-2能诱导两种细胞的凋亡，能增加耐药细胞中阿霉素的浓度。结论：CDA-2是一种有前景的逆转急性白血病耐药的药物。
【关键词】急性白血病；多药耐药；尿多酸肽
【中图分类号】R733,7 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0554-02
耐药是急性白血病化疗失败、疾病复发、病人死亡的主要原因。白血病的耐药表现为不仅对一种药物的耐受，而且对不同作用机制的多类药物的耐受，也就是多药耐药。多药耐药形成机制包括细胞内药物排出增多（如多药耐药蛋白P-gp过表达）、细胞解毒作用增强（如GST-π过表达）、DNA损伤修复能力增强（如O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶增多）等。其中P-gp过表达是最主要的多药耐药的机制。P-gp是细胞膜表面的一种糖蛋白，它能将细胞内的药物主动“泵”至细胞外，从而减少药物对细胞的毒性作用。如何绕过P-gp的泵作用、逆转耐药，提高白血病的治疗效果是当前白血病研究的重大课题。K562/A02是一种高表达P-gp的多药耐药K562细胞株，它可在含2ug/ml的阿霉素的培养体系中长期生存，是体外研究多药耐药的一个良好的细胞模型。
尿多酸肽（CDA-2）是从健康人尿中分离、提取的由多种有机酸和多种小分子多肽组成的水溶液[1]，在MDS中具有诱导原始细胞凋亡的作用。有文献报道[2]CDA-2对急性白血病细胞株（K56-2）细胞有一定的生长抑制作用，但对于耐药急性白血病细胞的效果如何，尚无文献报道。本文利用K562/A02细胞株为耐药急性白血病的模型，研究尿多酸肽对耐药急性白血病的体外效果。
1 材料和方法
1.1 细胞株及培养条件
K562及K562/A02细胞株由本科实验室传代保存。将细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养。K562/A02细胞培养体系中加入终浓度为2μg/ml的阿霉素（ADM）以维持其耐性。实验前2周K562/A02细胞培养体系撤除阿霉素。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2 MTT法检测细胞增殖
取对数生长期细胞，调整细胞浓度，以1×105/ml的终浓度接种于96孔板，加入不同浓度的药物，空白对照组以培养基补足。每孔总体系200μl。CO2孵箱内培养24或48小时（h），每孔加MTT工作液20μl，置于培养箱内再孵育4h。1000转/分离心，小心吸去上清，加入DMSO 200μl/孔，吹打，使紫蓝色甲臜充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度值（A），以时间为横轴，A值为纵轴，绘制生长曲线图。实验重复三次，每次设3个复孔，取平均值为最终结果。按下列公式计算细胞增殖率：
细胞生存率=（A处理组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%
细胞生长抑制率=100%-细胞生存率
1.3 AV-PI法检测细胞凋亡
细胞以2×105/ml的浓度接种于6孔培养板，分别加入2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml的CDA-2，同时设空白对照。12小时后收获细胞，1000rpm离心5分钟，收集1×106个细胞。冷PBS洗涤2遍，细胞重悬于100μl 1×Binding buffer，置于流式细胞仪专用试管中。加5μl Annexin V FITC和5μl碘化丙碇（PI），轻轻混匀，避光室温反应15分钟，上流式细胞仪。
1.4 流式细胞术测定细胞内阿霉素浓度：
K562/A02细胞以2×105/ml的浓度接种于6孔培养板，第一孔设为空白对照，不加药物；第二孔加入2μg/ml的ADM，第三孔加入6mg/ml CDA-2及2μg/ml ADM，培养24小时。收集1-5×105个细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。加入适量冷PBS，细胞重悬，1000rpm离心5分钟，重复2次。以冷PBS重悬细胞，上机行流式细胞检测。流式检测激发波长488nm，接收波长575nm.。
1.5 统计分析：实验数据均为计量资料，数据之间的比较采用独立样本t检验。所有数据经SPSS11.5统计分析。以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1CDA-2对K562及K562/A02有相似的生长抑制作用
我们用MTT法检测了CDA-2对两种细胞株的生长抑制作用，结果显示不同浓度的CDA-2作用于两种细胞株24小时后，能够明显抑制细胞的生长，而且CDA-2浓度越高，生长抑制作用越强，呈剂量依赖性（图1）。而且，同一浓度CDA-2对K562细胞的抑制作用略强于对耐药细胞K562/A02的作用，但这种差异无统计学意义。CDA-2作用于两种细胞48小时后，同样能够呈剂量依赖性地抑制两种细胞的生长（图1）。此外，CDA-2作用于细胞48小时后对细胞的生长抑制率明显高于24小时的生长抑制率（P<0.05），呈现时间依赖性(图2)。
3 讨论
多篇文献报道了CDA-2抑制急性髓细胞白血病细胞株生长的作用。周宏等[3]报道0.5—2mg/ml的CDA-2有明显的抑制NB4细胞增殖的作用。而宋辉等[2]报道0.015-0.25mg/ml的CDA-2能抑制K562细胞的生长，而且这种抑制呈时间依赖性和浓度依赖性。这些结果与我们的结果相似。我们的研究也发现CDA-2对K562细胞有明显的生长抑制作用，且呈剂量依赖性。但与以往的文献比较，我们的CDA-2浓度较高。究其原因可能与测定细胞生长抑制的方法不同（本文采用MTT法，宋辉等采用台盼蓝拒染法）有关。相比较而言，我们的浓度与周宏等的较接近，尽管我们的浓度仍较他们略高，但这种差异可能与不同细胞株对药物的敏感性不同有关。
我们的研究显示，同一浓度的CDA-2对K562及K562-A02细胞有相类似的生长抑制率，这提示CDA-2的作用不受p-gp的影响。但是，CDA-2对K562的生长抑制作用略强于K562A02，尽管这种差异无明显统计学意义，这种差异又提示CDA-2的作用可能部分受p-gp的影响。CDA-2的这种部分受p-gp的影响的特性可能与它是一种多肽混合物有关。其中的某些成分受p-gp的影响，而另一些成分并不受p-gp的影响，因而导致了CDA-2对耐药细胞与敏感细胞类似的抑制率，但同时耐药细胞的抑制率又略低于敏感细胞。如果能将CDA-2进一步纯化成单一的多肽，则有可能分离出不受p-gp影响物质，为今后逆转白血病耐药打下坚实的基础。
药物可通过细胞坏死、凋亡、自噬等途径抑制细胞生长。我们用AV-PI法检测发现CDA-2作用于两种白血病细胞后出现早期凋亡细胞，且这种凋亡细胞的量随着药物浓度的增加而增加。这说明CDA-2是通过诱导细胞凋亡抑制K562及K562/A02细胞生长的。
我们的研究进一步证实，CDA-2能增加细胞内阿霉素的浓度，这提示CDA-2能抑制p-gp的将细胞内药物“泵”至细胞外的作用，从而增加细胞内化疗药物的浓度，提高化疗药物的杀细胞效果。由于K562/A02能长期在含阿霉素的环境下长期生存，若以阿霉素来研究CDA-2与化疗药物是否有协同作用，可能结果会有误差，因此，CDA-2是否能提高化疗药物的疗效，尚有待今后进一步用CDA-2和其他药物联合研究。
总之，CDA-2能通过提高细胞内药物浓度、诱导细胞凋亡抑制耐药急性白血病细胞株的生长，是一种有前景的逆转急性白血病耐药的药物。
参考文献：
[1]廖明徵．聪明的抗癌药CDA-2[M]．台北：世贸出版社，1999：149．
[2]宋辉，杨涛，郭媛媛，李峰敏，董平，于艺冰，刘文. 尿多酸肽对慢性髓性白血病K562细胞增殖及凋亡的影响.实用临床医药杂志[J].2013,17（14）:1-4.
[3]周宏，万海英，李冬. 尿多酸肽诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株凋亡的实验研究.同济医科大学学报（医学版）[J]，2012，33（4）：13-18.
论文作者:沈佳坤,郑林,董慧娟
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月供稿
论文发表时间:2016/6/1
标签：细胞论文; 浓度论文; 细胞株论文; 白血病论文; 抑制论文; 作用论文; 阿霉素论文; 《河南中医》2015年8月供稿论文;