韩春雨[1]2000年在《利用分子标记辅助选择加速培育大豆种子脂肪氧化酶缺失近等基因系的研究》文中提出大豆子叶中有三种主要的脂氧酶（Lox），这些酶的催化产物可转变为有“豆腥味”的己烯醇或己烯醛类小分子，是影响大豆食用品质、储藏品质和加工品质的重要抗营养因子之一。因此，用分子标记辅助选择加速培育脂氧酶缺失近等基因系的研究具有重要的理论和实践意义。 本研究以我国的黄淮地区高产、高蛋白、抗大豆花叶病毒病的优良品种鲁豆4号为受体，以美国和韩国引进的两套Lox-s缺失体材料为供体进行杂交，在分离世代用等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF）筛选缺失体，对筛出缺失体后代进行表现型和SSR分子标记两个方面的遗传背景选择，选出的与鲁豆4号相似的个体在用鲁豆4号回交转育。探讨了加快培育鲁豆4号Lox-s缺失近等基因系的方法。 主要的研究结果如下： （1）通过改进的IEF技术识别产生豆腥味最明显的Lox-2杂合体，可实现连续回交转育，结合农艺性状和分子标记选择，将大大缩短培育缺失Lox-2回交育种年限。 （2）大豆种子三种Lox的遗传规律分析结果，再次证明了三种Lox分别受lx_1，lx_2和lx_3单基因控制，lx_1与lx_2的基因是紧密连锁的，而和lx_3相对独立遗传。 （3）对各个世代的各缺失体后代群体分别进行了农艺性状聚类分析，从各回交群体选择出与轮回亲本最相似的个体，作为进一步用鲁豆4号回交转育的对象。 （4）鲁豆4号与Century的BC_0F_4和BC_2F_2分别进行两种背景选择方法比较和评价，结果表明，在较低世代根据农艺性状聚类分析进行选择的效果比较好，但在较高世代，由于个体间表型变异缩小，使鉴别效率下降。在回交高代，可采用不受环境影响，变异丰富的SSR标记进行聚类分析，选择遗传背景与鲁豆4号相似的个体用鲁豆4号回交转育。 （5）鲁豆4号与Century的回交最高代BC_2F_2比自交最高代BC_0F_4更易得到与鲁豆4号相似的个体。
刘渊, 张孟臣, 张彩英, 马峙英[2]2007年在《大豆脂氧酶分析鉴定技术的研究进展及在育种中的应用》文中指出大豆脂肪氧化酶分析鉴定技术是将大豆种子中分离与纯化的脂肪氧化同工酶,利用遗传分析、免疫、色谱分析、显色等方法进行定性或定量的分析,检测品种的脂氧酶缺失类型。随着无腥味大豆育种研究的深入,现已育成品种的商品化生产,食品加工业的蓬勃发展,对大豆脂肪氧化酶鉴定技术要求不断提高和改进。综述了大豆脂肪氧化同工酶的生物特性、遗传学特点及其各种分析鉴定技术的优缺点、灵敏度和适应范围,并且认为,在比较分析的基础上,以选择有益材料培育新种质、新品种的辅助育种和食品加工的鉴定为目的,使用最经济有效的检测手段是快速准确筛选缺失品种的合理策略。进一步讨论了大豆脂肪氧化酶分析鉴定技术运用于辅助育种所存在的问题和应用前景。
刘渊[3]2005年在《大豆脂肪氧化同工酶（Lox1）单克隆抗体的制备及其检测应用》文中研究指明大豆种子中存在约占总蛋白含量1%的脂肪氧化酶(Lipoxygenase,简称Lox),包含3种同工酶Lox1、Lox2、Lox3,通过催化不饱和脂肪酸氧化,产生共轭的过氧化氢物,可直接与食品中的蛋白和其他营养成分结合,降低豆制品的食用性和营养价值,最后生成醛、酮、醇等有异味的小分子挥发性物质,使豆油及豆制品产生豆腥味,苦涩及青气味。大豆脂肪氧化酶成为限制大豆营养价值和食品风味的主要抗营养因子。近年来,科技工作者就脱腥问题进行了多方面的研究,在加工工艺不理想的情况下,采用回交转育的方法进行遗传改良,利用快捷、灵敏、有效的检测手段筛选缺失脂氧酶的后代,建立缺失品种的近等基因系,将是去除豆腥味和改善大豆营养品质的有效途径。研究表明大豆脂肪氧化酶是球形的水溶性蛋白质,分子量为94～97KD,符合免疫学研究的要求,可作为完全抗原进行免疫。为此,本实验制备大豆脂肪氧化同工酶(Lox1)的单克隆抗体,并建立了Lox1的检测方法。 利用薄板等电聚焦凝胶电泳(IEF-PAGE)鉴定大豆脂肪氧化酶的缺失近等基因系材料,Lox2缺失的情况下,Lox1向pH偏小的方向迁移;Lox1缺失,该酶带消失;Lox3缺失,Lox3a存在,Lox3b蛋白带消失。检测后不同缺失类型的子粒分装保存。并设计通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)进行分离,调整分离胶浓度为10%,浓缩胶的浓度为5%,经过分析不同缺失类型,推断出代表大豆脂肪氧化酶同工酶Lox1、Lox2、Lox3的特异性蛋白条带。本文通过电泳洗脱仪回收三种大豆脂肪氧化同工酶的蛋白条带,考虑到纯化后Lox1的纯度及其酶活均远大于Lox2、Lox3,并且适当减少后期繁重的工作量,仅以Lox1作为免疫抗原。采用紫外分光光度法测定其浓度:①0.1896mg/ml②0.7607mg/ml③0.0769mg/ml,其酶活为76.668%。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定该酶蛋白的分子量约为94 000 dal左右。以Lox1作为完全抗原,采取皮下多点注射,并参照适当的程序设计免疫方案,强化其免疫应答反应,经过间接ELISA测定免疫血清效价为1:1600。同时用完全DMEM培养液孵育骨髓瘤细胞达到对数生长期,可将已免疫BALB/C小鼠的脾细胞和SP_2/O鼠骨髓瘤细胞进行融合,建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞的阳性克隆,通过有限稀释法,获得9株能稳定传代且分泌抗大豆脂肪氧化酶Lox1单克隆抗体的杂交瘤细胞,各株单抗的效价均在1:64以上。仍然采用间接ELISA测定Lox1的方法,验证3株单抗与其他脂肪氧化酶类型没有交叉反应。通过对其特异性的鉴定,确立了产生大豆脂肪氧化酶Lox1高度特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进而利用间接酶联免疫技术进行Lox1缺失与否的鉴定。以期为今后制备Lox2、Lox3的单克隆抗体提供实验技术基础;为种质资源的创新,食品加工的工艺改良以及辅助遗传育种提供投资少、见效快的鉴定方法;也为进一步研究大豆脂肪氧化酶同工酶的蛋白作用机制提供新的研究方向。
马建[4]2008年在《大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究》文中进行了进一步梳理本项研究应用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因核心保守序列，构建高效的具有hpRNA和ihpRNA结构的大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体。通过花粉管通道法将其导入大豆，抑制大豆脂肪氧化酶基因的表达，调控脂肪氧化酶的生物合成过程。以期通过基因工程手段，改变大豆脂肪氧化酶合成途径，降低大豆脂肪氧化酶含量，提高大豆油份含量，培育具有优良品质的大豆品种。取得如下结果：1．改造植物表达载体pCAMBIA1301，去除其臂内潮酶素基因，并在臂内按逆时针方向添加一个从质粒pBI121上酶切下来的35S启动子。2．以大豆品种“吉农18号”的基因组DNA为模板，选取大豆三种脂肪氧化酶同功酶基因同源性最高部分，通过PCR扩增得到大豆脂肪氧化酶基因片段，将其克隆到pMD18-Tvector载体上，测序结果表明：克隆片段大小为357bp。对比NCBI基因Bank，与已发表的基因一致。将大豆脂肪氧化酶基因片段按正向+反向的顺序插入到pCAMBIA1301 35S启动子下，构建大豆脂肪氧化酶基因hpRNA干扰表达载体pC1301LoxRi。通过花粉管通道法转化大豆品种“吉农18号”，获得T0代转化籽粒，萌发后以单棵植株叶片的总DNA为模板，以pCAMBIA1301臂内GUS基因设计一对引物进行PCR扩增，结果从6棵植株中扩增得到720bp的特异带，回收该条带连接于pMD18-Tvector载体并测序，结果显示其为要扩增的GUS基因片段。为进一步确定外源基因的整合情况，从PCR阳性植株中随机抽取2株进行Southern blot分析。结果表明，转化株均有杂交带出现，外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入，而未经转化的植株没有杂交信号出现，证明外源基因已整合到大豆基因组中。以转基因大豆籽粒的总RNA反转录成的cDNA为模板做RT-PCR，从电泳条带的亮度上看，转基因植株和非转基因植株的内标18SRNA含量相同，而内源脂肪氧化酶mRNA的含量明显降低。3．克隆了大豆“吉农18号”自身的一段内含子，片段长度230bp，将其插入到表达载体pC1301LoxRi的正义基因片段和反义基因片段中间，构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体pC1301LoxiRi。通过花粉管通道法转化大豆品种“吉农18号”，获得T0代转化籽粒，萌发后以单棵植株叶片的总DNA为模板，以pCAMBIA1301臂内T-DNA区GUS基因设计一对引物进行PCR扩增，结果从18棵植株中扩增得到720bp的特异带，回收该条带连接于pMD18-Tvector载体并测序，结果显示其为要扩增的GUS基因片段。为进一步确定外源基因的整合情况，从PCR阳性植株中随机抽取3株进行Southern blot分析。结果表明，转化株均有杂交带出现，外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入，而未经转化的植株没有杂交信号出现，证明外源基因已整合到大豆基因组中。以转基因大豆籽粒的总RNA反转录成的cDNA为模板做RT-PCR，从电泳条带的亮度上看，转基因植株和非转基因植株的内标18SRNA含量相同，而内源脂肪氧化酶mRNA的含量明显降低。4．以T1代转化的籽粒为材料，采用紫外分光光度法对脂肪氧化酶活性进行了测定，结果显示，转pC1301LoxRi质粒大豆的脂肪氧化酶活性分别为降低62％，转化pC1301LoxiRi质粒大豆的脂肪氧化酶活性减低74％。说明外源基因的导入有效地抑制了脂肪氧化酶基因的表达。5．以T1代转化的籽粒为材料，采用SDS-PAGE电泳，结果显示转化pC1301LoxRi质粒大豆的脂肪氧化酶含量比对照平均降低55％，转化pC1301LoxiRi质粒大豆的脂肪氧化酶含量比对照平均降低71％。6．以T1代转化的籽粒为材料，转基因植株蛋白质的凯氏定氮和索氏提取测定结果显示，转基因植株蛋白质含量均有所下降，脂肪含量均有所上升：其中转化pC1301LoxRi质粒植株蛋白质含量平均为36.06％，比非转基因对照降低0.95个百分点(非转基因蛋白质含量37.01％)，最大降低1.28百分点达到35.73％，脂肪平均含量23.89％，比非转基因对照平均提高了0.74个百分点(非转基因脂肪含量23.15％)，最大提高1.09个百分点，达到24.24％；转pC1301LoxiRi质粒植株蛋白质含量平均为35.63％，比非转基因植株对照降低了1.38个百分点(非转基因蛋白质含量37.01％)，最大降低1.62百分点达到35.39％，脂肪平均含量24.33％，比非转基因对照平均提高了1.18个百分点(非转基因脂肪含量23.15％)，最大提高1.61个百分点，达到24.76％。7．观察T1代转化植株的主要农艺形状，包括：株高、节数、结荚数、单株粒数、虫食粒、百粒重，发现转基因植株与非转基因对照无明显差别。8．对转基因植株T2代的PCR分析及PCR-Southern结果证明：外源基因在转基因后代中能遗传。其分离比基本符合孟德尔的遗传规律。9．探讨了应用重组PCR构建植物基因RNA干扰构件，初步证明其是一种简便、快捷、可行、适用范围广的方法。10．初步探讨了大豆花粉管通道法的室内转化条件，证明在我国北方地区采用花粉管通道法转化大豆可以在室内进行，每年可以加代一次。本项研究首次将RNA干扰技术应用于改良大豆脂肪氧化酶含量，取得了良好效果，获得了脂肪氧化酶含量明显降低，脂肪含量明显提高的转基因大豆植株，突破了传统育种方法在改良大豆品质方面易受种质资源限制和育种时间长的缺点，为应用RNA干扰技术改良大豆品质提高大豆油份含量探索了新的途径，实现了大豆品质改良育种和高油育种的方法创新，也为以后通过RNA干扰技术改良大豆其它营养抑制因子，提高大豆品质奠定了基础，具有重要的理论和实践意义。
参考文献：
[1]. 利用分子标记辅助选择加速培育大豆种子脂肪氧化酶缺失近等基因系的研究[D]. 韩春雨. 中国农业科学院. 2000
[2]. 大豆脂氧酶分析鉴定技术的研究进展及在育种中的应用[J]. 刘渊, 张孟臣, 张彩英, 马峙英. 中国农学通报. 2007
[3]. 大豆脂肪氧化同工酶（Lox1）单克隆抗体的制备及其检测应用[D]. 刘渊. 河北农业大学. 2005
[4]. 大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究[D]. 马建. 吉林农业大学. 2008