单抗夹心ELISA检测鸡新城疫病毒抗原的研究

薛松果^[1]2004年在《单抗夹心ELISA检测鸡新城疫病毒抗原的研究》文中研究指明鸡新城疫（Newcastle Disease ND）俗称亚洲鸡瘟，是由禽副粘病毒1型（APMV-1）引起的鸡的一种高度接触性传染病。近年来，随着非典型ND传播与流行的日渐增多，传统的诊断方法已不能完全满足临床需要。本研究应用自制单抗建立的单抗夹心ELISA试验方法，可对该病作出快速、准确诊断。本文分为两部分。第一部分是鼠抗新城疫病毒（Newcastle Disease Virus NDV）单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定，第二部分是应用自制单抗建立夹心ELISA试验方法并对其反应条件进行优化。蔗糖密度梯度超速离心法纯化NDV效果良好。接种NDV F48E9株于10～11日龄鸡胚尿囊腔，平均每枚鸡胚收获尿囊液约8mL，血凝价（HA效价）在29～212之间。尿囊液粗提后再经20～60%、梯度为20%的蔗糖密度梯度超速离心法进一步纯化，在40～60%的蔗糖梯度层有一乳白色的病毒带。透析后，测其HA效价高达215，较纯化前有明显提高。用Folin酚法测得病毒的蛋白浓度约为1mg/mL。建立了筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA试验方法并对其反应条件进行优化。当纯化的NDV抗原每孔包被47ng，酶标抗体羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1∶800时，阳性对照的OD492值大于1.0，而阴性对照的OD492值小于0.1。分别用鼠抗NDV抗血清和健康鼠血清作为阳性和阴性对照，对照血清的稀释度为1∶1600。用蔗糖密度梯度超速离心法纯化的NDV作为抗原，按常规方法免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠。小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按2∶1至5∶1的比例混合，经50%PEG 4 000融合后，HAT培养基选择培养10～12天进行阳性筛选。融合细胞分置6块96孔细胞培养板培养，共576孔，其中391孔有杂交瘤细胞生长，融合率为67.9%；经间接ELISA检测上清得阳性细胞孔数40，阳性率为6.9%。挑选出其中OD492值在1.0以上的孔共10孔进行有限稀释法克隆或亚克隆。最终得到3株能稳定分泌抗体并产生腹水的杂交瘤细胞3株，分别命名为1F9、1C6、4D5。按5×105细胞/0.2 mL/只的量将3株杂交瘤细胞分别注入小鼠腹腔，约15天后，小鼠腹部明显涨大，用注射器分次收集腹水，腹水呈黄色至淡血红色不等。平均每只小鼠可获4～5mL腹水。应用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化，蛋白得率为28.2%～31.4%。对3株单抗的部分生物学特性进行鉴定，结果为：叁株单抗均具有较高的ELISA效价（1.5×104～1×105）；1F9、4D5两株单抗同时具有较高的HI效价（29，28），而中和效价（VN）偏低（二者都小于10）；单抗1C6株具有较高的VN效价(103)，却无血凝抑制能力（HI效价为0）。配对试验的结果显示：1C6、 4D5分别作为包被单抗和酶标记单抗时，ELISA反应有较高的OD492值，系统的敏感性较其它组合要高。在此基础上建立了单抗夹心ELISA试验方法，并对其反应条件进行优化。试验结果表明：酶标板经紫外线照射处理，包被单抗1C6、酶标单抗4D5-HRP分别作800倍、1600倍稀释，包被液、封闭液、酶标抗体稀释液分别选用0.05mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3、l%BSA和4%NCS-PBS，酶标抗体和底物分别作用30min和15min时所测得的阳性OD492值相对较高，阳性OD492值与阴性OD492值之比最大，试验效果最好。对单抗夹心ELISA反应系统的特异性、敏感性和重复性作了鉴定。结果表明：NDV阳性血清可特异性阻断酶标抗体与NDV之间的的反应；该系统最少可检出2.5ng/mL的NDV纯化蛋白；该系统检测阳性样品的变异系数（CV）小于5%。

于圣青, 刘秀梵^[2]1990年在《单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究》文中认为从10株抗鸡新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(MAbs) 中筛选出2株MAbs—M22和F23,分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的MAbs—夹心ELISA试验,对提纯NDV的最小检出量为25ng/ml病毒蛋白.NDV鸡阳性血清对本试验的特异性阻断作用和与其他禽类病毒交叉反应的阴性结果,证明本试验对NDV的特异性。从临床疑为鸡新城疫的724只病鸡的口腔棉试样品中共检出阳性502只,其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致,两者均查出阳性鸡176只。

蒋凤英, 胡建华, 王英, 顾彩菊, 李春华^[3]2004年在《用单抗夹心ELISA快速检测鸡新城疫病毒》文中研究表明采用传统的病毒分离的方法将免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代 ,再用新城疫单抗夹心ELISA对F1 尿囊液进行新城疫病毒 (NDV)检测。结果表明本方法具有良好的特异性 ,NDV阳性样品检出率很高 ,且鸡禽流感病毒 (AIV)对此无干扰作用 ;分别检测阳性样品 4 5 3份、阴性样品 2 95 9份 ,与动物世界卫生组织 (OIE)推荐的病毒分离及鉴定、毒力试验的经典检测方法相比较 ,符合率为 99.3%、99.7% ;测定的变异系数为 8% ,稳定性较好 ,同时本法比经典的检测方法缩短检测时间 7d。结果表明用单抗夹心ELISA法检测鸡泄殖腔棉拭样品F1 尿囊液新城疫病毒实用、准确、特异、稳定、快速。

卢建红, 张如宽, 焦新安, 刘秀楚^[4]1994年在《快速检测鸡新城疫病毒的聚乙二醇单抗夹心ELISA试验的建立和应用》文中进行了进一步梳理以抗鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）单抗夹心ＥＬＩＳＡ试验为基础，在酶标抗体（ＨＲＰ－Ｆ＿（２３））稀释液中加入４％（ｗ／ｖ）聚乙二醇（ＰＥＧ）６０００，建立了ＰＥＧ－ＥＬ１５Ａ法，使用此法检测临诊样品，与单抗夹心ＥＬＩＳＡ相比，时间缩短７０分钟且提高了ＯＤ＿（４９０）值，易于识别。结果表明，ＰＥＧ－ＥＬＩＳＡ法具有实际应用价值。ＰＢＧ能加强抗原－抗体反应的速率和强度，这种效应在固相夹心ＥＬＩＳＡ第二步表现尤其明显。ＰＥＧ的这种非特异性效应对于检测其它抗原或抗体的ＥＬＩＳＡ试验可能具有普遍意义。

高云英, 张永才, 张碧侠, 张孝君^[5]1997年在《新城疫病毒单克隆抗体研究Ⅲ酶标单克隆抗体ELISA夹心法检测鸡新城疫病毒抗原》文中研究表明应用双抗体ＥＬＩＳＡ夹心法检测禽类新城疫病毒（ＮＤＶ）抗原，用单克隆抗体或多克隆抗体包被固相载体，将活化的４０孔板作为捕捉待检新城疫病毒抗原，以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）与单克隆抗体的结合物作为示踪抗体，比较了单克隆抗体和多克隆抗体的捕捉效率。结果表明，ＮＤＶ单抗２Ｃ１２、４Ｈ１０优于血清ＩｇＧ，同时确定了双抗体ＥＬＩＳＡ夹心法对不同日龄健康鸡组织产生背景反应的Ｏ．Ｄ．值基本参数，以Ｘ＋２ＳＤ为判定阈值。捕捉抗体２Ｃ１２、４Ｈ１０的工作浓度为５００～４００μｇ／ｍｌ；示踪抗体２Ｃ１２、４Ｈ１０的工作浓度为１∶３０００～１∶２０００，ＥＬＩＳＡ夹心法的灵敏度可达４μｇＮＤＶ蛋白／ｍｌ；对ＮＤＶ不同毒株感染鸡各脏器的ＮＤＶ检出率为：肾１００％、肺９０％。证明用双抗体ＥＬＩＳＡ夹心法检测鸡新城疫病毒抗原特异，敏感，是禽类新城疫病毒检测的新途径

参考文献：

[1]. 单抗夹心ELISA检测鸡新城疫病毒抗原的研究[D]. 薛松果. 安徽农业大学. 2004

[2]. 单克隆抗体夹心ELISA试验检测鸡新城疫病毒抗原的研究[J]. 于圣青, 刘秀梵. 江苏农学院学报. 1990

[3]. 用单抗夹心ELISA快速检测鸡新城疫病毒[J]. 蒋凤英, 胡建华, 王英, 顾彩菊, 李春华. 上海农业学报. 2004

[4]. 快速检测鸡新城疫病毒的聚乙二醇单抗夹心ELISA试验的建立和应用[J]. 卢建红, 张如宽, 焦新安, 刘秀楚. 中国兽医科技. 1994

[5]. 新城疫病毒单克隆抗体研究Ⅲ酶标单克隆抗体ELISA夹心法检测鸡新城疫病毒抗原[J]. 高云英, 张永才, 张碧侠, 张孝君. 西北农业学报. 1997

标签：生物学论文;  畜牧与动物医学论文;  新城疫论文;  elisa论文;  抗原抗体反应论文;  抗原抗体论文;  igg抗体论文;