（成都市食品药品检验研究院 四川 成都 610045）
【摘要】 目的：建立润肤霜的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2015年版，采用常规法对需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数、以及控制菌的检查进行方法学验证。结果：润肤霜的抑菌性较小，可采用常规法进行需氧菌总数计数、霉菌及酵母菌总数计数和控制菌的检查。结论：建立的方法准确可靠，可用于润肤霜的微生物限度检查。
【关键词】 润肤霜；微生物限度检查；方法验证
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）18-0031-02
Validation of microbial limit test method of Cream
【Abstract】 Objective To establish the method to determine the microbial limit tests for cream. Methods According to the China Pharmacopoeia 2015 edition, the routine method was performed for microbial limit test validation of cream. Results Cream hardly had the antimicrobial activity, the routine method was feasible for microbial limit test. Conclusion The method is accurate and can be used for the microbial limit test of cream.
【Key words】 Cream; Microbial limit test; Validation of method
润肤霜（人参霜）是以人参皂苷为主要成分，辅以混合醇、单硬脂酸干油酯、液体石蜡、甘油、乳化剂、香精和防腐剂的局部给药制剂，可益气活血，促进皮肤代谢，用于治疗面部红斑、丘疹、干燥、脱屑等皮肤炎症。按照《中国药典》2015年版四部非无菌药品微生物限度标准规定，确定其标准为需氧菌总数每1g不得过102cfu，霉菌和酵母菌总数每1g不得过101cfu，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌每1g不得检出[1]。鉴于本品加入了防腐剂，对微生物的生长可能有一定的抑制作用，故本品在进行微生物限度检查时，应建立适合于本品的方法，消除样品的抑菌活性，建立可靠有效的方法[2,3,4]。
1.材料
1.1 仪器
超净工作台（苏净安泰）SW-CJ-2FD；生化培养箱（上海一恒科技）LRH-250；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技）GHP-7290。
1.2 菌种
白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)631001]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]，均来源于中国药品生物制品检定所，均为第4代培养物。
1.3 培养基
胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、甘露醇氯化钠琼脂、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基和沙氏葡萄糖液体培养基（SDB），均由北京三药科技开发公司生产。
1.4 样品
润肤霜（某医院生产）
2.方法与结果
2.1 平皿法验证需氧菌总数计数
2.1.1菌液制备 按照中国药典2015年版制备枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌及黑曲霉的菌悬液。
2.1.2供试液制备 取本品10g，加含5%Tween-80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，45℃水浴后用匀浆仪混匀，得1:10供试液。
2.1.3回收率测定
供试品对照组：
取1:10供试液50mL，取1 mL分别注入2个平皿，共制备两组，测定供试品本底需氧菌以及霉菌和酵母菌总数；
菌液对照组：
分别取上述5种试验菌悬液0.5mL，加至50mL pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，取1mL注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注TSA培养基，测定所加的试验菌数。
试验组：
分别取上述5种菌悬液0.5 mL，加至50ml的1:10供试液中，混匀，取1mL注入平皿，每株菌制备2个平皿，倾注TSA培养基。
分别取上述2种真菌悬液0.5mL，加至50ml的1:10供试液中，混匀，取1mL注入平皿，每株菌制备2个平皿，倾注SDA培养基。
如表1所示。
2.1.4结果 从表1可以看出，取本品1:10供试液按平皿法进行计数时，TSA培养基中五种试验菌的回收率均在50%和200%之间，SDA培养基中两种真菌的回收率也在50%和200%之间。
2.2 控制菌检查方法的验证
2.2.1金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查
试验组：
取1:10供试液10ml及金黄色葡萄球菌悬液1ml加入到100ml的TSB中，35℃培养24小时。划线接种于甘露醇氯化钠平板上，培养后观察是否有菌生长。
取1:10供试液10ml及铜绿假单胞菌悬液1ml加入到100ml的TSB中，35℃培养24小时。划线接种于溴化十六烷基三甲铵平板上，培养后观察是否有菌生长。
阳性对照组：
取制备好的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌悬液1ml加入到100ml的TSB中，后续操作同上。
阴性对照组：
取10ml pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液加入到100ml的TSB中，后续操作同上。
供试品对照组：
取1:10供试液10ml加入到100ml的TSB中，后续操作同上。
2.3.2结果 由表2和3可知，阴性对照组和供试品对照组均未检出控制菌，阳性对照组和试验组均检出相应的控制菌，因此，本品金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查可用常规法（TSB：100mL）。
3.讨论
本品在制备供试液的时溶解性较差，加入5%的吐温-80再水浴后，样品能较好溶解在其中，但本品为较粘稠的霜类，故需进一步用匀浆仪混匀，这样才能获得均质的供试液[5,6]。另外，本品的供试液有一定的粘附性，在用移液管或移液枪吸打供试液时，应缓慢操作，等待一段时间尽量使挂壁的供试液缓慢流下，以保证取样的准确性。
本品对细菌及真菌的抑制作用较小，微生物计数及控制菌检查均可采用常规法。根据验证结果将微生物限度检查方法记录如下：取本品10g，加含5%Tween-80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，45℃水浴后用匀浆仪混匀，得1:10供试液。需氧菌总数以及霉菌和酵母菌总数计数可取1:10供试液按平皿法进行，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检查均可采用常规法（TSB：100mL）。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国人民共和国药典[s].北京：中国医药科技出版社，2015四部：140.
[2]杨晓莉，李辉，马英英等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法解读[J].药物分析杂志，2016，36（6）:1101-1107.
[3]杨晓莉，李辉，马英英，等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法解读与对策[J].中国药师，2016，19（4）:748-752.
[4]程龙，熊雯，陈霞.过敏康胶囊微生物限度检查的方法建立[J].中药与临床，2017，8（3）:38-41.
[5]胡泽锴，毛腾霄.抗敏止痒霜微生物限度检查方法研究[J].海峡药学，2016，28（11）:70-72.
[6]陈璐，汪洋，涂碎萍.抗痤霜微生物限度检查方法验证[J].国外医药抗生素分册，2016，37（6）:266-269.
论文作者:程龙,陈霞,熊雯
论文发表刊物:《医药前沿》2018年6月第18期
论文发表时间:2018/7/5
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