冯新港[1]2001年在《用表达文库免疫和EST策略筛选日本血吸虫保护性抗原基因的研究》文中研究表明血吸虫病(Schistosomiasis)是一种人兽共患病，它仍然是发展中国家亟待解决的主要的公共卫生问题之一；对疫区社会和经济的进步发展是一个威胁。化疗仍然是控制干预该病的重要措施，但它无法解决重复感染的难题，并可能引起药物抗性的产生。因此，有效的抗血吸虫病疫苗的应用，就成为控制该病流行的长期措施。但用常规基因工程技术获得的抗原的保护性效果都不甚理想，所以能否筛选到保护性效果更好的抗原成为血吸虫疫苗开发中的瓶颈。故从策略和技术上突破常规方法的限制，有望使血吸虫疫苗的研发取得更大的进展。本研究目的：①通过构建日本血吸虫部分cDNA表达质粒文库，在小鼠模型中评价该表达质粒文库导入机体后抗攻击感染的保护性效果，探索表达文库免疫策略应用于筛选血吸虫抗原分子的可行性，为保护性抗原基因的筛选提供一条快速有效的新途径。②测定日本血吸虫cDNA文库中一定数量的EST序列，应用生物信息学的工具，对其进行初步的模体、结构域等分析，为进一步进行大规模的日本血吸虫EST序列测定、分析预测可能的保护性抗原分子集合等奠定基础。研究方法：用PCR从原初日本血吸虫噬菌体文库中钓取部分目的片段后，构建成真核表达质粒文库，将其细分成子文库，经肌注途径直接免疫小鼠，再进行抗攻击感染的保护性效果试验，并对文库中少量的转化子进行插入片段的测序鉴定和分析。同时构建测序质粒文库，用Sanger氏方法，测定一定数量的日本血吸虫成虫EST序列，对所测序列用Blast、Genescan等程序进行序列构成、编码区等分析，通过提交序列至蛋白质预测服务器进行模体、结构域等分析。研究结果：构建成了约含10~5个转化子的真核表达质粒文库，部分转化子酶切及序列分析显示插入的序列具有血吸虫编码基因的特征；用总文库和3个子文库免疫后各组小鼠总IgG水平均低下；总文库和2个子文库免疫小鼠组攻击感染后获得了30％左右的减虫率。构建了约含10~4个转化子的测序质粒文库；对其中的32个克隆进行了EST测定，读出了26条序列，获得了有插入片段的日本血吸虫EST序列23条，Blast分析结果有6个单一克隆序列与数据库中已知的血吸虫基因相匹配、8个单一克隆序列与数据库中其他种属的基因片段或推断的基因相匹配、8个克隆代表6个rRNA蛋白基因、1条序列无数据库匹配；Genescan程序分析结果表明插入片段的G+C含量在40％左右，且大多具有编码序列的特征；从EST序列推断的蛋白质的预测分析显示，插入片段中大多包含与机体代谢、转录功能有关的模体和结构域。结论：①应用PCR从原初Sj噬菌体文库中钓取部分目的cDNA片段，所构建的含Sj部分cDNA真核表达质粒文库DNA直接免疫小鼠后，能诱导机体产生抗攻击感染的保护性；文库中既含有已证实的血吸虫抗原基因，也含有未知的血吸虫基因。表明应用cDNA表达文库免疫策略筛选血吸虫保护性抗原基因分子或表位集是可行的。②通过测定一定数量的日本血吸虫成虫EST序列及有关的生物信息学分析，发现文库中主要包含结构性的rRNA基因以及与机体代谢、转录功能有关的模体和结构域，也有与已知数据库无匹配的新基因。为进一步进行大规模的日本血吸虫EST序列测定、分析预测可能的保护性抗原分子集合等奠定了技术基础。
吉色曲伍[2]2011年在《疥螨原肌球蛋白基因的克隆、表达与蛋白定位研究》文中指出疥螨病是一种常见的人兽共患寄生虫病,具有高度传染性,能导致人和动物剧痒及各种类型的皮炎,是一种顽固性、接触性、传染性皮肤病。长期药物治疗疥螨病存在药物残留、环境污染等问题。目前尚无可用于免疫防治的疥螨疫苗。尽管寄生虫疫苗的研制较为困难,但相信随着分子生物学的不断发展,疥螨基因文库的不断完善,疥螨基因工程疫苗将会成为防治疥螨病最有前景的方法之一本研究参考GenBank中收录的粉尘螨(D17682)、屋尘螨(AF016278)和痒螨(AM114276)原肌球蛋白(Tropomyosin)基因序列设计引物,对提取的疥螨总RNA进行RT-PCR扩增与克隆,测序结果得到了855bp的目的基因片段。通过对该基因核苷酸序列进行分析,与已报道的粉尘螨、屋尘螨和痒螨原肌球蛋白(Tm)基因的序列同源性分别为87.60%,85.26%和85.03%。预测其表达的重组蛋白大小约为50.90kDa,理论等电点值为pI=4.43,具有很强的亲水性。推导的化学式为C[39] H2318N412O4878S10,带负电荷。该蛋白不存在信号肽切割位点,也不存在跨膜结构域,是一种膜外蛋白。将目的片段插入pET32a(+)表达载体上,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用浓度为1.0mM/L的IPTG诱导表达了疥螨原肌球蛋白,通过SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约50kDa处有明显的表达条带。进一步优化诱导表达条件,结果表明该重组蛋白在37℃温度下,IPTG浓度为0.4mol/L,诱导4h时基本达到最大表达量。用兔疥螨阳性血清作为一抗进行免疫印迹反应,发现重组表达蛋白可与兔疥螨阳性血清反应,产生蛋白免疫印迹带,说明表达的重组蛋白具有抗原性。将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备乳剂苗,用其免疫家兔,获得高免血清,并通过免疫组织化学SP技术,对疥螨原肌球蛋白进行组织定位,试验结果表明该蛋白主要在疥螨口器和四肢的肌肉,躯体表皮以及内脏器官表膜中表达。
朱传刚[3]2006年在《日本血吸虫疫苗的研究》文中研究指明血吸虫病是一种严重危害人类健康的寄生虫病，我国现行的防治策略不能有效地控制该病的流行，迫切需要研究并提出新的防治技术。为此，血吸虫病疫苗研究备受关注。围绕这一主题，本博士后工作主要集中在从技术策略上探索提高血吸虫疫苗免疫保护力的可能途径，如构建粘膜免疫用疫苗；构建血吸虫抗原表位和乙型肝炎核心抗原融合的家蚕表达转移载体；开展多价疫苗研究等。同时，开展日本血吸虫基因表达谱的研究，为寻找新的具有免疫保护作用的疫苗候选分子提供基础。具体研究工作如下。1．Sj．28GST抗原表位与CTB融合基因构建、表达及其免疫效果研究霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit，CTB)是良好的免疫佐剂和载体蛋白，本实验首先构建了可表达CTB的原核表达质粒，并同Sj．28GST抗原表位融合表达，检测该种粘膜疫苗的免疫保护效果。为了在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚单位，将ctb基因片段转入Novagen公司的原核表达质粒pET-30a(+)，并在3’端融合表达六个His，构建重组表达质粒pET-CTB。将表达质粒pET-CTB转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白以包涵体形式表达，分子量大小约为14KD。重组蛋白变性后利用His柱进行纯化。Western印记检测重组蛋白能够被抗CT抗体所识别，具有较好的抗原性。ELISA实验显示重组蛋白能与神经节苷脂结合，表明其具有CTB的生物学活性。为了构建含有编码CTB和日本血吸虫Sj．28kdGST抗原表位核苷酸序列的原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达，分析Sj．28GST的表位分布，合成了Sj．28GST的4个抗原表位簇，再将它们同CTB亚单位基因融合，得到了编码四个Sj．28GST抗原表位及CTB的重组基因。转化大肠杆菌BL21(DE3)表达，对重组蛋白进行western分析，表明重组菌株表达了CTB和SJ．28GST表位蛋白，表达产物以包涵体形式存在。将实验鼠分为10组，每组10只，包括rSJ．28GST、rCTB和rSj．28GST+rCTB、rCTB-Sj．28GST灌胃免疫组，以及rSj．28GST、rCTB、rCTB-Sj．28GST和rSj．28GST+rCTB皮下免疫组，PBS灌胃及皮下对照组。在第4次免疫后1周，经腹部感染日本血吸虫尾蚴40±1条，45d后解剖观察减虫率和减卵率。结果，rCTB-Sj．28GST灌胃及皮下免疫组减虫率分别为28.6％及17.7％，每克肝减卵率分别为46.3％及21.3％。用表达产物经口服免疫小鼠后，所产生的对日本血吸虫的免疫保护力明显高于用单独的重组Sj．28GST免疫的小鼠所产生的免疫力，所表达的融合蛋白中CTB可能起到了免疫佐剂的作用，增强了SJ．28GST的免疫原性。2．日本血吸虫抱雌沟蛋白编码基因的克隆与诱导表达条件的研究日本血吸虫抱雌沟蛋白编码基因(Gynecophoral canal protein，GCP)是雄虫差异表达，同血吸虫雌雄虫合抱、雌虫发育、成熟、产卵相关的基因。本文于该序列开放阅读框两端设计引物并分别引入XholⅠ和HindⅢ两个酶切位点，以原有的SjGCP／pGME-T为模板，用PCR法扩增出目的基因片段。再用双酶切法克隆入表达载体pGEX-6p-1。比较不同浓度IPTG诱导剂、不同诱导表达温度和诱导表达时间等对融合蛋白表达的影响。结果：用PCR法扩增出目的基因片段约1950bp，开放阅读框长1932 bp，编码643个氨差酸，理论分子量为62KDa。DNA序列分析显示，与已报道Sj．GCP序列相同。重组质粒SjGCP／pGEX-6p-1高效表达融合蛋白，但在0.01mmol／L-2.0 mmol／L的IPTG浓度、15℃-37℃诱导表达温度和0.5-16小时诱导表达时间范围内，rSjGCP／pGEX都以不溶性包涵体形式表达。遂采用分离、洗涤、变性溶解的方法，结合分子筛层析和亲和层析，对重组融合蛋白包涵体进行了纯化。同时，构建了Sj．GCP的核酸疫苗pcMV-Sj．GCP，测序表明，和实验构想一致。3．日本血吸虫多价疫苗的研制和免疫效果评估多价疫苗是否具有协同免疫保护作用，观察叁种重组的日本血吸虫抗原蛋白：28KDa谷胱甘肽S转移酶rSj．28GST(glutathione S transferase，Sj．28GST)、日本血吸虫23KDa膜蛋白大亲水端(23kDa membrane protein large hydrophilic domain，LHD-Sj23)、rSjGCP及叁种核酸疫苗组合(VR1012-Sj．28GST，VR1012-LHD-Sj23，pcMV-rSjGCP)免疫小鼠诱导的抗血吸虫的保护性免疫效果，探索日本血吸虫重组抗原rSj．28GST的优选免疫次数。将小鼠分为13组，每组10只，分别用不同的疫苗免疫，重组蛋白以佐剂206作为佐剂。同时设PBS和佐剂206对照组。最后一次免疫后，每鼠攻击40±1条日本血吸虫尾蚴，42天剖杀。结果，各免疫组回收虫体数均有下降，从6％到39％不等，肝脏虫卵计数显示，各免疫组虫卵数也均有所下降，减卵率从24.0％-47％不等，其中以DNA混合疫苗组减虫和减卵幅度最大，分别为减虫率39％(P＜0.05)，减卵率47％(P＜0.05)。叁价疫苗免疫小鼠和二价或单价疫苗一样，都能诱导产生对血吸虫攻击感染的部分免疫保护力，但未见明显提高免疫保护力。用重组的Sj．28GST一次、二次、叁次免疫动物，都可诱导显着的保护效果，叁次免疫获得的保护效果略高于一次、二次免疫组，但差异不显着。4．家蚕表达日本血吸虫保护性抗原表位和乙型肝炎核心抗原融合蛋白的研究。乙肝核心抗原(HBcAg)具有很强的免疫原性，可用来增强自身免疫原性不强的外源抗原决定簇的免疫作用，本文利用PCR技术扩增出人乙肝核心抗原(HBcAg)全基因，构建含HBcAg基因的质粒；通过突变的方法，使得HBcAg的免疫优势区c／el80-81位含有SalI酶切位点，以便融合其他的外源基因。构建含突变的HBcAg基因的家蚕表达转移载体pBacPAK-His-HbcAg；分析Sj．23kd膜蛋白基因、Sj．GCP以及Sj．28GST基因的抗原表位基因，利用PCR技术扩增这些抗原表位核苷酸序列，通过粘末端连接的方法，将它们分别与HBcAg的免疫优势区c／el 80-81位融合，构建家蚕表达转移载体。测序分析，这些抗原表位核苷酸序列同HBcAg基因融合，得到了3个含日本血吸虫抗原表位并融合HBcAg基因的家蚕表达转移载体，为利用HbcAg作为免疫载体蛋白研制抗血吸虫病疫苗提供了基础。5．血吸虫性别发育过程中的基因表达谱分析为获得新的血吸虫疫苗候选分子，对本课题组利用血吸虫雌雄虫cDNA消减文库中的cDNA克隆制备的cDNA芯片进行杂交，研究分析血吸虫雄雌虫发育过程中基因表达谱的变化。芯片质量分析显示，在对数据进行均一化处理后，试验所采用的芯片杂交方法有较好的重复性和一致性。分析结果表明，该芯片3082个克隆中有2474个呈现雌、雄虫差异表达。其中雄虫高表达1102个，雌虫高表达1372个。这些差异表达基因在血吸虫不同发育阶段虫体上也呈现不同表达水平。雌、雄虫高表达的基因分析表明，雄虫高表达的基因在14天到17天就出现变化，雌虫高表达的基因则大都在20天到24天之间发生变化。测序的1117个cDNA片段分属562个不同基因。其中有206个在雄虫中高表达，256个在雌虫中高表达，100个在雌雄虫中mRNA水平相当。芯片聚类分析获得了一些表达时相一致的基因和不同时间高表达的基因。用荧光定量RT-PCR对芯片杂交的可靠性进行验证，显示芯片结果可信、准确。正在对数据进行进一步挖掘，从基因的功能、参与的生物学过程以及细胞组成等方面发现了解发育过程中的现象。为寻找诱导高免疫保护作用的血吸虫候选疫苗抗原以及了解血吸虫发育生物学提供数据和基础。
参考文献：
[1]. 用表达文库免疫和EST策略筛选日本血吸虫保护性抗原基因的研究[D]. 冯新港. 中国农业科学院. 2001
[2]. 疥螨原肌球蛋白基因的克隆、表达与蛋白定位研究[D]. 吉色曲伍. 四川农业大学. 2011
[3]. 日本血吸虫疫苗的研究[D]. 朱传刚. 中国农业科学院. 2006
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