【摘要】目的：用基因芯片方法了解桂林市及周边地区非综合征耳聋患者常见分子学病因。方法：调查桂林市启聪幼儿园和聋哑学校、梧州市特教学校、来宾市特教学校、武宣特教学校学生285人，经监护人知情同意，填写调查表和体检，并抽取285人外周血提取DNA，用基因芯片方法检测常见4个耳聋基因9个突变位点。结果：285例样本中检测出热点突变位点患者比例占11.93%（34/285）,GJB2基因检出率6.32%（18/285），SLC26A4基因检出率4.21%（12/285），线粒体DNA 12S rRNA基因检出率1.40%（4/285）。结论：桂东北地区非综合征耳聋基因与筛查位点有关的最常见的是GJB2基因，其次是SLC26A4基因，第三位是线粒体DNA 12S rRNA基因。
【关键词】耳聋；非综合征耳聋；热点突变；基因芯片
【中图分类号】R764.43 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）35-0352-02
1.对象和方法
1.1 调查对象
桂林市市区两所特教学校（分别是启聪幼儿园和聋哑学校）、梧州市特教学校、来宾市特教学校、武宣特教学校学生共285人，男生168人，女生117人，年龄3～20岁，中位年龄13岁，发病年龄0～1岁。所有受试对象经医务人员常规检查排除综合征耳聋。所有对象均告知家长和孩子检测的意义，签署知情同意书，并由受过统一培训的医务人员填写问卷调查表，包括一般信息、耳聋家族史、母孕期疾病史和用药史、孩子有无头部外伤和疾病用药史、耳聋发展、伴随症状、诊疗情况，同时进行全身体格检查。
1.2 方法
1.2.1仪器和试剂以及检测方法 晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒、SlideWasher 8芯片洗干仪、LuxScan-10K／B扫描仪均来自北京博奥晶典生物技术有限公司。
1.2.2标本采集和DNA提取 抽取外周血3～5毫升，EDTA抗凝，留4℃冰箱保存，按照试剂盒说明书提取DNA，提取的DNA用NanoQ微型分光光度计定量，确保DNA浓度大于100ng/μl，纯度OD260/280=1.7～2.0。提DNA全过程在生物安全柜进行，提取的DNA放-20℃冰箱保存。
1.2.3 PCR扩增 按照试剂盒说明书配制反应体系，反应体系包含扩增引物混合物12.5μl，扩增试剂混合物4.5μl及基因组核酸提取物3μl共20μl。按照PCR扩增程序：37℃10 min，95℃15min，96℃1 min预变性，94℃30S，55℃30s，70℃45S共32个循环进行DNA扩增，60℃10min后完成扩增。在扩增过程中，设置参数使温度以0.4℃／s的速度从94℃降至55℃，并以0.2℃／s的速度从55℃升至70℃，总反应时问约为3 h 20min。
1.2.4杂交 取14μl杂交反应混合物从芯片加样孔垂直加入到芯片的点阵上，加入样本要与上述记录表相对应。密封好杂交盒，水平放入60℃预热好的水浴锅或杂交仪中，待全部放入后，计时，转速5rpm，杂交1h。
1.2.5芯片洗涤 杂交芯片在芯片洗干仪中按照洗涤液1，42℃2 min×1次，洗涤液2，42℃1 min×2次洗涤。
1.2.6芯片扫描 打开扫描仪后，将芯片放置扫描仪芯片卡槽中，开始扫描芯片。
1.2.7结果判读及解释 遗传性耳聋基因检测芯片判别系统自动判读扫描结果，位点检测探针W阳性，判读该位点为野生型(两条等位基因上该位点均未发生突变)，探针M阳性，该位点为纯合突变型(该位点两条等位基因均发生突变)；若探针W和M均阳性，则为杂合突变型(该位点有一条等位基因发生突变)。
2.结果
285例样本中检测出热点突变位点患者比例占11.93%（34/285），其中GJB2基因检出率6.32%（18/285），SLC26A4基因检出率4.21%（12/285），线粒体DNA 12S rRNA基因检出率1.40%（4/285），未检出GJB3基因（见表1）。
表1 34例热突变位点检测结果
3.讨论
遗传性耳聋包括非综合征型耳聋（non-syndromic hearing impairment，NSHI）和综合征型耳聋（syndromic hearing impairment，SHI），其中NSHI占70%，SHI占30%[1]。自2003年开始的全国范围的聋病分子流行病学研究显示GJB2、SLC26A4，线粒体DNA12SrRNA是导致我国大部分遗传性耳聋患者发病的三个最常见的基因[1]。本组研究也符合上述规律，其中最常见的是GJB2基因，但其检出率6.32%低于山西张强伟的报道[2]和河北王洪芹的报道[3]，是否与纳入两位学者研究病例组的都是重度感音神经性耳聋有关。
3.1 GJB2基因分析
非综合性耳聋与多种缝隙连接蛋白(connexin，Cx)突变密切相关，Cx26是一种由GJB2基因编码的缝隙连接蛋白，该基因定位于染色体的13q11-q12，有2个外显子，中国最常见的突变位点是235delC，GJB2基因的编码区235位碱基C纯合性缺失导致遗传密码发生移码突变，致使突变位点以下的遗传密码全部发生改变，进而造成其翻译氨基酸的框架结构自突变位点以下变异，此突变的发生产生了无功能的缝隙连接蛋白从而降低了缝隙连接的通透性影响到通道的正常开闭，致使钾离子流入内淋巴液的循环时产生障碍，导致感音神经性耳聋的发生，与常染色体显性遗传性聋DFNA3和常染色体隐性遗传性聋DFNB1关系密切。
3.2 SLC26A4基因分析
SLC26A4基因突变可导致常染色体隐性耳聋DFNB4和Pendred综合征，患者常常有前庭导水管扩大，发病时间较晚，刚出生时听力筛查往往可以通过，以后发病多与感冒或者头部外伤等诱发因素有关。此类迟发型听力损失没有家族史没有基因检测常常被漏诊，如果早期筛查出来可以通过科学的指导和严格的活动限制来保留较好的残余听力，后期通过听力康复训练和佩戴助听器来获得良好的交流能力。
3.3 线粒体DNA12S rRNA分析
线粒体DNA12S rRNA基因突变与母系遗传有关，可通过母亲传给儿子或者女儿，但只有女儿可将其继续传给下一代。携带该突变的人群有很大风险在常规使用氨基糖甙类抗生素时，氨基糖甙类药物进入耳蜗和前庭后积累，与12S rRNA结合导致细胞损伤、凋亡进而造成听力不可逆下降。本组研究对线粒体DNA12S rRNA两个突变热点1494C>T和1555A>G进行筛查，未检出1494C>T位点，检出1555A>G位点4例，检出率1.40%，4例患者均有耳聋家族史和氨基糖甙类药物应用史。12SrRNA检出率虽然低于刘启珍等报道[4]的，但仍然不能忽视，这类人群要是早期筛查出来，避免使用这类抗生素，也许这个孩子一辈子不会有耳聋发生。
本研究对桂林市北边和东边等部分地区进行非综合征耳聋常见9个突变热点进行筛查，并对筛查结果进行分析，进行科学恰当的干预。例如携带GJB2基因的螺旋神经节细胞正常，适合人工耳蜗植入，且植入后言语理解能力强，预后良好。携带SLC26A4基因的严格限制活动，预防感冒外伤等，通过佩戴助听器来获得良好的交流能力。携带线粒体DNA12S rRNA基因的终身避免使用氨基糖甙类抗生素不一定致聋。因此，耳聋筛查非常有意义，根据突变位点遗传规律，进行遗传学指导和产前诊断可以杜绝下一代耳聋发生。
致谢：本研究得到桂林市残联、桂林市卫计委、桂林市启聪幼儿园、桂林市聋哑学校、梧州市特教学校、来宾市特教学校、武宣特教学校等单位大力支持，在此一并致谢！
【参考文献】
[1]张昊昱，张宁，张华，等.耳聋基因检测在遗传性耳聋诊断及遗传咨询中的应用[J].中华耳科学杂志，2016，14（5）:639-643.
[2]张强伟，张芹娜，杨向茹.山西太原129例重度非综合征型感音神经性耳聋基因的筛查[J].中华耳科学杂志，2012，10（2）:224-226.
[3]王洪芹，赵群，孔祥军，等.沧州市特教学校极重度感音神经性聋患者基因分析[J].中华耳科学杂志，2015，13（2）:326-328.
[4]刘启珍，陈丽鸿，张应龙，等.重庆市永川地区青少年耳聋患者耳聋基因热点突变筛查分析[J].中华耳科学杂志，2013，11（1）：126-130.
论文作者:杨潍嘉,黄开明,梁丽明,阳瑾,刘丽玲,巫玉峰
论文发表刊物:《医药前沿》2017年12月第35期
论文发表时间:2018/1/11
标签：基因论文; 突变论文; 桂林市论文; 特教论文; 检出论文; 线粒体论文; 位点论文; 《医药前沿》2017年12月第35期论文;