屈延[1]2000年在《小鼠Endostatin基因的克隆、表达、纯化及其生物学活性的初步研究》文中提出脑胶质瘤是严重危害人类健康的常见肿瘤，临床上虽采取积极的治疗措施，但疗效欠佳，患者死亡率似较高。由于脑胶质瘤的发生和发展必须依赖大量的血管生成，因此，选择抗胶质瘤血管生成作为治疗靶，从而抑制胶质瘤的生长，已成为目前治疗胶质瘤一个新的途径。Endostatin是近年来发现的一种血管生成抑制因子。它具有强烈抑制血管内皮细胞增殖的作用。可通过与肿瘤血管内皮细胞表面的受体结合，介导其生物学活性，阻遏胶质瘤的血管形成，从而达到抑制肿瘤生长或促使肿瘤细胞凋亡的目的。 在本研究中，我们首先从小鼠肝脏中提取总RNA，根据mEndostatincDNA序列合成5′、3′端引物，经RT-PCR扩增出mEndostatin cDNA片段，以EcoR I和Sal双酶切后，克隆入大肠杆菌克隆载体pUC19载体中，经测序证实与文献报道的完全一致。再将编码mEndostatin的基因克隆到大肠杆菌非融合表达载体pDH上，使其受控于PRPL启动子，构建成表达质粒pDH-Endo，以大肠杆菌DH5α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达，经42℃ 5h诱导，工程菌在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带，分子量与预期的一致约为20ku，表达量占菌体总蛋白的12％，以包涵体形式存在。诱导后的工程菌经裂菌后，所得包涵体先用2％的DOC洗涤2次，再用2M尿第四军医大学硕士学位论文素洗涤1次，将洗涤纯化的包涵体溶解于含7M尿素的缓冲液中，dndostatin纯度可达80％。再经过离子交换层析进一步纯化，最终纯度达到95％以上。采用透析或稀释复性法对纯化的InEndostatin进行复性处理，并用铜离子催化自由琉基氧化形成二硫键，得到的复性产物在体外可抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管的形成。 抑制胶质瘤血管的生长，是目前治疗胶质瘤的一个方向。本研究克隆并表达了对血管生成有强烈抑制作用的End。Statin，为利用End。Statin进行脑胶质瘤基因治疗奠定了实验基础。
宗英[2]2007年在《人KininogenD5和TRAIL融合蛋白的克隆表达和生物学活性研究》文中研究说明20世纪70年代初,Folkman首先提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的论点[1]。到目前为止,已经证实了肿瘤的生长和转移必须有新生血管提供氧气和养料,而血管新生是在原有的毛细血管或微静脉基础上,通过内皮细胞的增殖和迁移,从先前存在的血管处以芽生或非芽生的形式生成新的毛细血管,是胚胎发育时期和女性月经周期子宫内膜周期性剥脱修复时血管形成的主要方式,同时也是病理状态下比如损伤后修复主要方式。血管新生主要受两方面因素的调控,一是促血管形成因子的增加,二是抑制血管形成因子的减少。在生理状态下血管生成促进因子和抑制因子之间达到一个平衡,但是在肿瘤的增大和转移的过程中,血管新生促进因子占据了优势[2],因此,如果抑制新生血管的形成,肿瘤细胞将发生凋亡或坏死,这就为抗肿瘤的治疗开辟了新的思路[3]。目前,有多种抑制血管新生的药物用于抗肿瘤治疗的研究,单链的高分子量激肽原(HK)是一个分子量约为120kDa的球蛋白,在血浆中的浓度约为90μg/ml,从结构上来说,HK由六个结构域组成,其中1-3构成它的重链,5-6构成它的轻链,重链和轻链之间由包含有一个九肽的缓激肽的第四结构域相连。在血浆的激肽释放酶的作用下,释放出一个九肽的缓激肽以后就形成了一个由约62 kDa的重链和约56 KDa的轻链形成的双链分子,重链和轻链之间由位于第10位和596位之间的单一的二硫键连接。激肽释放酶进一步在该双链的第419位精氨酸和420位的赖氨酸之间酶切,使短链缩短为约46 KDa大小,这样形成的双链高分子量激肽原被称为活化的高分子量的激肽原(HKa)[4,10]。HK和HKa在结构上都有第五结构域的富含组氨酸区域,第五结构域通过该区域与Zn2+结合,通过电镜的观察发现随着HK活化成为HKa后,它的构象发生了明显的改变,其最主要的特征就是它的第五结构域暴露,而第五结构域的暴露使HKa获得一个新的生物学活性,从而使它可以和活化的血管内皮细胞表面的尿激酶纤溶酶原激活受体(uPAR)特异的结合[9],从而使活化的内皮细胞去黏附而诱导内皮细胞的凋亡来抑制血管的新生[5,6,7]。目前,对于HKa诱导内皮细胞凋亡,抑制血管新生的作用机制已经得到了比较明确的研究[11],对于其有功能的活性片段也已经进行了鉴定[12],但是对于单纯的用HKa来进行抗肿瘤的治疗仍存在不少的问题,动物实验显示,单纯用HKa来进行治疗会发现药物的剂量较大,而且起效所需时间长,因此,本课题通过将HK的活性片段D5[8]和具有强大的抗肿瘤活性、毒副作用小的肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体TRAIL[13]的活性片段进行融合,得到具有双功能作用的融合蛋白,特异性的杀伤肿瘤细胞和肿瘤新生血管的内皮细胞。本课题运用基因工程技术,分别获得KininogenD560-148和TRAIL114-281片段,分别鉴定其活性后,通过重组PCR技术,用氨基酸连接臂将两个活性片段双向重组连接,获得了KininogenD560-148-TRAIL114-281(KT)和TRAIL114-281-KininogenD560-148(TK),将得到的重组蛋白进行活性鉴定,发现KT具有较强的抗肿瘤细胞和杀伤新生血管内皮的作用,而TK活性很小,在此基础上还初步探讨了KT诱导细胞凋亡的机制以及KT的抗瘤谱。一、KininogenD560-148和TRAIL114-281的克隆、表达与活性鉴定我们采用PCR技术分别获得KininogenD560-148和TRAIL114-281基因片段,分别构建pMAL-KininogenD560-148(PKD5)和pMAL-TRAIL114-281(PT)的重组质粒,将重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达及2.5 L发酵罐扩大培养,亲和层析,过滤,-80℃保存备用。大肠杆菌表达的融合蛋白MBP/KD5和MBP/T在E.coli BL21中的菌体总蛋白含量分别为25%和23%,诱导后得到了有效的表达,超声破菌后,融合蛋白最主要在上清表达,经Amylose Resin亲和柱纯化后,获得了纯化的MBP/KD5和MBP/T融合蛋白,纯化后纯度分别达95%和93%(Syngene扫描分析),经Werstern Blot鉴定在52 kDa和62 kDa处得到相应的融合蛋白表达条带。用上述纯化的PKD5和PT分别在ECV304和人胰腺导管上皮细胞SW1990上进行活性鉴定,在geltalin和fibranectin包被以及在VEGF存在的情况下, PKD5对内皮细胞有明显的抑制作用,如果没有Zn2+存在的情况下,ED50为10μg/ml,当Zn2+浓度为10nmol/L时,ED50为50ng/ml;PT对SW1990有明显的杀伤作用,ED50为25 ng/ml。PT对于肿瘤细胞有明显的诱导凋亡的作用,是很好的抗肿瘤药物;通过管状结构形成实验,PKD5可以明显的抑制体外管状结构的形成,因此具有潜在的抗肿瘤活性。二、利用重叠PCR技术将KininogenD560-148和TRAIL114-281双向融合表达第一部分的研究结果表明了KD5和TRAIL的活性片段都具有生物学活性,因此,我们将两者的活性片段进行融合得到一种新型的融合蛋白。这种新型融合蛋白的靶向能力是利用配体KininogenD560-148和活化的血管内皮细胞上高表达的受体uPAR之间高度特异相互作用的特性和TRAIL114-281和肿瘤细胞表面的死亡受体特异性结合的特性。因此,KininogenD560-148和TRAIL114-281融合蛋白具有靶向杀伤肿瘤细胞的能力,我们利用原核表达系统制备该融合蛋白。首先,我们利用重组PCR技术,合成KininogenD560-148和TRAIL114-281的双向融合基因KT和TK,Kininogen和TRAIL之间通过氨基酸连接臂相连,将融合基因分别克隆到pMAL-c2载体中,获得重组表达质粒pMAL-KT和pMAL-TK,转化E.coli BL21(DE3)。SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,人pMAL-KT和pMAL-TK融合基因获得了有效表达,表达量约占菌体总蛋白质的25%左右,主要以可溶的形式表达,经Amylose Resin亲和柱纯化后,得到了纯度在95%以上的纯化蛋白MBP/KT和MBP/TK,利用纯化蛋白对内皮细胞ECV304和人胰腺胆管上皮细胞癌细胞SW1990的细胞毒实验,结果表明MBP/KT具有良好的双功能活性,对ECV304细胞的IC50为30 ng/ml,对于SW1990细胞的ED50为5 ng/ml,而MBP/TK对于ECV304细胞和SW1990几乎没有作用。我们进一步通过流式细胞检测,电镜检测,以及DNAladder检测,证实了MBP/KT可以明显的诱导SW1990细胞的凋亡。因此,我们进一步将KT亚克隆到表达载体pBV 220中进行表达,在热诱导下,pBV220/KT最主要以包含体的形式表达,通过改进发酵条件,最终得到了上清的少量表达。这些研究结果为肿瘤治疗开创了新的思路。
柯细松[3]2002年在《人内皮抑素（hES）的亚克隆、表达、抗体制备及其生物学活性的初步研究》文中研究表明恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。肿瘤的生长、转移依赖于血管生成。通过抑制肿瘤相关的血管生成可以抑制肿瘤的生长。1997年，Folkman和O'Reilly发现了一种内源性的血管及肿瘤生长抑制剂--内皮抑素(endostatin)，endostatin是胶原XVIII的C-端184个氨基酸片段，其中酸性氨基酸16个，碱性氨基酸29个，半胱氨酸4个，疏水氨基酸占42%， pI为9.3。它是天然而有效的血管生成抑制剂，是专一的内皮细胞增殖抑制物，能抑制来源于不同组织的肿瘤形成和迁移而不引起抗药性。本课题运用基因工程技术，将从人胎肝组织克隆的内皮抑素（human endostatin, hES）基因进行原核表达、纯化，检测重组hES的抑制内皮细胞增殖及抗血管生成的生物学活性，并制备高效价的特异的抗hES多克隆抗体（pAb）。我们采用亚克隆技术从重组克隆载体pT-hES获得hES基因，构建融合表达载体pGEX-hES，重组质粒导入大肠杆菌E .coli BL21，IPTG诱导表达；用初步纯化的hES包涵体蛋白免疫新西兰大白兔，制备抗<WP=7>hES多克隆抗体（兔抗人），Western-blotting检测其在小鼠肝、肾等组织的表达，鉴定抗体对体内endostatin的特异性；通过浓度梯度及pH梯度透析对GST-hES包涵体蛋白进行蛋白质复性，用Glutahione Sepharose 4B 亲和纯化融合蛋白, 凝血酶酶切得到hES，用内皮细胞（ECV304）增殖抑制实验及鸡胚绒毛膜尿囊膜（CAM）实验分别检测hES在体内及体外的抗血管生成活性。大肠杆菌表达的融合蛋白GST-hES为不溶性的包涵体。融合蛋白GST-hES在E .coli BL21中的菌体总蛋白含量为48.5%，蛋白质复性后得到可溶性的融合蛋白，经纯化后纯度达90.5%（ 薄层扫描分析）。用凝血酶酶切融合蛋白后，得到分子量约为20kDa的hES。生物学活性试验表明hES可显著抑制体外培养的的内皮细胞增殖（P<0.05），浓度大于100μg/ml时明显使细胞数减少；3μg的hES可使由VEGF刺激的鸡胚CAM新生血管化率下降30%，表明重组hES具有抑制内皮细胞增殖及新血管生成的活性。制备的抗hES多克隆抗体检测出endostatin在小鼠肝、肾等组织的表达差异，表明其对体内 endostatin具有特异识别与结合的能力。我们研究结果表明hES对内皮细胞增殖及新血管生成具有明显抑制作用，提示其在肿瘤及新生血管性疾病的治疗中有潜在的应用前景。hES的成功表达及抗hES抗体制备为抗血管生成治疗实体瘤的研究及相关疾病的检测奠定了实验基础。<WP=8>
郭文忠[4]2000年在《食管癌血管形成及抗血管治疗的实验研究》文中提出食管癌是我国常见的一种恶性肿瘤，尽管其早期诊断、手术治疗及放化疗取得了较大进展，但其长期疗效仍不满意，复发和转移率较高，因此迫切需要研究新的治疗策略，以改善患者的长期生存率。大量的研究证实实体肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤的血管形成，抗血管治疗为肿瘤的治疗提供了一种新手段。本课题首先研究了血管形成及其主要调节因子在食管癌中的作用，在此基础上探讨了食管癌抗血管治疗的策略和作用。 食管癌中血管形成主要调节因子的研究： 利用RT-PCR或免疫组化的方法研究了56例食管癌组织中血管形成主要调节因子VEGF、MMP-9、Endostatin的表达与食管癌中血管形成及临床的关系。结果显示在食管癌中VEGF的表达显著高于癌旁组织，VEGF的表达与肿瘤内血管形成密切相关，VEGF表达及肿瘤中血管密度计数与食管癌的进展和淋巴结转移也密切相关，表明VEGF在食管癌血管形成和转移中起重要作用，VEGF可以作为抗血管治疗的靶点，用于食管癌的治疗。 在食管癌中MMP-9的表达显著高于癌旁组织，但MMP-9的表达与食管癌中的血管密度计数没有相关性，MMP-9表达与食管癌的临床病理指标之间也没有相关性。本研究还表明在食管癌中缺乏血管形成抑制因子Endostatin的表达。 用ELISA的方法测定了低氧对食管癌细胞系中血管形成调节因子表达的影响，发现低氧可以显著增加食管癌细胞系中VEGF的表达，表明低氧可能通过调节VEGF的表达在食管癌血管形成过程中起重要作用。同时还发现低氧对食管癌细胞系中MMP-9的表达影响不显著。 血管形成抑制因子Endostatin的克隆及治疗食管癌的实验研究： 应用RT-PCR方法从胎儿肝脏组织中克隆了血管形成抑制
赵阳[5]2005年在《血管生成抑制剂Vasostatin蛋白的制备和抗肿瘤研究》文中研究指明抗血管生成治疗是肿瘤综合治疗方案中的重要组成部分。Vasostatin是Sandra E.pike于1998年发现的Calreticulin蛋白N端1-180个氨基酸结构片段,在人肝脏和胰腺等组织广泛分布,可抑制内皮细胞的增殖、血管生成和肿瘤生长,但Vasostatin这一抗血管生成的作用机制仍不清楚。以本室已构建和鉴定的Vasostatin菌株和包涵体为研究材料,通过亲和层析纯化方案制备纯度大于95%样品,对纯化蛋白进行质量评价,包括分子量、纯度、等电点等理化指标符合本研究要求。细胞学水平:通过Vasostatin抑制血管细胞迁移和生长抑制的比较研究,建立人脐静脉内皮细胞(HHEC)迁移抑制和人皮肤微血管内皮细胞系(HM2)增殖抑制试验方法,证实Vasostatin具有抑制血管内皮细胞迁移和增殖的生物学活性。动物水平: H22鼠源肝癌小白鼠移植瘤生长抑制试验证实Vasostatin蛋白在160μg/只·天(相当与8mg/kg·day)剂量下抑瘤率为61.7%;病理学检测肿瘤内外血管密度远低于阴性对照组肿瘤内外血管密度,未见其他脏器的毒性相关的病理组织学变化,说明Vasostatin蛋白能够抑制血管生成从而抑制肿瘤的生长;SMMC7721人源肝癌裸鼠移植瘤生长抑制试验,Vasostatin蛋白在1.5mg/只·天(相当于75mg/kg·day)剂量下抑瘤率为46.2%,与阴性对照组有显著性差别。动物实验证实Vasostatin蛋白明显的抑制肿瘤血管生成进而抑制肿瘤生长的情况下,通过第3代酵母双杂交方法进一步研究作用机制。通过对人内皮细胞cDNA文库的筛选,共得到3个阳性克隆,分别为层粘连蛋白α5和整合素alphaV的片段,分属整合素与层粘连蛋白家族,与细胞迁移等密切相关[6-7],提示与Vasostatin的作用机制有关。Vasostatin与整合素和层粘连蛋白结合,影响了VEGF和bFGF的信号通路,从而影响肿瘤内血管的生成,抑制肿瘤生长。在此基础上,通过结合力验证层粘连蛋白能够与Vasostatin蛋白有极强结合,明显高于对照蛋白,证实酵母双杂交实验结果。Vasostatin蛋白抗肿瘤血管生成作用的机制和靶点研究,为Vasostatin蛋白进一步研究奠定基础。
夏虎[6]2002年在《人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795生长和转移抑制的初步研究》文中研究指明血管内皮抑素(endostatin，ES)是由0’Reilly等于1997年从小鼠血管内皮瘤细胞株(EOMA)的培养基中纯化获得的分子量为20KD的一种蛋白质。经证实其为胶原18C末端的一个内源性片段，并能特异性抑制新生血管内皮细胞增殖，从而达到抑制新生血管生成的目的。进一步的动物实验证明内皮抑素(ES)具有显著抑制原发实体肿瘤的生长和转移的作用，是一种强效的血管内皮生长抑制剂，重复使用未发现其有耐药性及毒副作用产生。重组表达的人内皮抑素分子量约为18.5KD，等电点为9.3，与鼠源性的内皮抑素氨基酸序列有86％的完全一致。本文重点研究将人内皮抑素(hES)基因整合入真核表达系统毕赤巴斯德(pichia．pastoris．GS115)酵母基因组，使其表达重组人内皮抑素(rhES)，并观察其对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用。 一 人血管内皮抑素(hES)在毕赤巴斯德酵母GS115(pichia.pastoris.GS115)中的表达、纯化及其体外细胞生物学活性检测 酵母分泌型表达重组质粒pPIC9／hES由本实验室自行构建。分别用SaLⅠ，SacⅠ和BgLⅡ三种限制性内切酶使重组质粒pPIC9／hES线性化，并用氯化锂转化法将目的基因整合到宿主菌GS115的染色体中。鉴定转化子表型(His~+Mut~s和His~+Mut~+)，经甲醇诱导各转化子分泌表达重组人内皮抑素(rhES)，用SDS-PAGE及Western-blot鉴定，筛选出高效表达株。选择一株高表达株进行诱导表达，表达上清超滤浓缩及70％硫酸铵沉淀后经Hitrap.heparin.HP进行肝素亲和层析纯化目的蛋白。采用MTT比色法观察重组人内皮抑素(rhES)是否抑制bFGF刺激的人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖。 实验结果显示通过基因重组技术获得了可分泌表达重组人内皮抑素(rhES)的高效表达转化菌株；各转化子分泌分子量约为18.5KD，并具有人内皮抑素抗原活性的蛋白条带；进一步在体外证实了重组人内皮抑素(rhES)能明显抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖。 二 小鼠肺腺癌LA795动物模型的建立及观察重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制 将LA795小鼠肺腺癌细胞接种于30只T739小鼠背部近右前肢处皮下(4×10~5cells／mouse)，随机分成两组：rhES治疗组和PBS对照组，各组15只接种小鼠。选择一株高效表达重组菌，经甲醇诱导进行大量表达，用Heparin.sepharose.CL-6B亲和层析纯化目的蛋白，将获得的蛋白用于rhES治疗组。小鼠在接种后第6天开始接受治疗(分别给予rhES20mg／kg／d，等量PBSO．3ml／kg／d，IB月瘤边缘3cm处皮下注射，共14天）。观察各组小鼠肿瘤生长情况，肝、脾、肺肿瘤转移情况及各组小鼠生存期，并对各组数据进行统计学处理。 成功制备LA795小鼠肺腺癌动物模型并随机分为两组。经大量诱导表达获得足量的重组人内皮抑素（rhES），并用于治疗。动物实验结果表明：rhES治疗组肿瘤生长缓慢，治疗前后肿瘤平均体积分别为m．509士5．120E－02Cd），（2．073士0．202C旷）；而PBS处理组肿瘤体积生长迅速，治疗前后肿瘤平均体积分另为（0．491士 8．174E一02cm’），（6．761土0．208cm‘）。治疗结束时两组小鼠肿瘤大小比较具有显著差异（p＜0．001）。病理切片观察发现rhES治疗组可见广泛散在组织坏死，肿瘤细胞凋亡、萎缩，肺、肝、脾未见明显肿瘤转移灶；而PBS对照组肿瘤细胞生长良好，肺部可见散在肿瘤转移灶，肝及脾脏亦未见肿瘤转移灶。两组小鼠生存期分别为门 士3天）、（28士2天），统计学分析两组比较具有显著性差异（P＜0．of）。 本文成功地利用毕赤酵母一ichia。Pastorls．GSlls）表达系统表达了重组人内皮抑素什hES人并证实其具有良好的生物学活性，有效地抑制了！人795小鼠肺腺癌的生长和转移，同时延长了小鼠的生存时间。
章翔, 吴景文, 屈延, 费舟, 高大宽[7]2000年在《小鼠endostatin基因的克隆与C6鼠脑胶质瘤的治疗》文中研究表明目的 克隆小鼠 endostatin基因 ,检测其表达蛋白的生物学活性 ,应用该蛋白治疗大鼠 C6脑胶质瘤 .方法 从小鼠胶原 c DNA用 PCR法克隆 endostatin基因 ,重组入p U C19,测序后构建非融合表达载体 p DH- endostatin,使其在DH5α内经温度诱导表达 ,纯化该表达蛋白并用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和内皮细胞抑制实验检测其活性 .经荷瘤大鼠皮下注射该蛋白治疗其脑胶质瘤 .结果 成功获得 5 5 1bp的endostatin基因 ,经测序正确 .该诱导表达蛋白 Mr2 0 0 0 0 ,具有抗血管生成活性 .应用该蛋白 10或 2 0 mg· kg- 1· d- 1可抑制荷瘤大鼠脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 .结论 Endostatin基因的表达和初步应用 ,为采用抗血管生成方法治疗脑胶质细胞瘤的研究奠定了实验理论基础
吕纯业[8]2007年在《重组腺病毒介导的人内皮抑素、反义K-Ras基因联合转染治疗胰腺癌的实验研究》文中研究表明目的:观察重组腺病毒介导的人内皮抑素基因(hEndostatin)和反义K-Ras基因联合转染对胰腺癌的治疗作用,探索两种载体联合转染治疗胰腺癌的可行性。方法:构建携带hEndostatin基因和靶向于突变K-Ras exon 1的反义RNA复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-hEnd和Ad-aK-Ras,单独或联合转染胰腺癌细胞系SW1990,观察Endostatin的表达及生物学活性、胰腺癌细胞的增殖和凋亡、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达及体内治疗效应。结果:成功构建了两种复制缺陷型重组腺病毒载体;Ad-aK-Ras显著抑制SW1990细胞的增殖、促进SW1990细胞的凋亡并下调VEGF的表达;Ad-hEnd转染SW1990细胞后表达产物具有生物学活性,在体外对SW1990细胞的增殖和凋亡均无影响,但下调VEGF的表达;两种载体单独和联合转染均显著抑制胰腺癌的体内生长,联合转染抑瘤作用强于单独转染。结论:重组腺病毒在可介导目的基因向SW1990细胞的转移并高效表达,Ad-hEnd和Ad-aK-Ras能有效抑制SW1990细胞的体内生长,两种载体联合转染具有更强的抗肿瘤作用,为胰腺癌的抗血管生成治疗和联合基因治疗提供了新的思路。
杨健[9]2003年在《重组人纤溶酶原K5在毕赤酵母中的表达、纯化及其抗肿瘤新生血管生成基因治疗》文中研究表明肿瘤新生血管生成(tumor angiogenesis)是肿瘤的标志之一，在肿瘤的生长、转移等生物学过程中有重要作用。抗肿瘤新生血管生成的药物和基因治疗正在进行实验和临床研究，初步结果表明该疗法能有效地抑制肿瘤生长、转移，具有广阔的应用前景。已发现多种内源性的新生血管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin等，能特异地抑制内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成，并显示较强的抗肿瘤生长和转移作用。Angiostatin是纤溶酶原的降解片段，主要结构为纤溶酶原分子的4个K(kringle, K)结构域，是抑制新生血管生成的关键性结构。纤溶酶原K1-3结构域，K5结构域等均能抑制新生血管生成，K5结构域具有很强的抑制内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成等作用。为深入研究人纤溶酶原K5结构域(K5)的抗新生血管生成作用，我们利用重组DNA技术，在毕赤酵母表达系统中表达K5 cDNA克隆，鉴定其生物学活性；同时构建了含K5 cDNA基因的真核表达质粒pcDNA3K5和重组复制缺陷性腺病毒(Ad-K5)重组病毒颗粒，研究其对内皮细胞增殖、管腔形成的抑制作用，并用于实验性抗肿瘤新生血管生成基因治疗，取得了令人鼓舞的结果。一、 人纤溶酶原K5结构域cDNA基因在毕赤酵母中的表达、纯化应用PCR方法，扩增人纤溶酶原K5 cDNA基因，与分泌型酵母表达载体pPIC9K5重组后，转化甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris)，筛选获得的重组转化子，甲醇诱导表达，表达产物经纯化后，用内皮细胞增殖抑制实验，证实其生物学活性。本实验构建的含K5 cDNA基因的重组分泌型酵母表达质粒pPIC9KK5在α-factor信号肽序列中仅保留了一个Kex2蛋白酶水解位点，以获得N端均一的重组K5蛋白(rh-K5)，重组质粒转化酵母后，得到的转化子经甲醇诱导表达后，表达产物经SDS-PAGE和Wester Blot证实含有目的蛋白rh-K5，经纯化后，得到的rh-K5对牛毛细血管内皮(bovine capillary endothelial, BCE)细胞增殖有抑制作用，促进内皮细胞凋亡，但对细胞周期无明显影响。<WP=5>二、人纤溶酶原K5结构域基因转染体外实验应用PCR方法，将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA基因，与真核表达载体pcDNA3重组，筛选得到重组克隆pcDNA3K5，脂质体法转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231，G418筛选阳性克隆，PCR、RT-PCR和Western-Blot鉴定K5表达；将pcDNA3K5与穿梭质粒pShuttle重组，获得的重组克隆pShuttlek5与复制缺陷型腺病毒DNA重组，转化E.coli:DH5α，获得重组复制缺陷型腺病毒K5质粒DNA(pAd-K5)，将其转染HEK293细胞，在其中包装、扩增制备重组复制缺陷型腺病毒K5(Ad-K5)。检测稳定表达rh-K5的MDA-MB-231细胞培养上清对BCE和人脐静脉内皮细胞EVC304增殖的抑制作用；Ad-K5感染BCE和ECV304细胞，观察其对两种内皮细胞增殖和管腔形成的影响。PCR扩增产物与pcDNA3重组后得到的克隆经酶切鉴定、测序确证，表明人纤溶酶原信号肽序列与K5 cDNA基因正确融合，将其转染MDA-MB-231细胞，筛选得到的阳性克隆，经PCR、RT-PCR和Westrn Blot检测表明，目的基因重组入细胞染色体，并能表达和分泌rh-K5。将稳定表达rh-K5的MDA-MB-231细胞培养上清作用于BCE和ECV304细胞后，对两者增殖有抑制作用，而其自身的增殖无明显影响；将pcDNA3K5与pShuttle重组得到的克隆pShttleK5与复制缺陷型腺病毒DNA重组，转化DH5α得到重组克隆pAd-K5，转染HEK293细胞，在其中包装、扩增后制备Ad-K5，将其感染BCE、ECV304细胞和MDA-MB-231细胞，对BCE和ECV304细胞增殖有抑制作用，并抑制BCE和ECV304细胞形成毛细血管样管腔结构，对MDA-MB-231细胞增殖无明显影响。三、 人纤溶酶原K5 结构域基因转染动物实验将稳定表达rh-K5的MDA-MB-231细胞在体外培养、扩增后接种至BALB/c nu/nu裸小鼠皮下，制备裸鼠乳腺癌模型，观察转染pcDNA3K5对肿瘤生长的影响，测肿瘤体积，绘制生长曲线，接种后30d，处死动物，测瘤重，RT-PCR检测K5 mRNA表达；免疫组化：VIII因子相关性抗原(factor VIII related antigen, FVIIIRAg)标记血管内皮细胞，计数肿瘤微血管，检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、凋亡相关蛋白Bcl-2和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达。与未转染和转染pcDNA3的MDA-MB-231细胞比较，转染pcDNA3K5的MDA-MB-231细胞在裸小鼠皮下生长延缓，肿瘤体积较小，瘤重较轻，其差别有统计学意义(P<0.01)，RT-PCR检测表明K5 mRNA表达；计数肿瘤微血管发现转染pcDNA3K5组的微血管数较少(P<0.01)；转染pcDNA3K5组VEGF和Bcl-2的表达<WP=6>降低(P<0.05)，PCNA的表达无明显变化(P>0.05)，说明rh-K5通过抑制肿瘤新生血管生成抑制肿瘤生长。上述结果表明，通过基因工程制备的新生血管生成抑制因子rh-K5具有生物学活性，可用于进一步的实验和临床研究；对其结构进行改造，可能获得活性更强的新生血管抑制因子；用病毒或非病毒载体进行K5抗肿瘤新生血管生成基因治疗也可能取得抗肿瘤效果。
柯昌兴[10]2010年在《溶瘤HSV G47δ联合血管生成抑制因子、丝裂霉素C抗膀胱癌效应研究》文中研究表明研究表明,第三代溶瘤单纯疱疹病毒G47δ(Herpes simplex Virus G47delta,简称G47δ),具有较第二代溶瘤单纯疱疹病毒G207特异性地杀伤肿瘤细胞的能力更强、速度更快。内源性血管生长抑制因子可抑制肿瘤原发灶和转移灶的生长,具有无免疫源性,不良反应轻等优点。丝裂霉素C(Mitomycin C,MMC)广泛用于膀胱尿路上皮癌(简称膀胱癌)术后的膀胱灌注化疗。联合应用G47δ与内源性血管生长抑制因子或MMC抗膀胱癌,可能发挥协同作用。研究目的1.探讨能否从人膀胱癌组织克隆出Kringle 5基因(简称K5),并鉴定其原核表达蛋白有无生物学活性。2.探讨G47δ、pcDNA3.1/K5对膀胱癌细胞的增殖抑制作用,二者联合应用有无协同作用。3.探讨联合应用G47δ和MMC对膀胱癌细胞的协同杀伤作用。4.探讨能否从人膀胱癌组织克隆出Endostatin基因(简称ES),并把ES与K5拼接构建成融合基因的技术和方法。5.探讨膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的表达水平与膀胱癌分级、分期的相关性,为运用内源性血管生成抑制因子抗膀胱癌治疗提供依据。研究内容与方法1.K5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定:从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因;构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5;运用工程菌表达蛋白,并对表达条件参数进行优化;带谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签琼脂糖4B亲和柱层析、纯化蛋白;CellTiter 96 AQ_(ueous)细胞增殖检测法(MTS)检测K5蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响。2.pcDNA3.1/K5联合G47δ抗膀胱癌效应研究:提取病毒DNA,PCR扩增目的片段,进行琼脂糖凝胶电泳和基因测序鉴定G47δ构建的正确性;蚀斑实验测定G47δ的蚀斑形成单位;培养人膀胱癌细胞株BIU-87(浅表性膀胱癌)和EJ(侵润性膀胱癌)细胞;构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/K5,用脂质体PolyFect介导pcDNA3.1/K5转染BIU-87和EJ细胞,再用G47δ感染癌细胞,MTS法检测癌细胞增殖情况;构建pEGFP-n2/K5,用PolyFect介导pEGFP-n2/K5转染癌细胞,再用G47δ感染癌细胞,荧光显微镜观测K5在癌细胞中的定位变化;蚀斑实验检测pcDNA3.1/K5-PolyFect对G47δ的繁殖影响;pcDNA3.1/K5转染癌细胞后,RT-PCR检测癌细胞内K5 mRNA水平。3.G47δ联合MMC抗膀胱癌效应研究:G47δ感染癌细胞1h后,加MMC,MTS法检测癌细胞增殖情况,Chou-Talalay法推算联合用药指数并用Isobologram法分析联合用药效应;比较G47δ与野生型HSV-1对癌细胞增殖抑制作用;蚀斑实验检测MMC对G47δ病毒繁殖有无影响。4.ES基因的克隆、ES-K5融合基因拼接及其真核表达质粒的构建:从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增ES基因;重叠延伸拼接法(SOE)构建ES-K5融合基因;构建真核表达质粒pcDNA3.1/ES、pcDNA3.1/ES-K5、pEGFP-n2/ES-K5,基因测序鉴定。5.膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的检测:酶联免疫吸附试验(ELISA)检测膀胱癌患者血清、尿液中VEGF(vascularendothelial growth factor)、Angiostatin(AS)、ES、K5表达水平,免疫组织化学法(IHC)检测膀胱癌组织标本中VEGF、AS、ES、K5表达情况,分析它们与膀胱癌分级、分期的相关性。实验结果1.K5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定:PCR扩增得到282 bp基因片段,并成功插入pGEX-5X-1质粒;诱导温度为37℃,IPTG浓度为1mmol/L,时间为6h,pGEX-5X-1/K5在BL21中表达最佳;获得特异性融合蛋白,经凝血酶酶切后得到分子量约为12kD的重组K5蛋白(rK5);rK5能特异性抑制ECV304细胞增殖,抑制率最高蛋白浓度为5μg/ml。2.pcDNA3.1/K5联合G47δ抗膀胱癌效应研究:G47δ能在Vero细胞中繁殖,并出现特征性的CPE病变;琼脂糖凝胶电泳PCR扩增的G47δ目的片段条带宽亮,位于250bp、500bp之间,而PCR扩增的HSV-1目的片段位于500bp、750bp之间,病毒DNA序列测序均正确,表明所重组G47δ构建正确;蚀斑实验计算G47δ蚀斑形成单位为2.5×10~7pfu/ml;pcDNA3.1/K5、G47δ对BIU-87、EJ细胞增殖有抑制作用,而且抑制率与G47δ剂量、作用时间正相关,联合作用抑制率比其单一作用要强;荧光显微镜观测,K5-EGFP融合蛋白在癌细胞胞浆、胞核中均有表达,G47δ对其定位并无影响;pcDNA3.1/K5对G47δ繁殖无明显影响,蚀斑形成单位数基本相同;pcDNA3.1/K5转染癌细胞后,RT-PCR扩增K5 mRNA条带位于250bp、500bp之间,符合K5核苷酸大小。3.G47δ联合MMC抗膀胱癌效应研究:G47δ、MMC对BIU-87、EJ细胞增殖均有抑制作用,而且抑制率与G47δ、MMC的剂量和作用时间正相关,Chou-Talalay法分析合用指数CI_x＜1,Isobologram法分析q＜1,表明二者具有协同作用;G47δ对癌细胞的增殖抑制作用比野生型HSV-1明显要强;MMC对G47δ繁殖无明显影响,蚀斑形成单位数基本相同。4.ES基因的克隆、ES-K5融合基因拼接及其真核表达质粒的构建:PCR扩增得到552bp基因片段,并成功插入pcDNA3.1质粒,基因测序正确;SOE法所构建融合基因ES与K5中间的Linker为(Gly4Ser)3,ES-K5融合基因成功插入pcDNA3.1和pEGFP-n2真核表达质粒,基因测序正确。5.膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的检测:膀胱癌患者血清、尿液中VEGF、AS、ES、K5表达水平与膀胱癌分级、分期正相关;VEGF、AS、ES在癌组织中的表达也与分期正相关。结论1.K5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定:1)从膀胱癌组织能克隆出Kringle5基因。2)对蛋白表达条件参数优化后,确定诱导温度为37℃,IPTG浓度为1mmol/L,时间为6h,pGEX-5X-1/K5在BL21中表达最佳。3)含重组质粒pGEX-5X-1/K5大肠杆菌表达产物量较多且易纯化。2.pcDNA3.1/K5联合G47δ抗膀胱癌效应研究:1) pcDNA3.1/K5、G47δ对膀胱癌细胞增殖均有抑制作用,而且抑制率与G47δ剂量、作用时间正相关,pcDNA3.1/K5与G47δ联合作用抑制率比其单一作用要强。2) pcDNh3.1/K5对G47δ病毒繁殖无明显影响。3) pcDNA3.1/K5转染癌细胞后,能在细胞内稳定表达。3.G47δ联合MMC抗膀胱癌效应研究:1) G47δ、MMC对膀胱癌细胞增殖均有抑制作用,抑制率与G47δ、MMC的剂量和作用时间正相关,二者合用具有协同作用。2) G47δ对癌细胞的增殖抑制作用比野生型HSV-1明显要强。3) MMC对G47δ繁殖无明显影响。4.ES基因的克隆、ES-K5融合基因拼接及其真核表达质粒的构建:1)从膀胱癌组织能克隆出Endostatin基因。2) SOE法所构建Linker能把ES与K5拼接起来,并能成功插入到真核表达质粒中。5.膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的检测:1) VEGF、AS、ES、K5在膀胱癌中分泌表达与分级、分期正相关。2)肿瘤血管新生正性和负性调控平衡被打破的原因可能是由于血管生成因子与血管生成抑制因子表达分泌均增多、增强,但以前者更为显著。3)去除原发肿瘤后微转移灶迅速生长的原因是由于微转移灶中血管生成因子与由原发肿瘤所分泌的血管生成抑制因子来源减少而使调控平衡被打破,但这一机制不能合理解释血管生成抑制因子表达量与肿瘤分级、分期正相关的现象,有待于进一步研究。
参考文献：
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[2]. 人KininogenD5和TRAIL融合蛋白的克隆表达和生物学活性研究[D]. 宗英. 第二军医大学. 2007
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[4]. 食管癌血管形成及抗血管治疗的实验研究[D]. 郭文忠. 中国协和医科大学. 2000
[5]. 血管生成抑制剂Vasostatin蛋白的制备和抗肿瘤研究[D]. 赵阳. 天津大学. 2005
[6]. 人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795生长和转移抑制的初步研究[D]. 夏虎. 第一军医大学. 2002
[7]. 小鼠endostatin基因的克隆与C6鼠脑胶质瘤的治疗[J]. 章翔, 吴景文, 屈延, 费舟, 高大宽. 第四军医大学学报. 2000
[8]. 重组腺病毒介导的人内皮抑素、反义K-Ras基因联合转染治疗胰腺癌的实验研究[D]. 吕纯业. 第二军医大学. 2007
[9]. 重组人纤溶酶原K5在毕赤酵母中的表达、纯化及其抗肿瘤新生血管生成基因治疗[D]. 杨健. 复旦大学. 2003
[10]. 溶瘤HSV G47δ联合血管生成抑制因子、丝裂霉素C抗膀胱癌效应研究[D]. 柯昌兴. 昆明医学院. 2010
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