郴州市第一人民医院肾内科 湖南郴州 42300
【摘 要】目的：维生素D受体激动剂对高糖诱导HK-2细胞RhoA活化的影响效果。方法：选择人近端肾小管上皮细胞株（HK）为细胞株。完成细胞的传代以及培养以及细胞冻存和复苏。利用30mmol/L的高糖培基对HK-2细胞加以刺激，并利用western Blot观察，时间为0min，30min，1、2、4、8、12h活性RhoA蛋白表达详情。利用PCR和western Blot观察0-72hα-平滑肌肌动蛋白以及E钙黏素蛋白与信使RNA表达详情。把HK-2细胞定为对照组，高糖组，VitD3组以及BXL-628组。利用PCR以及western Blot观察分析细胞内48hα-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及E钙黏素蛋白与信使RNA表达详情。使用ELISA法与PCR法，测定细胞中48hI胶原蛋白量（col-I）、纤维连接蛋白（Fn）和信使RNA 表达详情。western Blot免疫印迹方法与免疫荧光技术，测定小组细胞的2h活性RhoA蛋白表达详情。结果：高糖环境下，HK-2刺激12h以上后，信使RNA以及α-SMA蛋白的表达量明显上升；HK-2细胞活性RhoA蛋白会随着表达时间上调而上升。和0min相比，30min明显上升，P＜0.05.VitD3组以及BXL-628组的α-SMA与信使RNA和高糖组相比，明显下降，P＜0.05.蛋白水平和对照组相比不存在显著差异。但和对照组相比，信使RNA的水平下调显著。VitD3组以及BXL-628组E钙黏素蛋白与信使RNA表达上调显著，两个小组和对照组相比，蛋白水平不存在显著差异，P＞0.05.信使RNA水平和对照组相比有所上调。经PCR以及ELISA检查证实，VitD3组以及BXL-628组col-I、Fn和信使RNA和高糖组相比下调明显，P＜0.05。相较于对照组，高糖组的活性RhoA蛋白表达上调显著，P＜0.05.VitD3组以及BXL-628组的活性RhoA蛋白和高糖组相比，下调显著。结论：维生素受体D激动剂以及类似物能影响RhoA活化，对高糖诱导的HK-2细胞间充质转分化，令细胞外基质表达量上升。证实维生素D受体激动剂经影响RhoA/ROCK通路，对肾间质纤维化进程造成影响。
【关键词】维生素D受体激动剂；高糖诱导HK-2细胞；RhoA活化
和以往相比，我国糖尿病的发生率呈现出了逐年上升的趋势。现已经成为严重威胁人类生命健康的重要疾病。糖尿病肾病为二型糖尿病严重并发症之一，其已经成为了终末期肾脏疾病第二大原发性病变。该疾病的发生率也有所上升。肾脏纤维化为当前认为是糖尿病肾病进展的主要环节之一，肾间质纤维化为肾脏纤维化的重要表现与病理病变过程。所有的肾脏疾病的发展过程中，均伴随了肾间质纤维化发生以及发展，最终演变为肾脏衰竭。当前，有大量临床研究证实[1]：RhoA/ROCK信号在肾脏纤维化的发生以及发展中发挥了一定作用。该通路参与到了调控上皮细胞转分化中。
维生素D受体激动剂对于上皮细胞增生过程内的RhoA/ROCK通路存在抑制效应。迄今为止，临床对于维生素D受体和配体介导抗肾脏纤维化作用的详细机制，尚未完全明确。结合实际情况，本文分析了维生素D受体激动剂对高糖诱导HK-2细胞RhoA活化的影响效果。现将具体结果汇报如下。
1.资料与方法
1.1一般资料与方法
选择人近端肾小管上皮细胞株（HK）为细胞株。实验方式主要为：
第一、细胞的传代以及培养
利用DMEM/F12+10%FBS完成HK-2培养工作，放入到5%CO2，37℃环境下完成培养，当其生长到75%到85%融合后，开展传代工作。弃掉培养瓶中培基。1X PBS轻摇洗涤细胞，弃去PBS。加入毫升数为0.5ml胰酶消化液，令其覆盖细胞层，放入到培养箱中消化3至5min移除。镜下观察细胞形态变化等到大于80%上细胞子培养瓶壁脱落后，细胞变小变圆。加入内含FBS培基，终止消化过程。后吹打细胞液。当其成为单细胞悬液之后，将hk-2细胞依照1：3或者1：2比例完成传代。在此之后加入新鲜培基吹打均匀，放到细胞培养箱。24小时更换液体一次，在此之后，24小时更换液体一次。
第二、细胞冻存和复苏
等到hk-2细胞成长到70%融合后，开展细胞冻存。洗涤细胞，弃去PBS，加入1ml胰酶消化液，放入到培养箱内开展消化3至5min后取出，镜下观察细胞形态变化，等到大于80%，细胞从培养瓶壁脱落后细胞变圆变大。
放入内含FBS培基，终止消化。把细胞移植到低温离心处理5min.弃去上清液，加入冻存液，吹打均匀。每个培养瓶，分为两管完成冻存工作。在各个冻存存管内加入毫升数为1.5ml的细胞冻存液，封闭处理。放入到4℃环境下平衡处理30至60min。在此之后，放入到-20℃环境下静置2h，之后转入-80℃过夜。次日，将其放入液氮内，长期保存。
在进行复苏细胞过程中，应当将细胞自液氮罐内取出，放置于37℃环境下水浴，摇晃。令管内凝块解冻。完全解冻后使用酒精对冻存管擦拭消毒。将细胞悬液放入到事先加入5ml培养基的离心管内水平离心，时间为三分钟。后弃去上清，加5ml新鲜培养基，吹吸细胞悬液，接种到培养瓶中。放入细胞培养箱6h之后换液，在此之后24h换液。
利用30mmol/L的高糖培基对HK-2细胞加以刺激，并利用western Blot观察，时间为0min，30min，1、2、4、8、12h活性RhoA蛋白表达详情。
利用PCR和western Blot观察0-72hα-平滑肌肌动蛋白以及E钙黏素蛋白与信使RNA表达详情。
把HK-2细胞定为对照组（葡糖含量为5.6mmol/L），高糖组（葡糖30.0mmol/L），VitD3组（VitD3，10-7mol/L+高糖）以及BXL-628组（BXL-628，10-5nmol/L+高糖）利用PCR以及western Blot观察分析细胞内48hα-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及E钙黏素蛋白与信使RNA表达详情。
使用ELISA法与PCR法，测定细胞中48hI胶原蛋白量（col-I）、纤维连接蛋白（Fn）和信使RNA 表达详情。
使用western Blot免疫印迹方法与免疫荧光技术，测定小组细胞的2h活性RhoA蛋白表达详情。
1.2统计学方法
实验使用SPSS20.0专业统计学软件，对数据内的计数资料使用x2检验计算，计量资料使用t值检验计算，当P＜0.05时，组间数据存在明显差异。
2.结果
（1）当高糖细胞对HK-2刺激12h以上后，信使RNA以及α-SMA蛋白的表达量明显上升，和0h相比，增加量存在统计学差异。48h的α-SMA与信使RNA的表达量达到峰值。
高糖环境内，E钙黏素蛋白表达和时间呈现反比，12h和0h时相比，P＜0.05.当在48h时，表达最为显著。
详细见图1.
图1 各个时间点高糖刺激对HK-2细胞α-SMA信使RNA表达影响详情
（2）高糖环境下，HK-2细胞活性RhoA蛋白会随着表达时间上调而上升。和0min相比，30min明显上升，P＜0.05.1h时存在差异，2h时达到高峰。
详细见图2.
图2 维生素受体D激动剂对高糖诱导HK-2细胞RhoA蛋白活化影响详情
（3）VitD3组以及BXL-628组的α-SMA与信使RNA和高糖组相比，明显下降，P＜0.05.蛋白水平和对照组相比不存在显著差异。
但和对照组相比，信使RNA的水平下调显著。
VitD3组以及BXL-628组E钙黏素蛋白与信使RNA表达上调显著，两个小组和对照组相比，蛋白水平不存在显著差异，P＞0.05.信使RNA水平和对照组相比有所上调。
经PCR以及ELISA检查证实，VitD3组以及BXL-628组col-I、Fn和信使RNA和高糖组相比下调明显，P＜0.05。
详见图3、图4.
图3 维生素受体D激动剂对于高糖诱导的按HK-2细胞胶原蛋白I型信使RNA表达影响详情（PCR法）
图4 维生素受体D激动剂对于高糖诱导的按HK-2细胞胶原蛋白I型信使RNA表达影响详情（ELISA法）
（4）相较于对照组，高糖组的活性RhoA蛋白表达上调显著，P＜0.05.
VitD3组以及BXL-628组的活性RhoA蛋白和高糖组相比，下调显著。两组和对照组相比无明显差异。免疫荧光检查同样证实该结果真实性。
3.讨论
糖尿病肾病的发病机制相对复杂。在此其中一个相对重要的机，主要涉及到高糖诱导肾小管上皮细胞间质转分化。文献证实，糖尿病肾病在早期就可发生肾小管间质受损和细胞外基质代谢不正常，并逐渐转变为间质纤维化。在疾病的发生发展过程中，RIF发挥了一定作用，EMT被认为是肾脏纤维化的关键步骤。在糖尿病肾病中存在EMT，这一点已经被相关学术文献所证实。在高糖内环境中，肾小管上皮细胞会发生程度不一的向基层纤维细胞转化现象，同时成为肾脏细胞外基质生成的主要来源[2]。
RhoA蛋白与生物体中主要分为两种形式，详细为GTP结合活化以及GDP失活形式.上述两种形态之间的转化主要受到Rho调节蛋白作用.在此其中经过转录后，修饰作用令RhoA转位到细胞膜过程，对于RhoA活化相当重要。ROCK为当前研究较多的RhoA下游效应分子。在高糖条件下，其能够诱导肾脏细胞膜出现RhoA活化现象，并且RhoA和下游效应分子可以介导胶原蛋白等等基质的细化以及堆积。高糖环境能够经过PKC、CTGF等介质进对RhoA信号起到介导作用，令通路活化。ROCK抑制剂能抑制或者消除因高糖刺激引起的HK-2产生的上述病变。
维生素D受体和自身配体介导的生物效应涉及较为宽泛，但当前对于其具体的作用机制尚不明确。
在糖尿病肾病疾病中，维生素D受体所介导的生物效应，不单单对炎症反应控制、免疫调控、抗蛋白尿控制、抑制Ras系统等方面发挥效用。还能够经过提升胰岛素抵抗和调节血脂方面发挥效果，进而取得保护肾脏的最终成效。
有研究证实[3]，维生素D受体之所以对肾脏能够起到保护效应，其可能从EMT上游发挥抗纤维效应有关。活化的维生素D受体所介导肾脏保护效应，会涉及到多个信号通路。
本次实验中，观察维生素D和其类似物，对于高糖诱导细胞外基质表达影响，中可以发现：利用酶联免疫法观察BXL-628、VitD3均取得了较为明显的抑制高糖诱导hk-2细胞、胶原蛋白I型以及纤维连接蛋白生成效应。上述两组和高糖组相比，均呈现出了显著下调现象。
VitD3对于胶原I型蛋白表达量下调，相较于BXL-628更为显著。但对于细胞连接蛋白fn，BXL-628对该类蛋白表达效调活性比维生素D显著，但两组均不存在显著的差异。不管是维生素D还是其类似物bxl-628，亦或者是他们对于高糖诱导肾小管上皮细胞ECM蓄积改善均是十分显著的.上述两者从效果上来看相当。
参考文献：
[1]陈艳霞. 重组人红细胞生成素对高糖环境下体外培养HK-2细胞RhoA/ROCK信号通路的影响[D]. 南昌大学医学院；南昌大学，2014.
[2]黄翀，陈艳霞，秦晓华，等. 全反式维甲酸对高糖诱导的HK-2细胞外基质合成的影响及可能机制[J]. 中国老年学杂志，2017，37（1）.
[3]郭汉城，兰姗，武俏颖. 1，25-二羟维生素D3对高糖诱导肾小管上皮细胞解耦联蛋白2表达及氧化应激的影响[J]. 中华内分泌代谢杂志，2013，29（10）：849-852.
论文作者:邹琴
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2018年7期
论文发表时间:2018/11/19
标签：细胞论文; 蛋白论文; 信使论文; 受体论文; 维生素论文; 激动剂论文; 诱导论文; 《中国结合医学杂志》2018年7期论文;