石斌山[1]2001年在《FEN-1基因功能及其在遗传不稳定形成中的作用研究》文中研究指明遗传不稳定是肿瘤及遗传性疾病发生的重要原因之一。对遗传不稳定的研究表明其发生机制具有多样性，DNA复制保真度的降低、DNA修复系统的障碍、细胞周期DNA损伤校正点（DNA damage checkpoint）功能的紊乱都可成为其发生的原因。 对遗传不稳定的进一步研究还发现细胞在受到离子辐射、致癌物（如烷化剂）攻击后，也可产生延迟发生遗传不稳定。本实验室曾证明烷化剂甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG）可诱发vero细胞的遗传不稳定状态，表现为延迟发生的非损伤部位DNA突变率的增加（非定标突变）。用0.2μmol/L MNNG处理vero细胞2.5小时后，继续培养12小时，将含有靶基因SupF tRNA的穿梭质粒pZ189转染入细胞并复制48小时，发现在未受MNNG直接攻击过的穿梭质粒pZ189中存在较高的突变率。非定标突变表现出特定的突变谱并具有时相特征。实验还表明非定标突变中DNA复制的保真度下降，并伴有DNA聚合酶β表达水平的改变。进一步的研究发现细胞内信号转导系统的激活和基因表达的改变是非定标突变发生中的重要事件。 结构特异性核酸酶瓣片内切酶FEN-1（flap endo/exonuclease-1）具有对DNA复制和修复都必需的双重功能，并且在维持细胞的遗传稳定性方面也起着重要作用。在DNA复制过程中，FEN-1参与了后随链冈岐片段前方RNA引物的切除；在DNA修复中，FEN-1参与了碱基切除修复（base excision repair, BER）中的长补丁修复（long patchBER）途径，以及部分双链断裂修复（double strand break repair）以及紫外线损伤的修复过程。对酵母中FEN-1同源基因rad27突变体的研究则发现，该突变体存在较强的增变表型，并在遗传不稳定相关基因Can~r，Lys~-中主要以重复性突变（DuplicationMutation）为特征，rad27突变体还表现出质粒及基因组微卫星和小卫星序列的不稳定现象。所以，从rad27突变体的以上增变表型，可以认为FEN-1是细胞遗传稳定性的重要相关基因之一。 为研究FEN－l在人类培养细胞的DNA复制和维持遗传稳定性方面所起的作用，以及与非定标突变形成的关系，本实验采用反义核酸技术，将人FENI表达质粒hPET－FCH的 NCo和 BamH双酶切得到 1084hp基因片段，反向克隆到经改建的哺乳动物表达载体pMAMneoAmp－，得到hFENI 反义表达质粒pMAMneoAm－FNB叫各pMAMneoAmp－FNB转入FL细胞，得到FEN］基因表达被阻断的哺乳动物细胞株FL－FEN－l。在地塞米松诱导下，FL－FEN＊－细胞总 RNA经 RT－PCR扩增得到 242 hp的预计DNA片段，说明FENj基囚的反义mRNA片段得到较强的表达，进一步的表型研究则发现FLFEN刁－细胞的DNA复制过程和遗传稳定性状况发生了改变。 FLFEN叫 在 10 u mol／L地塞米松的诱导下，细胞生长速度明显h降，细胞倍增时间 T。为 3．03d。而对照FL利 FL－M细胞倍增时间 T。分别为 2．03d＃112．22d。与 FL－M相比，FLFEN叫－细胞在第4大开始生长明显受到抑制（P＜0刀5），并在此后持续受到抑制（A0刀1）。采用流式细胞仪，在12 h和扣h二个时相，对经相同同步化处理后的 FL－FEN1－细胞进行了细胞周期测定。在 12 h时，FLFEN、厂细胞｝ DNA合成的进程受阻，表现为 S－期细胞的比例与对照细胞相比明显较低。24 h时，卜LFEN－l 细胞的 GO－GI fib细胞呈高比值，S－沏细胞的比例与对照细胞无明显差异，但 GZ。MFP细胞的比例明显较低，只有极少数的细胞进入GZ－M州，人部分细胞处了GO－01 ）uh和S期，这表明此时卜卜陀付1 细胞虽然能进行＊＊A的合成，但无法完成S期的整个过程而进入 GZ－M期，并在 GI fill山现了停滞。以上结果说明 FENI基冈被阻断后，将延缓哺乳动物细胞进入利进行 DNA合成的进材，并使人部分细胞停留了GI Vb。 在由穿梭质粒pZ189介导的细胞囱发失变和 MNNG诱导的非定标夹变检测中发现，穿梭质粒pZ旧9质粒在FLFEN刁－细胞中复制后，其中巴基冈SopF tRNA的囱发突变频率为19．IX 10‘，而对照细胞队羽IF卜M细胞中…F爪＊A基冈的自发夹变频率分别为 2．gX10－‘和 3．0X10－‘，但 FL－FEN－l－细胞经 MNNG诱导后在穿梭质粒pZ189中的Sop尸t＊＊A基冈上的非定标夹变频率与对照细胞并无明显差异，这表明由FENI阻断造成的突变频率于l－高与细胞在受低浓度MNNG攻击后发生的非定标夹变可能通过不同的途径形成。 穿梭质粒 pZ旧9转染 FLFEN－1－细胞及经 0．25 u mol／L MNNG诱导的 FLFEN1后，其靶基因 SopF tRNA ％变的夹变谱的分析发现，自发夹变中进行测序分析的 23 2个突变于共含有37个点突变，其中碱基转换占32％，碱基颠换占68％。在MNNG诱发的非定标突变中进行测序分析的 16个点突变突变子共含有 24个点突变，其中碱基转换占25％，碱基颠换占75％。分析还发现，在FLFEN十细胞自发突变和非定标突变含有单碱基替换突变的突变子中，碱基颠换的发生率极高，而在FLFEN－l－细胞?
王娜[2]2012年在《基于数据挖掘技术的肺癌早期预警模型研究》文中研究表明肺癌是当今世界各国最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率呈不断上升趋势,对人类的健康和生命构成了极大威胁。在中国,肺癌每年大约导致40万例患者死亡,已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。研究显示I期肺癌术后10年生存率可达到92%。然而肺癌早期不易诊断,恶性程度高,一经病理确诊多数已属晚期,失去手术治疗的最佳时机,总的5年生存率仅为15%左右。因此,要降低肺癌患者的死亡率关键在于肺癌的早期发现、早期诊断和早期治疗。肺癌的发生是多因素、多基因和多阶段发展的复杂过程,由于传统的影像学检查和支气管镜等检查手段存在敏感性、特异性和适用度等方面的局限,近年来国内外学者对肺癌早期预警或诊断相关的分子标志和多种肿瘤生物标志的联合检测做了大量有益的探索,以期找到更合理、敏感性和特异性更高的分子联合标志。肺癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果,因此在寻找肺癌早期预警或诊断的生物标志时,也可以从两方面着手,即反映机体先天具有或后天获得的对外源性物质产生反应能力的易感性标志；反映早期生物效应、结构和/或功能改变以及疾病的效应标志。遗传因素属于前者,其作用体现在同一环境暴露中个体肿瘤易感性的差异,归根到底由基因多态所代表的遗传背景决定。另一方面,在很多情况下,许多分子事件的发生早于明显恶性表型的出现,因此,运用分子生物学的方法检测肺癌发生过程中的早期分子事件,从而发现癌前病变或早期癌变也被认为是肺癌早期预警最具应用前景的手段。肿瘤发生的早期生物效应包括了DNA甲基化和端粒损伤在内的遗传学和表观遗传学改变。数据挖掘(Data Mining),又称数据库知识发现(Knowledge Discovery from Database, KDD),它是从大量数据中提取并挖掘未知的、有价值的模式或规律等知识的复杂过程。它通常与计算机科学有关,并通过统计、在线分析处理、情报检索、机器学习、专家系统(依靠过去的经验法则)和模式识别等诸多方法来实现上述目标。数据挖掘与传统数据分析有着本质的区别。数据挖掘是在没有明确的假设的前提下挖掘信息和发现知识。同时,通过数据挖掘得到的信息具有先前未知、有效及可实用3个特征。数据挖掘中的决策树和人工神经网络技术(Artificial Neural Networks, ANN)能够对数据信息进行大规模并行处理和分布式存储,且具有良好的自适应性、自组织性及较强的学习功能、联想功能和容错功能。在肿瘤的诊断方面,不仅能够起到检测可疑病变和分类的作用,还能挖掘用于检测和分类的潜在特征标志,为肿瘤的诊断做出建设性贡献。本研究检测对象外周血中CYP1A1, GSTM1, GSTT1, mEH, XRCC1基因多态性、p16和RASSF1A基因甲基化水平及端粒相对长度,探讨5种基因多态性与p16、RASSF1A基因甲基化和端粒相对长度的相关关系,在此基础上应用数据挖掘技术,检测这些分子指标对肺癌早期预警的相关性,抽取可用于肺癌预警的有效特征,构建较为适合的预测模型,探讨是否有助于提高肺癌早期预警或诊断的正确率及联合检测对肺癌辅助诊断的意义,以实现肺癌早期预警、诊断和分类的自动化,为高危人群的筛查和临床肺癌诊断提供有价值的参考资料。目的1.探讨肺癌患者外周血I相代谢酶基因CYP1A1,Ⅱ相代谢酶基因GSTM1、GSTT1、mEH,及DNA修复酶基因XRCC1的多态基因型与肺癌易感之间的关系,探讨抑癌基因p16、RASSF1A甲基化及端粒相对长度与肺癌发生的关系,筛选出与肺癌发生相关的有效分子生物标志,找出对肺癌早期预警意义最大的几项,为肺癌的早期预警提供基础资料。2.将数据挖掘技术和上述分子标志相结合,构建可“自动”处理信息的智能预警模型,为肺癌智能预警系统的研制开辟一条新途径,提高肺癌早期预警的准确率。材料与方法1.以251例肺癌患者和256例健康体检者为研究对象。2.采用等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification, ASA)检测CYP1A1-exon7位点多态性,采用多重PCR法检测GSTM1、GSTT1基因多态性,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法分别检测CYP1A1-Mspl位点、mEH-exon3、mEH-exon4、XRCC1-194、XRCC1-280及XRCC1-399位点基因多态性。采用实时荧光定量甲基化特异PCR (real-time methylation specific PCR, qMSP)技术检测p16和RASSF1A基因甲基化水平,采用荧光定量PCR法检测端粒相对长度。3.应用SPSS12.0统计分析软件,采用x2检验、t检验、秩和检验、Logistic回归分析等方法对基因多态、甲基化水平和端粒相对长度的结果进行一般统计学分析处理,探讨基因多态性、DNA甲基化及端粒相对长度变化与肺癌发生的关系,筛选可能用于肺癌早期判别模型的有效指标。4.将每组样本按3：1的比例随机分为训练集和测试集,将CYP1A1-exon7、GSTM1、mEH-exon3、XRCC1-194和XRCC1-280位点基因多态性、p16基因和RASSF1A基因甲基化水平、端粒长度及吸烟情况作为输入参数,用Fisher判别分析、决策树C5.0和反向传播神经网络算法(Back-Propagation, BP算法)分别对训练集进行训练建立模型,用训练好的模型对相应的测试集进行盲法预测,验证判别模型的优劣,最终建立肺癌早期智能化预警模型。结果1. GSTM1基因缺失型,CYP1A1-exon7、mEH-exon3、XRCC1-194及XRCC 1-280基因位点纯和突变型在病例组与对照组中的分布频率差异均有统计学意义(P<0.05),GSTM1基因缺失者与GSTM1基因阳性者相比发生肺癌的危险性升高(ORadj=1.727,95%CI：1.211-2.463)；携带CYP1A1-exon7 Ile/val+val/val基因型的个体较携带CYP1A1-exon7 Ile/Ile基因型的个体发生肺癌的危险性升高(ORadj1.727,95%CI：1.203-2.477);mEH-exon3突变基因型携带者与野生纯合型的个体相比发生肺癌的危险性升高(ORadj1.758,95%CI：1.194-2.589)；携带XRCC1-194 Arg/Trp+Trp/Trp基因型的个体较携带XRCC1-194 Arg/Arg基因型的个体发生肺癌的危险性升高(ORadj=1.542,95%CI：1.083-2.196)；XRCC1-280His/His基因型携带者较XRCC1-280 Arg/Arg+Arg/His基因型携带者发生肺癌的危险性升高(ORadj=2.941,95%CI：1.427-6.060)。CYPIA1-Msp1、GSTT1、mEH-exon4及XRCC 1-399多态基因型在病例组与对照组中的分布频率差异均无统计学意义(P>0.05)。基于5种基因多态性建立肺癌判别模型,结果为Fisher判别分析、决策树及ANN对训练集和预测集的准确率分别为63.59%、63.25%；95.64%、82.61%：84.1%、80.77%,Fisher判别分析、决策树及ANN模型的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.627、0.836、0.821。2.肺癌组外周血p16基因和RASSF1A基因甲基化水平及端粒相对长度分别为0.59(0.16～4.50)、27.62(9.09～52.86)、0.93±0.32,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；p16基因和RASSF1A基因启动子区甲基化水平增高及端粒相对长度缩短与肺癌发生危险性增加有关；性别、年龄、吸烟情况、肺癌分期和病理类型与p16基因、RASSFIA基因甲基化及端粒长度无关(P>0.05)。基于上述指标建立肺癌判别模型,结果为Fisher判别分析、决策树及ANN对训练集和预测集的准确率分别为66.34%、65.82%;77.26%、75.45%；72.15%、71.72%,3种模型的AUC分别为0.660、0.782、0.759。3. XRCC1-280位点不同基因型之间p16甲基化水平有差异,CYP1A1-exon7、GSTM1、mEH-exon3和XRCC1-280位点不同基因型之间RASSFIA基因甲基化水平不同,CYP1A1-exon7和GSTM1基因突变型与野生型相比端粒相对长度差异。基于上述综合指标建立肺癌判别模型结果显示,Fisher判别分析、决策树及ANN对训练集和预测集的准确率分别为72.15%、70.59%；93.88%、93%;92.96%、89.62%,3种模型的AUC分别为0.722、0.929、0.894。决策树模型对临床早期(I+II期)肺癌的判别准确率为96.36%,ANN模型为89.09%。结论1.CYP1A1-exon7、GSTM1、mEH-exon3、XRCC1-194和XRCC1-280基因位点的变异、p16和RASSFIA基因甲基化水平异常增高、端粒相对长度缩短与肺癌患癌危险度增加有关,上述指标组成肺癌早期预警模型的分子标志群。2.数据挖掘技术联合肺癌发生相关的多角度分子事件建立模型对肺癌的判别准确性优于单方面分子标志的检测。3.本文建立的多个肿瘤分子标志联合决策树和ANN技术的肺癌早期预警模型对肺癌的判别优于传统的Fisher判别方式,比常规的统计学方法更适合于临床数据的分析,准确度较高,可以用于肺癌早期预警。
吴飞翔[3]2009年在《核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性研究》文中研究表明卵巢上皮癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第叁位,死亡率却居第一的恶性疾病。由于卵巢解剖上隐匿于盆腔深处,在发病早期缺乏特异性症状和体征,很难在早期发现和诊断,约60%-70%的卵巢癌患者确诊时已属于晚期。近30年来,虽然经过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力,不断改进手术方式、现更新更好的化疗药物和增加新的化疗方案,但是5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。铂类药物是治疗卵巢癌、肺癌等实体瘤的常用药物,而DNA损伤修复能力增强是导致卵巢癌铂类耐药的主要原因之一, DNA修复途径中的核苷酸切除修复、错配修复、碱基切除修复等均与铂类药物耐药有关,而核苷酸切除修复(NER)通路被认为是机体内修复DNA损伤的最主要途径。NER通路主要基因有:①DNA损伤的识别:涉及XPA、XPC等基因;②损伤部位DNA链的打开:由TFIIH的亚基ERCC3/XPB和ERCC2/XPD解旋酶打开DNA双链;③寡核苷酸链的切断:XPG和XPF-ERCC1复合体分别在损伤部位的3’端和5’端切断DNA单链;④PCNA、RPA等基因完成缺损部位单链片段的再合成和修补缺口。其中,损伤的识别/切除是通路中的限速或调节环节。在通路中,各个基因发挥着相应的独特作用,并按照严格的顺序加入和置换出NER过程,其中任何一个基因的功能异常即可导致整个通路对损伤修复的效率。目前国内尚未见有关DNA修复基因ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG与卵巢癌铂类药物敏感性的关系的报道,为了了解ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG等基因与卵巢癌铂类药物化疗敏感性的关系,我们在本实验中应用PCR及测序方法筛查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG外显子单核苷酸多态性在卵巢癌耐铂类药物的细胞株和敏感细胞株中的分布差异,探讨了XPGHis46His及XPGHis1104Asp的多态基因型102例卵巢癌患者化疗敏感性的关系,并通过构建人XPG基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌SKOV3耐DDP细胞,检测其对XPG基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,以了解XPG在卵巢癌耐药细胞株中的作用。为提高卵巢癌铂类药物化疗敏感性提供一些的实验依据。卵巢上皮癌铂类耐药与非耐药细胞间核苷酸切除修复酶类基因多态性的检测与比较目的:肿瘤细胞对铂类药物的化疗敏感性与个体的DNA损伤修复能力关系密切, ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG基因是核苷酸切除修复系统( nucleotide excision repair,NER)中与铂类药物抵抗有关的关键因子,本实验拟筛查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG遗传多态与卵巢癌耐铂类药物的细胞株的关系,为下一步实验打下基础。方法:应用PCR及测序方法筛查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG外显子单核苷酸多态性在卵巢癌耐铂类药物的细胞株和敏感细胞株中的分布差异,序列读解采用ChromaS软件,并结合NCBISNP数据库寻找和验证SNP位点,筛选出的SNP用于下一步实验。结果: DNA测序分析发现XPGHis46His及XPGHis1104Asp两个SNP位点在细胞株中存在分布差异。结论:核苷酸切除修复系统中XPGHis46His及XPG His1104Asp遗传多态可能与卵巢癌患者对铂类药物耐药性相关。XPG遗传多态与卵巢癌患者铂类药物敏感性关系目的:研究核苷酸切除修复基因XPG单核苷酸多态性与卵巢癌患者对铂类药物敏感性的关系。方法:对接受含铂类药物化疗的102例晚期卵巢癌患者进行临床疗效评价。以聚合酶链-限制性片段长度多态性( PCR- RFLP)的方法检测接受含铂类药物化疗的102例卵巢癌患者XPGHis46His及XPG His1104Asp的多态基因型,并比较不同基因型与化疗敏感性的关系。结果: His1104Asp多态在卵巢癌铂类药物化疗敏感组中分布与耐药组差异不显着。XPGHis46His在化疗敏感组T/T,T/C,C/C的基因型频率明显高于耐药组,二者差异有统计学意义(p=0.016),与携带XPG46T/T基因型比较,携带至少一个46C等位基因(即T/C和C/C基因型)的卵巢癌患者对铂类药物化疗敏感可能性增加3.096倍(95%CI:1.330-7.208)。XPG His46His及His1104Asp基因多态与临床病理特征之间的比较差异无显着意义(P>0.05)。T/T基因型组生存期短于T/C+C/C基因型组,差异有统计学意义(P<0.05);COX风险比例回归模型结果显示病理分级是卵巢癌患者的独立预后因素(P<0.05)。结论:核苷酸切除修复系统中XPGHis46His遗传多态可能与卵巢癌患者对铂类药物敏感性相关。RNAi阻断XPG基因表达对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药性影响的体外实验研究目的:通过构建人XPG基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌SKOV3耐DDP细胞,检测其对XPG基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,以了解XPG在卵巢癌耐药细胞株中的作用。方法:针对XPG mRNA的不同区域构建了不同的siRNA载体,应用脂质体法转染SKOV3耐DDP细胞,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的siRNA构建shRNA表达载体,转染SKOV3耐DDP细胞,G418筛选后经western-blot鉴定确认获得稳定转染的SKOV3耐DDP细胞株,然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、细胞药敏试验及细胞内药物浓度的实验。结果:用荧光定量PCR对不同siRNA干扰载体的干扰效果进行检测,实验结果显示:在XPG-733组XPG的相对拷贝数为1.050±0.0230,与对照组相比有统计学意义,抑制率为52.05%。构建shRNA表达载体转染SKOV3耐DDP细胞,获得的该组稳定干扰表达株,western-blot检验其XPG蛋白表达明显减少。流式细胞仪对细胞检测结果显示实验组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为34%,G1期为66%,阴性对照组则相应为41.3%和58.7 %,其处于增殖周期的细胞有减少的趋势。实验组与阴性对照组的IC50差别有均统计学意义(P<0.05),经化疗药处理后,用高效液相色谱仪检测其细胞内药物浓度,实验组细胞内药物浓度低于对照组细胞(P<0.05)。结论:采用构建shRNA表达载体对XPG基因进行干扰,SKOV3耐DDP细胞的生长特性、细胞周期无明显变化。干扰后SKOV3耐DDP细胞对顺铂的化疗耐药性明显下降,我们推测这种改变可能与促进细胞对DNA-DDP加合物切除修复能力下降相关。
何大健[4]2012年在《端粒酶阴性小鼠肿瘤的诱导及其肿瘤细胞的分离培养》文中进行了进一步梳理肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一类(个)细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的非正常组织。肿瘤是当前世界范围内影响公众健康的主要疾病,其中人类25%的死亡源于肿瘤。据分析,有10～15%肿瘤通过不激活端粒酶而延长端粒的途径(alternative lengthening of telomeres,ALT)获得永生,并在肿瘤治疗压力下肿瘤细胞容易选择ALT途径逃离死亡。肿瘤干细胞是近年来研究肿瘤发生、发展和转移的热点,目前仅见从端粒酶阳性的肿瘤细胞系中分离出肿瘤干细胞,对于端粒酶阴性肿瘤中是否具有肿瘤干细胞,仍然存在较大的争议。其关键制约因素是没有遗传背景清楚、稳定的端粒酶阴性肿瘤细胞系,限制了探讨端粒酶阴性肿瘤干细胞存在与否,于是建立小鼠端粒酶阴性肿瘤细胞系就成为弄清这一科学问题的重要钥匙。本研究选取了mTR-/-p53-/-、mTR-/-p53+/-和mTR-/-p53+/+叁种基因敲除小鼠及野生型小鼠。mTR-/-p53-/小鼠进行自发成瘤,对野生型和mTR-/-p53+/和mTR-/-p53+/+基因型小鼠利用二甲基苯蒽(DMBA)通过灌肺、饲喂、表皮涂抹、腹腔注射、皮下注射的方法诱导其成瘤。通过两种培养法,即Cocktail法和组织块培养法分离培养肿瘤组织,经细胞单克隆形成率和在裸鼠体内成瘤能力证明其致瘤性。结果发现,(1)除了涂抹方法外,其他给药途径均可诱导小鼠成瘤；(2)野生型与mTR-/-p53+/基因型小鼠可在胸腺、脾脏、肝脏、肌肉、肠道部分被诱发出肿瘤,二者在成瘤的类型、成瘤时间上没有明显差异,但mTR-/-p53+/+小鼠未见成瘤；(3)mTR-/-p53-/自发成瘤的比率为20%,其与诱导的成瘤性差异不明显；(4)培养mTR-/-p53+/基因型小鼠诱导肉瘤组织获得贴壁肿瘤细胞系NS-12-Al和TS-12-B2。这两种肿瘤细胞的单克隆形成率分别为13.3%和20%；(5)NS-12-Al和TS-12-B2两株肿瘤细胞系注射入裸鼠皮下验证了其致瘤能力,且证实其移植瘤亦为端粒酶阴性。本论文研究中首次通过药物诱导方法成功获得端粒酶阴性小鼠肿瘤,并培养出端粒酶阴性肿瘤组织细胞系,裸鼠体内成瘤证明其强致瘤性,为下一步研究端粒酶阴性肿瘤干细胞及其特性奠定了重要基础。
赵洪波[5]2010年在《子宫内膜相关芯片的通路富集分析及其在猪繁殖机理研究中的应用》文中研究表明繁殖性能对于养猪业而言,直接关乎生产成本,进而影响经济效益,意义重大。很多因素都会影响到猪繁殖性能。其中子宫内膜作为雌性生殖器官的一部分,是维持生理特征和生育功能的重要器官。子宫内膜具有高度增殖活性,然而它又极易受流产、感染、内分泌等多种因素的影响,导致子宫内膜的再生能力下降,容受性降低,严重影响繁殖力。基因芯片是后基因组学时代基因功能分析的重要技术之一,已广泛地应用于人类疾病和模式生物复杂性状遗传机制的研究。由于基因芯片的成本高,微阵列的制备、样品的准备与标记比较繁琐,分析系统价格昂贵,信号的假阳性率高等,使得该技术的普及与推广存在一定的难度。而且基因芯片的分析及注释需要较完备的基因组序列信息,使之在猪等家畜中的应用受到极大的限制,许多研究者只能应用低密度微阵列或跨物种基因芯片进行相关研究。在猪等农业动物的研究方面,虽然应用基因芯片已检测出许多与重要经济性状、疾病等相关的基因,但就这些基因在猪的生长发育过程和疾病发生发展中所担任的角色、相互作用机制仍未完全明确。因此对猪的遗传育种,可以从比较基因组学的角度出发,利用人及小鼠等模式生物的全基因组信息,对其进行服务。对子宫内膜相关疾病和异常的全基因组研究,在人及牛等其它物种上,积累了不少数据,而且注释信息完整。因此,我们可以通过对已有的人、牛相关芯片数据进行分析整合,再通过比较基因组学的方法进行同源基因比对,以期得到影响猪子宫内膜的关键通路和候选基因。为进一步研究影响猪繁殖性能的分子遗传机制和分子标记辅助选择育种奠定基础。本论文的研究工作主要包括以下内容:1.子宫内膜异位症芯片数据的通路富集分析及整合首先将从公共数据库中收集到的相关数据,采用统一的预处理方法进行处理,然后应用基因集富集分析方法对子宫内膜异位症相关的微阵列数据进行分析,最后对每套的结果进行整合分析。结果表明,在卵巢型的3套数据集中,发现17个共同上调的通路和23个共同下调的通路。在腹膜型的2套数据中,有26个上调通路是一致的,有1个下调通路是一致的。比较这两种类型的分析结果,发现有13个相同的上调通路和1个相同的下调通路。这些通路主要与免疫疾病和免疫系统相关。对子宫周期的数据分析结果表明,分泌早期有12个显着上调通路和18个显着下调通路,分泌中期没有显着上调通路,只有29个显着下调通路。对3个时期得到的通路进行比较,发现彼此之间交集很少。对以子宫内膜内皮细胞为样本的数据进行基因集富集分析,得到46个显着上调通路和1个显着下调通路。将其与以上结果比较,得到2个共同通路。通过GSEA方法得到的上述结果更容易解释也更可靠,提高了微阵列实验结果的可重复性,为后续实验验证指出了方向,并为在分子水平上研究猪繁殖机理提供了参考通路和基因。2.能量负平衡对子宫内膜相关通路及基因的影响研究日粮能量水平对母猪子宫内膜的影响,对于合理饲养育成期母猪以及提高繁殖率和经济效益,都具有重要的意义。本研究利用GEO数据库中奶牛能量负平衡的微阵列表达数据,采用基因集富集分析的方法,筛选能量负平衡时,子宫内膜显着差异表达的相关通路和基因,。分析得到23个显着上调通路和26个显着下调通路。上调通路中,大部分是免疫系统和免疫性疾病相关通路。其中,Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路等7个通路是免疫系统相关通路,而原发性免疫缺陷、自身免疫性甲状腺疾病等5个通路与免疫性疾病相关。显着下调的通路中,主要是代谢相关通路、氧化磷酸化通路和细胞周期通路等。免疫性疾病相关通路,神经退行性疾病相关通路和生物合成相关通路最多。分别将这叁类通路包括的基因进行比较,得到了相关的叁个核心基因列表。与免疫性疾病相关的核心基因是BOLA,BOLA-DMA,BOLA-DMB,BOLA-DQA1,BOLA-DQA2,BOLA-DQA5, BOLA-DQB,BOLA-DRA,BOLA-DRB3,CD80,CD86,FAS,GZMB,LOC512672,LOC525727和PRF1;与神经退行性疾病相关的基因列表为ATP5F1,ATP5G1,ATP5G3,COX7A2,CYC1,NDUFA5,NDUFB2,NDUFB5,NDUFB7,NDUFC1,NDUFS6,NDUFS8,NDUFV1和UQCRB;与生物合成相关通路相关的核心基因列表为ALDOC,CS,DLD,IDH1,MDH2,PDHA1,PFKM,和PKM2。3.影响猪子宫内膜的候选通路及基因筛选通过分析疾病和能量对子宫内膜的影响,我们发现了很多共同的通路和基因。这些共同的通路可以作为研究猪子宫内膜的候选通路,而共同的基因,可以映射到猪的染色体上,作为影响猪子宫内膜的重要基因。我们将人卵巢型子宫内膜异位症芯片数据和能量负平衡数据的分析结果相比,发现相同的上调通路有12个和下调通路有10个。这22个通路可作为影响猪子宫内膜的候选通路,其中包含的同源基因是我们重点关注的基因。此外,PPAR信号通路仅在一套数据中不显着,也作为候选通路纳入结果中,共得到23个候选通路。对每个通路包括的基因进行提取,合并,去重复,共得到212个人Entrez基因。将这212个人的Entrez基因通过BioMart数据库,在猪染色体上寻找对应的同源基因,并对应到相应的染色体位置上。有比对结果的Entrez基因有168个,其中122个人Entrez基因对应140个猪Unigene同源基因,其它Entrez基因没有找到对应的猪unigene同源基因,但得到了相应同源基因在猪染色体上对应的起始位置。4.猪胚胎和子宫内膜发育相关内参基因的筛选胚胎发育到胎膜与子宫内膜附着是一个渐进的过程。人们对这一过程进行了很多研究,实时定量PCR因其快速可靠的特点已经成为分析基因转录水平的常用手段,通常使用看家基因进行相对定量。然而很多看家基因随着环境的改变其表达也会发生变化。而微阵列芯片数据包含了整个基因组的信息,可以供我们筛选在特定组织中稳定表达的基因,将其作为内参基因进行相对定量。我们应用元分析方法整合多套关于猪胚胎和子宫内膜发育的芯片数据,初步筛选出表达稳定的前100个候选内参基因,大部分为编码核糖体蛋白的基因。综上所述,本文通过对人和牛相关芯片数据的分析,发现在疾病和能量差异情况下,在子宫内膜显着差异表达的相关通路和基因,并采用比较基因组学的方法,将所发现的相同通路和基因,映射到猪染色体上,并对应得到猪的同源基因。这些通路和基因可作为影响猪子宫内膜的候选通路和基因,不仅可以对现有繁殖相关基因有更深入的了解,还有助于发现新的与繁殖性状相关的重要候选基因,为母猪繁殖性状标记辅助选择(MAS)和标记辅助导入(MAI)提供新的依据。最后,利用GEO数据库中与猪胚胎发育和子宫内膜相关的芯片,采用元分析方法,为RT-PCR的的准确使用提供候选内参基因。
丁秀艳[6]2012年在《RecQ解旋酶的动力学机理研究》文中进行了进一步梳理RecQ家族解旋酶属于SF2解旋酶超家族，对基因组稳定性的维持起着非常重要的作用。Bloom综合症、Werner综合症和Rothmund-Thomson综合症分别是由人类RecQ解旋酶3个成员BLM、WRN和RecQ4的功能缺失导致的，表现为多种严重的癌症症状。RecQ解旋酶解旋机制的大量研究，将为RecQ解旋酶作为抗癌药物靶的研究提供全新的思路。RecQ5解旋酶是人类5种RecQ家族解旋酶中的一员，人体细胞内RecQ5至少存在3种异构体RecQ5α、RecQ5β和RecQ5γ。RecQ5β全长包含991个氨基酸，包括解旋酶结构域和一个RQC结构域，还含有一个较长的与其它RecQ解旋酶没有同源性的C-末端区域。RecQ5β不仅能够解旋双链DNA结构，而且具有介导两条互补单链DNA分子退火的活性。尽管人们对解旋酶的研究已经比较广泛，但是目前RecQ5的生化特性及其在生物体内的功能仍不清楚。BLM全长1417个氨基酸，在溶液中能够以多聚体的结构存在，但是其解旋机制有待进一步研究。本研究对于深入了解RecQ家族解旋酶的作用机制，探索其生物学功能具有重要意义。本研究结合快速反应停流技术（stopped-flow method）和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的方法，系统的研究了RecQ5β的DNA退火和解旋动力学特性以及BLM的解旋活性。主要取得以下结果：1．在空状态和0.1mM磷酸核苷因子ADP、ATPγS和AMPPNP存在四种状态下，分析了随RecQ5β解旋酶浓度变化的RecQ5β对2nM两条互补的45-nt单链DNA底物的退火动力学过程。并对所有的退火动力学曲线进行双指数或叁指数拟和，得到在四种状态下随RecQ5β浓度变化的退火初始速率。结果表明：（1）RecQ5β在四种状态下催化的退火反应在10~20nM之间都有一个最适解旋酶浓度。（2）在四种状态下的最大初始退火速率基本相同。这与以前的研究结果不同。以前的研究认为，ATPγS和ADP能够完全或者部分抑制RecQ5β的退火活性。（3）在空状态和有磷酸核苷因子ATPγS存在状态下，RecQ5β催化的退火效率有比较宽的浓度变化范围，而在磷酸核苷因子ADP存在状态下，RecQ5β催化的退火效率其浓度变化幅度比较小。另外，定义了一个RecQ5β能够催化高效的退火反应时的有效的RecQ5β解旋酶浓度范围，在空状态和有磷酸核苷因子AMPPNP、ATPγS和ADP存在四种状态下，这个浓度范围分别为：5.6-27.7nM、9.8-24.1nM、4.9-33.8nM和11.5-19.3nM。2．通过偏振荧光的测量，分析了空状态和在0.1mM磷酸核苷因子ADP、ATPγS和AMPPNP存在四种状态下，一定量的RecQ5β解旋酶依次连续滴定到8nM3’F20-nt单链DNA底物的稳态结合动力学过程。结果表明，在四种状态下，RecQ5β解旋酶浓度较低时，偏振值随着RecQ5β解旋酶浓度的升高而升高。随后，RecQ5β解旋酶浓度较高时，偏振值不再升高，达到饱和。由于偏振值的变化反应单链DNA底物被结合在其上的RecQ5β解旋酶分子覆盖的程度，所以在RecQ5β解旋酶浓度较低时，单链DNA底物仅部分被RecQ5β解旋酶所覆盖；而RecQ5β解旋酶浓度较高时，RecQ5β解旋酶几乎完全覆盖单链DNA底物。并且，结合前面退火动力学分析中给出的有效的RecQ5β解旋酶浓度范围，在四种状态下，RecQ5β能够催化高效的退火反应时，RecQ5β解旋酶覆盖单链DNA底物的程度分别为：39.4%22.8%（空状态）、37.3%14.0%（AMPPNP）、37.8%26.3%（ATP S）和49.1%9.9%（ADP）。因此，RecQ5β解旋酶覆盖单链DNA底物大约40%-50%时，RecQ5β解旋酶能够催化高效的退火反应，而无论磷酸核苷因子存在与否。3．通过测量偏振荧光的方法，分析了（空状态和在0.1mM磷酸核苷因子ADP、ATPγS和AMPPNP存在四种状态下）在不同磷酸核苷因子存在状态下，100nM RecQ5β从10nM3’F20-nt单链DNA底物上的解离动力学过程。在空状态和AMPPNP与ATPγS存在叁种状态下，RecQ5β从3’F20-nt单链DNA底物上解离的过程相似，都由一个快过程和一个慢过程两个过程组成。在ADP存在状态下，RecQ5β从3’F20-nt单链DNA底物上解离的过程只有一个过程。对所有的解离动力学曲线进行单指数或双指数拟合，得到空状态和在AMPPNP和ATPγS存在叁种状态下的慢过程的解离速率和在ADP存在状态下的解离速率。结果表明，在ATPγS存在状态下，RecQ5β与ssDNA底物结合的最为紧密；而在ADP状态下，RecQ5β与ssDNA底物的结合最弱。空状态和在AMPPNP存在状态下，RecQ5β和ssDNA底物的亲和力相似。4．采用非互补的F和H标记的ssDNA底物进行退火动力学的分析。发现空状态和在ATP S存在状态下，荧光信号的变化较以互补ssDNA为底物的反应显着减小。充分说明在本研究中荧光信号的变化不是由于在RecQ5的作用下一些ssDNA分子的简单聚集，而是由于dsDNA的形成而造成的。结果表明本研究方法能够真实的反映RecQ5催化的ssDNA退火的动力学特性。5．采用另一种反应缓冲液体系：20mM Tris-acetate，pH7.9，50mM KOAc，10mMMg(OAc)2，1mM DTT和50mg/ml BSA，分析RecQ5的退火动力学特性。发现ATP S能够抑制RecQ5催化的退火反应。结果表明本研究方法能够真实的反映ssDNA的退火过程。6．在空状态下，比较分析了RecQ5β的C-末端缺失解旋酶片段RecQ5β~(1-662)的随解旋酶浓度变化的退火动力学过程、稳态DNA结合动力学过程和解离动力学过程。退火动力学结果表明，RecQ5β~(1-662)的最大初始退火速率比RecQ5β解旋酶全长低很多，前者大约为3%s~(-1)，后者大约为30%s~(-1)，低大约一个数量级。同样，可以得到RecQ5β~(1-662)的有效的解旋酶浓度范围为4.6-16.3nM。由稳态DNA结合动力学分析可以得到，在空状态下，RecQ5β~(1-662)能够催化高效的退火反应时，RecQ5β~(1-662)覆盖单链DNA底物的程度为52.9%23.3%。这个结果表明，同RecQ5β解旋酶全长一样，当RecQ5β~(1-662)覆盖单链DNA底物大约一半时，RecQ5β~(1-662)能够催化高效的退火反应。该有趣的现象是否也存在于RecQ家族解旋酶的其它成员中，值得将来进一步研究。解离动力学结果表明，同RecQ5β解旋酶全长一样，在空状态下，RecQ5β~(1-662)从3’F20-nt单链DNA底物上解离的过程由一个快过程和一个慢过程两个过程组成。其中，慢过程的解离速率为0.450.04S-1，基本同RecQ5β解旋酶全长在空状态下慢过程的解离速率一样，为0.510.12s~(-1)。因此，尽管RecQ5β解旋酶全长与RecQ5β~(1-662)对单链DNA具有几乎相同的亲合性，但这两个解旋酶的退火效率却相差很大。表明RecQ5β的退火活性，并不仅仅简单的决定于其与单链DNA底物的结合能力，而由特定结构所决定的解旋酶的内在特性也是非常重要的决定因素。进一步阐明了RecQ5β的C-末端区域是其催化高效退火反应所必不可少的。7．选择RecQ5β~(1-467)和RecQ5β~(1-662)两个RecQ5β解旋酶片段，确定了RecQ5β解旋的单转换动力学实验条件：以2nM双链部分长度为16-bp、带有不同长度（10-50nt）3’-尾链的ss/dsDNA为底物，温度为37°C、蛋白诱捕试剂dT56的浓度为2μM、ATP的浓度为1.5mM、RecQ5β的浓度为100nM。另外，对于较长的解旋酶片段RecQ5β~(1-662)，DNA trap的浓度为2μM。8．在上述确定的单转换动力学实验条件下，通过对RecQ5β解旋酶N-末端叁个氨基酸片段：RecQ5β~(1-467)、RecQ5β~(1-567)和RecQ5β~(1-662)随不同3’-尾链长度DNA底物解旋动力学特性的研究和比较发现，该叁个RecQ5β解旋酶片段的解旋幅度和解旋速率随着DNA底物3’-尾链长度的增加而增加，RecQ5β~(1-467)的最高解旋幅度达到73.5%，RecQ5β~(1-567)可达57.6%，而RecQ5β~(1-662)则低于35.5%。即随着解旋酶氨基酸片段长度的增加，解旋酶的最高解旋幅度依次降低。在DNA底物的3’-尾链长度较短时，基本上只有一个慢解旋过程，随着3’-尾链长度的增加，快过程的解旋幅度显着增加，即RecQ5β对双链DNA底物的解旋依赖于3’-尾链长度。表明RecQ5β在对双链DNA进行解旋时具有协同性，这与以往E.coli RecQ的解旋特性截然不同，在SF2解旋酶超家族中是有趣的发现。9．RecQ5β解旋酶的N-末端467个氨基酸足够介导RecQ5β的解旋活性，多余的氨基酸序列会抑制其解旋活性，RecQ5β解旋酶自身存在一定的活性调节机制。N-末端467个氨基酸包含一个完整的解旋功能结构域，这为RecQ5功能域的划分提供了重要的理论依据。10．通过解离动力学分析，发现BLM持续解旋能力较低的原因在于，在ADP·Pi和ADP状态下BLM从DNA底物上解离的速率非常大，分别为3.9和4.8s~(-1)，因此很容易从核酸链上解离下来，从而不能持续高效的进行解旋。
戴楠[7]2013年在《双功能基因APE1与miRNAs相互调控介导骨肉瘤放疗敏感性的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景放疗是骨肉瘤治疗的重要手段之一。放疗抵抗是影响患者疗效和预后的关键因素。前期研究表明，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(APE1)具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，在骨肉瘤放疗抵抗中发挥核心调节作用，敲低APE1能显着增强骨肉瘤放疗敏感性。然而其介导骨肉瘤放疗敏感性的机制不清。MicroRNAs(miRNAs)能在转录后水平负性调节靶基因的表达，对肿瘤发生、细胞凋亡和应激反应具有重要的调控作用，为研究和发现APE1基因调控通路和相互作用蛋白，阐明APE1介导的骨肉瘤放疗敏感性的机制提供了新的研究方向。此外，miRNAs作为内源性的小分子，在调控肿瘤细胞放疗敏感性中具有明显的优势，为骨肉瘤的分子靶向治疗提供了新的策略。晚近的研究陆续报道了p53等肿瘤关键基因相互作用的miRNAs，但与APE1相互作用的miRNAs国内外鲜见报道。研究目的本研究旨在鉴定和研究APE1相互作用miRNAs及其在骨肉瘤放疗抵抗中的作用。研究方法1.通过生物信息学、miRNAs芯片和qRT-PCR筛选鉴定APE1-knockdown骨肉瘤细胞的miRNAs差异表达谱，分析其靶基因涉及的细胞生物学功能和信号通路。2.通过生物信息学、 EMSA、 RNAi和qRT-PCR实验初步验证APE1-转录因子-miRNAs的作用关系。3.利用生物信息学、双荧光素酶报告基因实验、AP位点切除实验及EMSA鉴定miRNAs对APE1的靶向调控作用，在细胞和动物水平验证miRNAs靶向抑制APE1对骨肉瘤细胞放疗后增殖和凋亡的影响。研究结果1. APE1-knockdown骨肉瘤细胞中有13个miRNAs显着变化，其中miR-451、miR-1290、miR-765、miR-483-5p、miR-513a-5p、miR-129-5p和miR-31上调，miR-29b、miR-197、let-7b、miR-324-5p、let-7i和miR-484下调，其靶基因分别涉及TGF-β、Wnt、MAPK和p53等细胞信号通路，与细胞生存、增殖、粘附和肿瘤发生有关。2.生物信息学分析提示，转录因子与miRNAs启动子区有结合位点； APE1-knockdown后可下调NF-κB的DNA结合活性，而抑制NF-κB可下调let-7b和let-7i的表达。3. miR-513a-5p和miR-765能与APE1mRNA3’UTR区结合抑制APE1蛋白表达；miR-513a-5p可抑制APE1的AP位点剪切活性和NF-κB、p53、AP-1的DNA结合活性；在细胞和动物水平给予X射线照射后，过表达miR-513a-5p可增加凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖和Bcl-2的表达。结论1. APE1能直接影响骨肉瘤细胞miRNAs的表达；生物信息学分析表明APE1通过调控miRNAs可能影响下游靶基因的表达，参与肿瘤发生、细胞生存、增殖、粘附等生物学过程和多个信号通路，与骨肉瘤的发生发展、侵袭转移密切相关。2.生物信息学分析表明APE1-转录因子-miRNAs具有相互作用；初步证实APE1通过调控NF-κB的DNA结合活性可能调控let-7b和let-7i的表达。3.首次证实APE1是miR-513a-5p和miR-765的靶基因，二者可靶向结合APE1mRNA3’UTR区抑制APE1蛋白表达。4. miR-513a-5p通过抑制APE1的DNA损伤修复和氧化还原双功能，抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，在细胞及动物水平均能增加骨肉瘤的放疗敏感性。
参考文献：
[1]. FEN-1基因功能及其在遗传不稳定形成中的作用研究[D]. 石斌山. 浙江大学. 2001
[2]. 基于数据挖掘技术的肺癌早期预警模型研究[D]. 王娜. 郑州大学. 2012
[3]. 核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性研究[D]. 吴飞翔. 广西医科大学. 2009
[4]. 端粒酶阴性小鼠肿瘤的诱导及其肿瘤细胞的分离培养[D]. 何大健. 昆明理工大学. 2012
[5]. 子宫内膜相关芯片的通路富集分析及其在猪繁殖机理研究中的应用[D]. 赵洪波. 上海交通大学. 2010
[6]. RecQ解旋酶的动力学机理研究[D]. 丁秀艳. 西北农林科技大学. 2012
[7]. 双功能基因APE1与miRNAs相互调控介导骨肉瘤放疗敏感性的机制研究[D]. 戴楠. 第叁军医大学. 2013