王培林[1]2007年在《乙型肝炎病毒基因组的垂直传递及其突变与表达》文中研究表明乙型肝炎(简称乙肝)是乙型肝炎病毒(HBV)感染所致,是一种难治性的严重危害人类健康的常见病与多发病,是与慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌发生关联的疾病。据统计,世界上约有3亿五千万人携带HBV,每年新增乙肝患者50万～100万,我国感染人数约占世界感染人数的50%。乙肝每年导致至少200万人死亡。然而,迄今乙肝尚无特异有效的临床治疗对策与措施,乙肝的发生率尚未显着降低。因此,HBV感染的传播方式受到研究者们的关注;乙肝经生殖细胞垂直传播的途径尚未得到证实,有关研究报道甚少。HBV是目前所知的最小的嗜肝病毒。HBV DNA长约3.2kb,构成HBV基因组,为部分双链环状病毒。HBV基因组共有4个开放阅读框架P、C、S和X区。本文报道了HBV基因组在男、女乙肝患者睾丸组织、卵巢组织中的基因复制、基因表达和基因突变,HBV基因组在乙肝患者父子、母子间垂直传递,HBV基因组小鼠卵细胞载体的构建和精细胞载体的构建与转HBV基因组小鼠的垂直传递。本研究从分子遗传学、细胞生物学和组织学等方面为HBV基因组经精细胞和卵细胞垂直传递提供了实验证据;乙肝患者的研究和动物实验证明,受到HBV感染的乙肝患者的生殖细胞能够把HBV基因组传递给其发病后出生子女。本文为乙肝垂直传播的理论提供了证据,为HBV感染的干预(如乙肝疫苗的应用等)提供了理论基础和依据。乙型肝炎患者父亲发病后出生子女本文首先研究分析了较大家系、样本的乙型肝炎患者父亲(HBF)、乙型肝炎患者父亲发病后出生子女(HBFa)和乙型肝炎患者父亲发病前出生子女(HBFb)各实验组血清游离型、外周血单核细胞(PBMC)整合型HBV基因组检测率和HBV感染率,发现HBF、HBFa组的3项指标显着高于HBFb组,HBF与HBFa组的3项指标呈一致性增高。说明HBFa组的HBV基因组有可能从HBF组获得。进一步分析了整合在HBF与HBFa基因组内的HBV基因组突变,发现HBF与HBFa父子之间具有完全一致的聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)单链泳动变位;所分析的的3个家系5个成员的HBF与HBFa的HBV基因组,有U5样序列区和非U5样序列区的3个位点的单核苷酸多态性(SNP)突变位点完全一致,HBF家系2301父子U5样序列区和非U5样序列区的10个位点的SNP突变位点完全一致。提示HBFa的所有HBV基因组的SNP都应是由整合有HBV基因组的HBF基因组通过精细胞传递所致。为了在产生精细胞的睾丸及附睾组织寻找到组织与细胞学证据,作者又研究了HBF的睾丸及附睾组织细胞内的HBV基因组,发现在HBF睾丸及附睾组织中存在大量的HBV基因组,主要分布在曲细精管的基底部。显然,为HBV基因组在父子之间的垂直传递提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组父子间垂直传递的研究为首次报道。第二,首次大样本的研究了乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)均阳性乙肝患者母亲(HBM)孕妇的卵巢组织样本HBV基因组基因的表达,检测HBsAg在卵巢组织的分布与表达,发现HBsAg主要分布在卵巢组织的血管管壁及周围的间质细胞内,在卵巢皮质的卵泡细胞胞质中检测到HBsAg。说明在卵巢组织和卵泡细胞内存有HBV基因组,卵巢组织和卵泡细胞受到了HBV的感染。为母婴之间HBV基因组通过卵细胞的垂直传递提供了组织学与细胞学的证据。进一步分析了HBM卵巢组织与外周血、HBM新生儿脐带血存在的HBV基因组。发现在HBM卵泡组织中检测到HBV基因组,其检测率与HBM新生儿脐带血中HBV基因组的检测率呈一致性增高,显着高于对照组。说明HBM新生儿细胞内的HBV基因组可能是来自HBM,是通过卵细胞传递而来。因为HBM孕妇的卵巢组织样本HBV基因组的免疫组化研究结果已提供了组织学与细胞学的基础。同时,本文进一步研究了HBM卵巢石蜡组织切片组织细胞内的HBV基因组与分布,发现在HBM卵巢组织中检测到HBV基因组,分别分布在卵巢皮质的卵泡细胞,髓质的血管管壁以及血管周围间质细胞中。说明HBV感染了卵巢组织,在卵巢组织和卵泡细胞中存在HBV基因组。又进一步为母婴间通过卵细胞垂直传递HBV基因组提供了组织学和细胞学的证据。本文关于HBV基因组母子间垂直传递的研究为首次报道。第叁,应用人的生殖细胞进一步研究HBV基因组的垂直传递,涉及伦理学的问题,显然是不可能的。我们应用阳离子脂质体-质粒pBR322-HBV DNA共转染小鼠卵细胞,证明HBV基因组可以通过脂质体转染进入小鼠卵细胞,卵细胞可以作为HBV基因组的载体;为培育证明HBV基因组可以经卵细胞垂直传递子代的动物模型提供了前提条件。第四,运用精子载体共培养和体内转染法共转染小鼠精细胞,发现小鼠精子有一定俘获外源HBV基因组的能力,并发现HBV基因组在小鼠精细胞的分布。作者应用精子载体法建立了HBV基因组经精细胞垂直传播的转HBV基因组小鼠模型。为HBV基因组经生殖细胞垂直传递提供了实验证据。为HBV感染的垂直传播提供了实验证据。HBV基因组垂直传递的研究有助于探讨、阐明HBV感染传播的机制与途径。除在乙肝传播的理论上有所突破之外,还将为HBV感染的临床预防提供理论依据和基础;这在降低乙肝发生率、提高人口素质、优生优育等方面都有重要的临床意义。
张伟[2]2002年在《血清中乙型肝炎病毒RNA的定量分析》文中指出乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染，是引发肝硬变(liver cirrhosis，LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主要原因。因此，对HBV感染进行及时、正确的诊断和科学、有效的治疗是预防HCC发生的关键。传统的诊断HBV感染的方法，主要是应用血清或肝组织标本，检测HBV基因产物和DNA。由于缺乏RNA指标，它们不能直观地反映患者肝内HBV基因表达的真实状态，因而不能很好地指导临床的诊断和治疗。最新研究表明，有可能通过对血液中循环RNA的分析而构建基因表达的理论模式。从血清中检测HBV RNA的方法已经被建立，并确立了两个新的HBV血清学标志物，即全长的病毒RNA(Full-lenth RNA，fRNA)和顿挫型RNA(Truncated RNA，trRNA)，fRNA与病毒复制标志物HBeAg和HBV DNA的存在成正相关；而trRNA则与HBeAg和HBV DNA的存在无关。上述血清学检测结果能很好地反映肝组织内病毒转录体存在的状态。这不仅证明了血清中HBV RNA的存在，而且提供了研究循环HBV RNA的常规PCR检测方法。但若要精确地观察患者体内的HBV在不同复制时期的连续变化过程，以及药物干预后的变化情况，则需要对HBV RNA的拷贝数进行定量分析。 为了实现对HBV RNA的定量检测，我们在前人研究的基础上，采用竞争性PCR，建立了一套检测血清中HBV核酸的定量分析系统。本方法不仅实现了对fRNA和trRNA这两个重要的RNA指标的定量检测，而且还建立了对应于病毒基因复制早、中、晚期，分别位于HBVX、Core和X-PreCore等不同基因片段的DNA／RNA定量分析系统，为研究血清中HBV核酸的动态变化提供了新的手段。 通过对4例经lamivudine干预治疗的HBV感染患者血清HBV DNA和RNA的分析，反映出此定量分析系统具有较好的敏感性、准确性和稳定性。Lamivudine是一种目前广泛应用的抗病毒药物，它可同时抑制反转录酶和DNA依赖性DNA聚合酶的活性，从而同时阻断HBV负链和正链DNA的合成。这一研究采用经lamivudine干预治疗14周期间不同时间点的血清，检测了分别位于X区、Core和X-PreCore区域，在病毒基因复制过程中反转录的目标片段。治疗前这叁个片段的DNA拷贝数相同，均为10~9／ml。象我们预期的那样，治疗后DNA的拷贝数出现了明显下降。但是，这叁个片段下降的幅度明显不同，X区的DNA拷贝数始终处于较高水平。这提示含有基因复制早期阶段合成的 第四军医大学硕土学位论文 DNA片段的病毒颗粒始终以较高的水平产生和释放。与上述叁种DNA片段相对应，X 区 RNA的拷贝数始终保持在 10’／ml水平，比 X区 DNA低 10fym。而 Core和互．PreCore 区的RNA拷贝数则明显低于XRNA的水平。而且，自治疗的第6周起，X和Core区的 DNA与相应的RNA拷贝数在同一水平持续。采用针对位于X基因下游和其中的P。…人） 位点的锚定的 OligofdDS；物，检测到 HBV POlyta）RNA（flthA nd tttNA）的拷贝数在 大部分时间稳定于 10’／ml，只在治疗的后小幅下降下阵至 10fyml。X区RNA的拷贝数明 显高于iNA这一事实提示，在基因复制过程中基因组RNA的POlyta）尾被去除。 对检测结果的分析得出如下结论：血清中 HBV POly（）RNA，即 i：NA和 tttNfA， 可作为病毒基因常规表达的标志物，而药物干预所致的病毒复制中间体，可作为观察抗 病毒药物作用模式的直观指标，并用于监控临床治疗过程。
刘楚华, 陈小苹, 郭良业[3]2004年在《离退休人员HBV和HCV感染流行病学调查》文中进行了进一步梳理目的 了解离退休人员中乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)的感染现状 ,以利于做好离退休人员传染病的预防保健工作。方法 对 5 95 0例离退休人员血清进行检测 ,分老年组和中年组。采用ELISA法检测HBV和HCV标志物。HBsAg和抗HCV阳性者再进一步用PCR法检测HBV -DNA和HCV -RNA。结果 5 95 0例离退休人员中 ,检出HBsAg +HBeAg +抗 -HBc阳性 2 13例 ,占 3 5 8% ,HBsAg +抗HBe +抗HBc阳性 6 35例 ,占 10 6 7%。在抗 -HCV检测中 34例阳性 ,占 0 5 7% ,其中有 1例乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒重迭感染。中年组与老年组HBV阳性率比较差异有显着性。结论 离退休人员中乙型肝炎携带率为 14 2 5 % ,中年组高于老年组 ,提示中老年人群中乙型肝炎病毒感染率高于普通人群。
丁向春[4]2013年在《1、HBV相关原发性肝癌生物标志物的筛选及G6PD在HBV复制中机制的初步研究 2、血清血小板衍生生长因子（PDGF-BB）与慢性乙型肝炎（CHB）临床相关因素的研究》文中认为目的：(1)利用iTRAQ技术，对HBV感染相关HCC患者的蛋白质组学的改变，进行鉴定和定量分析，旨在获得HBV感染相关HCC患者的肝组织内差异蛋白质组的“全组信息”，筛选出与HBV感染相关HCC发生、发展有关的分子标志物，并进一步应用Realtime PCR和Western blot从基因和蛋白表达水平进行验证。以期通过此研究，为进一步揭示HBV感染相关HCC的发病机制，寻找有意义的潜在HCC诊断标记物及药物治疗的靶点，提供新的线索和思路。(2)对从获得的差异性蛋白质组中筛选出与HBV感染相关的特异性HCC分子标志物G6PD，利用HBV复制细胞模型HepG2.2.15细胞采用siRNA基因敲除和pcDNA3.0基因真核表达质粒转染技术对其在HBV复制中的机制进行初步的探讨，旨在探讨G6PD在HBV复制中的机制及其作为抗HBV感染治疗的潜在靶点的应用价值。方法：(1)采用iTRAQ技术对HBV感染相关HCC的癌组织和癌旁组织进行定量质谱分析,筛选与HBV感染相关HCC的分子标志物,并对部分候选标志物蛋白采用Realtime PCR和Western从基因和蛋白表达水平进行进一步验证；(2)采用组织芯片技术对部分蛋白进行HBV阳性和阴性的肝癌癌旁组织表达的差异性验证；(3)利用HBV复制细胞模型HepG2.2.15细胞采用siRNA和pcDNA3.0基因真核表达质粒技术对筛选出的与HBV感染相关的特异性HCC分子标志物进行基因敲除和转染后,用Western blot分析检测HepG2.2.15细胞的候选标志物蛋白表达水平变化,并对候选标志物与HBV复制的相关性及其对Ⅰ型干扰素及下游5个干扰素诱导基因表达水平的影响作初步分析。结果：(1)采用iTRAQ联合质谱技术比较分析了9对HBV相关HCC患者癌组织和癌旁组织标本的蛋白差异表达谱，并从获得的1608个蛋白中筛选出了222个HCC癌组织与癌旁组织表达差异至少1.3倍的蛋白质，其中HSPB1，Villin-1，AKK1B10，APOE，UGDH，CSTB，G6PD，HIST2H2BF，HNRNPA1，GSN，NPM1，S100A6，TKT，VLL1，ADH4，ADH1B，ADH1C，CYP1A2，UGT2B4在癌组织的相对mRNA的表达量与癌旁组织相比HSPB1，Villin-1，AKK1B10，APOE，UGDH，CSTB，G6PD，HIST2H2BF，HNRNPA1，GSN，NPM1，S100A6，TKT，VLL1表达上调,而ADH4，ADH1B，ADH1C，CYP1A2，UGT2B4表达下调；Western blot验证显示：癌组织中的G6PD, HSP27，APOE，S100A11, Villin-1表达与癌旁组织相比显着上调，而ADH1B表达显着下调。Western blot和Realtime PCR在蛋白和mRNA水平的进一步检测验证的结果与iTRAQ联合质谱技术初步筛选结果吻合。随后采用组织芯片技术对G6PD蛋白进行HBV阳性和阴性的HCC癌旁正常组织表达的差异性验证，检测发现G6PD在HBV阳性的癌旁组织中的表达显着高于HBV阴性的HCC癌和癌旁组织，且与AFP水平无关。（2）利用HBV复制细胞模型HepG2.2.15细胞，采用siRNA和pcDNA3.0-G6PD基因真核表达质粒技术进行基因敲除和转染后,用Western blot方法检测分析HepG2.2.15细胞的候选标志物蛋白表达水平变化,并对G6PD与HBV病毒复制的相关性及其对Ⅰ型干扰素及下游5个干扰素诱导基因表达水平的影响做了进一步分析，发现G6PD是一个内源性的促进HBV病毒复制的因子，并可影响宿主细胞内的Ⅰ型干扰素及下游5个干扰素诱导基因的表达水平。结论：（1）iTRAQ技术是一种功能强大的、性能可靠的筛选HCC潜在分子标志物的研究工具；（2）在HBV感染相关HCC的发生、发展过程中参与的蛋白质组极其复杂；（3）基因和蛋白水平结果显示G6PD在HBV阳性的HCC癌组织中的表达显着高于HCC癌旁组织，且与AFP水平无关，同时组织芯片检测显示明确的HBV感染相关性，表明G6PD不但可作为一种新的潜在的特异的诊断HBV感染相关HCC的生物标志物，而且表明G6PD还可能参与了HBV复制过程；（4）siRNA和pcDNA3.0-G6PD基因敲除和转染证实G6PD确实参与了HBV复制的调控，并可能是一个内源性的促进HBV病毒复制的因子；（5）G6PD可能是通过参与调控影响宿主细胞内的干扰素刺激基因途径而影响HBV病毒复制的，其机制仍需进一步研究；（6）siRNA抑制G6PD基因表达可能会成为一种新型抗HBV药物的潜在生物靶向治疗的方法。目的：探讨血清血小板衍生生长因子BB （PDGF-BB）水平与慢性乙型肝炎（CHB）患者年龄、性别、病史、血清HBVDNA水平、肝功能指标、血清肝纤维化指标（HA、CⅣ、PCⅢ、LN）和HBeAg状况的相关性。方法：将740例CHB患者血清PDGF-BB水平与CHB患者的年龄、性别、病史、血清HBVDNA水平、肝功能、血清肝纤维化指标（HA、CⅣ、PCⅢ、LN）进行相关性分析，并分析肝功能分级与血清PDGF-BB水平、HBVDNA水平及肝纤维化指标的相关性，同时对HBeAg阴性和HBeAg阳性CH病人的血清PDGF-BB水平和血清肝纤维化指标（LN、HA、PCⅢ、CⅣ）进行对比分析。结果：①CHB患者血清PDGF-BB水平与其年龄、性别、病史、HBVDNA水平无显着相关性（P>0.05）；与肝功能指标和血清HA、PCⅢ、CⅣ、LN显着相关（P <0.01）；②肝功能分级与血清PDGF-BB水平、肝纤维化指标HA、 PCⅢ、CⅣ、LN水平均呈正相关（P<0.01）；③血清PDGF-BB水平与肝纤维化指标HA、 PCⅢ、CⅣ、LN水平均呈正相关（P<0.01）；④H BeAg阴性CHB患者血清PDGF-BB水平与HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平均高于HBeAg阳性CHB患者（P<0.05）。结论：CHB患者血清PDGF-BB水平与肝脏炎症活动程度、血清肝纤维化指标和HBeAg状态有显着相关性，提示PDGF-BB具有评估CHB肝功能和肝纤维化程度的临床应用价值，并揭示了HBV病毒可能通过影响PDGF-BB水平参与CHB相关肝纤维化的进程。
孙珍[5]2014年在《宁夏地区HBV基因分型、耐药突变及HLA-DRB1基因多态性与乙型肝炎进展的相关性研究》文中研究说明目的调查宁夏地区慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者的ALT、HBV-DNA载量与血清标志物水平之间的关联性，探讨HBV基因型、核苷（酸）类似物（nucleostide analogues，NAs）耐药突变模式与HBV感染后慢性化、重症化的关系，研究HLA-DRB1基因多态性与乙肝相关性疾病的关系。方法随机选取CHB患者283例，应用化学发光微粒子免疫分析法定量检测HBV血清学标志物和荧光定量PCR检测HBV-DNA载量，并对结果进行相关性分析。从中选取134例住院患者的血清标本应用基因型特异性多对引物巢式PCR法进行HBV基因分型，再使用直接测序法对分型结果进行验证并检测HBV的耐药突变，并针对不同的基因型进行性别、年龄、肝功能、HBV-DNA载量及HBeAg水平的相关性分析，以及对不同耐药突变模式CHB患者之间的临床参数进行分析比较。另选取87例CHB患者、78例肝硬化患者、31例肝癌患者和50例健康对照者作为研究对象，采用序列特异性引物-聚合酶链式反应（polymerase chain reaction-sequence specificprimers PCR-SSP）方法对他们的HLA-DRB1等位点进行基因分析研究。结果（1）HBeAg阳性患者较阴性患者的HBeAb水平和HBV-DNA载量均有显着性差异（P<0.001，P<0.001）；女性的HBeAg和HBeAb水平均较男性高（P<0.05，P<0.01）；30-50岁组的CHB患者的HBV-DNA、HBeAg、HBeAb与<30岁组、30-50岁组比较有显着性差异（P<0.01，P<0.001，P<0.01）；CHB患者中HBV DNA载量与HBeAg呈正相关（r=0.451，P<0.001），与HBeAb呈正相关（r=0.434，P<0.001)；ALT与HBsAg呈正相关（r=0.131，P<0.05）。（2）134例HBV感染者的血清标本中，B基因型11例（8.2%），其中男10例，女1例；C基因型123例（91.8%），男87例，女36例。B型和C型之间的HBV-DNA和ALT水平有显着差异（Z=3.23，P<0.05；Z=0.19，P<0.05）。全部标本中有28例发生不同位点变异，变异率为20.9%，以单位点rtS213T突变为主，约占25.0%。（3）与健康对照组相比，乙肝后肝硬化患者的DRB1*07、DRB1*12等位基因表达频率明显高于健康对照组，差异显着（P<0.05，OR=2.237，95%CI为1.689～2.961；P<0.05，OR=2.317，95%CI为1.707～3.143）；汉族乙肝相关性疾病患者的DRB1*04、DRB1*13、DRB1*15等位基因表达频率与汉族健康对照者的差异显着（P<0.05，OR=0.478，95%CI为0.367～0.623；P<0.05，OR=0.462，95%CI为0.355～0.602；P<0.05，OR=2.292，95%为1.599～3.283）。结论（1）宁夏地区的慢性乙型肝炎患者的HBV-DNA载量与HBeAg呈正相关，两者之间具有良好的一致性；但ALT水平与HBsAg水平呈正相关；女性患者的HBeAg浓度较男性高，其余指标无显着性差异。慢性乙型肝炎患者以30-50岁年龄阶段的居多，且此组患者的HBV-DNA、HBeAg、HBeAb与其余年龄段组比较有显着性差异。（2）宁夏地区慢性乙型肝炎患者的基因型包括B型、C型，其中以C基因型为主，其次为B基因型；HBV基因型与HBV-DNA、ALT水平有关联，和本研究中其他指标比较无显着差异；CHB患者主要对拉米夫定（LAM）与阿德福韦酯（ADV）耐药，出现以单位点rtS213T为主的突变，并出现了混合位点突变。（3）HLA-DRB1*07、DRB1*12可能是宁夏地区乙肝患者发生肝硬化的易感基因；HLA-DRBI*04和DRBI*l3可能是宁夏地区汉族人群的抗性基因；携带DRB1*15的汉族人群更容易发生乙肝相关性疾病。
赵伟[6]2004年在《病毒性肝炎基因芯片诊断技术研究和临床应用》文中认为基因芯片，又称微型DNA阵列(microarry)，是按特定的排列方式，将大量基因探针/基因片段固定在硅片、玻片和塑料片上，通过计算机处理，高效、大规模获取相关生物信息。目前，该技术已用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变、基因多态性分析、药物筛选和基因测序及疾病的诊断。 中国是肝炎大国，有近1.2亿乙肝病毒携带者，1500万丙型肝炎患者。目前，对于肝炎病毒的检测，主要是通过测定抗原、抗体(病毒蛋白质)来完成，在诊断上存在免疫滞后性。对肝炎病毒基因亚型分型和基因突变检测，多用核苷酸测序的方法，该方法试剂昂贵，操作复杂。 我们将基因芯片技术应用到肝炎病毒的诊断上，通过生物医学数据库(美国生物技术信息中心NCBI)对乙型和丙型肝炎病毒基因进行检索和筛选，应用分子生物学软件，进行序列分析、引物及探针设计，制成病毒性肝炎基因诊断芯片，并在临床实践中应用，可快速、敏感、经济地完成对病人血清及肝组织中肝炎病毒DNA、RNA的基因诊断、亚型分型和基因突变检测。目前已完成以下工作，并得出主要研究结论如下： 1．本科研通过生物信息方法从基因库中筛选出代表乙型、丙型病毒性肝炎的基因特征序列，按照检测目的，设计出不同的寡核苷酸探针阵列，用点样仪将探针固定在经过特殊处理的玻璃载片上，制成3种特殊的病毒性肝炎基因诊断芯片：①．乙型肝炎基因诊断芯片，可以检测乙肝病毒有无，对病毒进行基因分型。对用贺普丁治疗后的YMDD变异进行突变检测。②．丙型肝炎基因诊断芯片，设计20条特异性寡核苷酸探针阵列，可对丙型肝炎6个主要基因型1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、6a，10个亚型进行分型诊断。③．乙型、丙型肝炎双检基因芯片，可对乙型、丙型肝炎同时定性检测。 2．用研制的基因诊断芯片开展临床检测，对40列乙型肝炎病人血清中的HBVDNA，20例丙型肝炎血清中的RNA与健康人血清同时进行双盲检测，与检测乙肝病毒标志物金标准美国雅培试剂微粒子免疫发光定量测定的HBsAg、HBeAg及light cycle核酸定量仪检测的HBVDNA、HCVRNA进行对比，确定肝炎基因诊断芯片的准确性和假阳性、假阴性率。
李晓光[7]2008年在《B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究》文中认为研究目的:1.构建B和C基因型重组乙型肝炎病毒及检测其在Huh7细胞内的复制和表达。2.探讨B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞全基因组表达模式的影响是否相似。3.评价针对重组B和C基因型HBV S区目的小发夹RNAs(shRNAs)在存在错配的情况下对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用,对HBsAg mRNA水平的抑制作用,及对HBV DNA复制的抑制程度。研究方法:1.根据相关文献设计扩增HBV全基因组的引物,分别从感染B和C基因型的患者血清中提取HBV DNA作为模板,应用高保真热启动Taq DNA聚合酶扩增HBV全基因组;2.SacⅠ酶切扩增的全长HBV和pUC19,应用T4 DNA连接酶使HBV插入pUC19上的SacⅠ酶切位点,命名为pUC19-BHBV和pUC19-CHBV;3.应用SapⅠ酶切pUC19-HBV和pHY106真核表达载体,将获得的全长HBV在与线性的pHY106连接,使全长HBV插入pHY106的SapⅠ酶切位点,命名为pHY106-BHBV和pHY106-CHBV;4.将pHY106-BHBV和pHY106-CHBV分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照;①分别于转染后24h、48h和72h取细胞培养上清,-20℃冻存,用于ELISA检测HBsAg和HBeAg表达;②转染后72h,裂解细胞,提取细胞内HBV核心颗粒内HBV复制中间体,用于Southern blot检测;③转染后72h,用PBS洗细胞5次,裂解细胞,应用Real-time PCR定量检测Huh7细胞内HBV DNA水平。5.基因芯片技术:B或C基因型重组乙型肝炎病毒(即pHY106-BHBV,pHY106-CHBV)转染Huh7细胞,以pHY106空载体为对照,48h后提取细胞mRNA,逆转录为cDNA,与芯片杂交,用GenePix Pro3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度,计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio,Ratio=Cy5/Cy3;筛选出Ratio大于2或小于0.5的基因点,这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异;6.实时定量PCR:pHY106-BHBV,pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h,以pHY106空载体为对照,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,应用实时定量PCR对基因芯片差异表达的部分基因进行验证。7.将shRNAs分别和B或C基因型重组HBV,即pHY106-BHBV和pHY106-CHBV共转染HepG2细胞;于转染后24h、48h、72h、96h和120h分别取细胞培养上清,-20℃冻存,留作ELISA检测HBsAg和HBeAg表达水平;8.shRNAs分别和B或C基因型重组HBV转染HepG2细胞72h后,应用Trizol法提总RNA,逆转录为cDNA,进行RT-PCR,对HBsAg mRNA水平进行半定量检测;于转染后72h,裂解细胞,提取HBV核心颗粒内的HBV复制中间体进行Southernblot实验。结果:1.成功构建了pHY106-BHBV和pHY106-CHBV两个表达载体;2.pHY106-BHBV和pHY106-CHBV转到Huh7细胞后,检测到了HBsAg和HBeAg的表达,HBsAg表达于48h达高峰,HBeAg的表达高峰晚于HBsAg约24h;3.应用Southem blot检测到了细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括rcDNA,dsDNA和ssDNA;4.应用Real-time PCR定量检测发现转染到Huh7细胞内的pHY106-BHBV和pHY106-CHBV HBV DNA拷贝数高,于72h达高峰,可达8log_(10);5.pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,从4097个基因中筛选出差异表达基因共60条,其中1条基因表达明显增强,59条基因表达降低明显;6.pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,筛选出差异表达基因共122条,其中34条基因表达明显增强,88条基因表达降低明显;7.实时定量PCR验证上述芯片结果,证实pHY106-BHBV转染Huh7细胞48h后,IFNGR2、GPR125、DDEF2和PI3K mRNA表达水平均不同程度下调,相对表达率分别为0.8、0.5、0.3和0.4,与基因芯片结果基本一致;pHY106-CHBV转染Huh7细胞48h后,EEF2、INF592表达下调,相对表达率分别为0.8和0.6,与基因芯片结果符合。8.shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAg和HBeAg表达具有很强抑制作用,转染后48h显现明显的抑制作用,于72h抑制作用达高峰,对HBsAg和HBeAg表达抑制水平分别可达到80%和50%左右;9.shRNA共转染72h,shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV HBsAgmRNA具有明显的抑制作用,抑制水平在60%～70%左右;10.Southern blot结果发现shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBV的复制具有明显的抑制作用。结论:1.本研究构建成的HBV真核重组表达载体pHY106-BHBV和pHY106-CHBV能够在Huh7细胞内复制和表达HBsAg和HBeAg,适合用于B和C基因型HBV的致病机制、病毒与机体的相互作用、新药开发等方面的研究工作。2.B和C基因型乙型肝炎病毒均能对Huh7细胞表达谱产生明显的改变,B和C基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞表达谱的改变明显不同,仅发现DDEF2在两者均下调,这表明B和C基因型乙型肝炎病毒对机体的影响可能存在不同的方式。3.shRNA·458和shRNA·635是良好的抑制B和C基因型HBV的有效工具;一定范围的错配仍然能够发挥shRNA的抑制HBV的作用。
马艳丽[8]2006年在《慢性乙型肝炎肝内cccDNA定量测定的临床意义研究》文中指出【目的】 乙型肝炎病毒(HBV)感染的分子生物学研究表明，在HBV持续性感染、治疗停止后病情反跳以及耐药方面，共价闭合环状DNA(cccDNA)起着关键的作用。目前有关cccDNA的了解多来源于土拨鼠和鸭乙型肝炎病毒模型的研究，但从病人中收集的资料很少，国内还未有相关报道。 应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测慢性乙型肝炎(CHB)肝组织HBVcccDNA定量，研究肝组织HBVcccDNA定量与组织及血清HBV DNA定量、HBsAg滴度、肝实质损害程度及肝组织病理等的关系，以探讨cccDNA在CHB诊断和治疗中的重要临床价值。 【方法】 75例CHB患者均来自我院2004年1月～8月住院病人，男59例，女16例，年龄17～48岁，平均33岁。所有患者诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》，并排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致肝损害。所有病例院外半年内未行抗病毒治疗，根据HBeAg的情况，分为HBeAg阳性慢性乙型肝炎和HBeAg阴性慢性乙型肝炎两组，两组资料在年龄、性别、病程等方面均具有可比性。10例非乙肝患者包括：丙肝2例，自身免疫性肝炎1例，脂肪肝3例，酒精肝2例，不明原因肝损害2例作为对照。应用Roche light-cycler荧光PCR检测仪检测肝组织cccDNA、组织和血清HBV DNA的拷贝数、全自动生化分析仪检测肝功能(ALT等指标)、Roche全自动电化学发光免疫分析仪检测血清HBsAg滴度、肝组织进行炎症活动度分级(G)及纤维化程度分期(S)
刘建萍[9]2005年在《输血与乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染相关性的调查研究》文中研究表明为了能够及时、全面、详实地掌握人群中HBV、HCV 的流行情况和相关传播因素,通过问卷调查和病历查询等方式调查我院887 名即往住院患者的一般特征及HBV、HCV 感染情况,调查患者输血原因,调查乙肝、丙肝感染者输血史情况,输血次数与乙肝感染的相关关系,病毒可传播因素的危险度大小,不同科别HBV 感染检测情况,乙肝感染者的免疫标志物模式分析等多层面、多角度地探讨输血与乙肝、丙肝感染之间的相关性。从以上调查中得出:1 乙肝、丙肝病毒感染与输血之间呈正相关关系,即输血能够增加乙肝、丙肝感染的可能性;2 输血是乙肝、丙肝传播的重要途径,但不是乙、丙肝传播的唯一途径,;3 临床用血有少数不能按照相关规定执行;4 乙肝、丙肝感染的相关关系调查中发现随着输血次数的增加,乙肝感染率、丙肝感染率均有增加的趋势。5 对供血员应增加乙肝五项和HCV-RNA 的检测。
农志欢[10]2015年在《玉郎伞叶、根水提物对鸭慢性乙型肝炎治疗作用的研究》文中指出目的：建立鸭乙型肝炎慢性感染模型,研究玉郎伞根水提物和玉郎伞叶水提物对鸭慢性乙型肝炎的治疗作用。方法：采用1日龄广西麻鸭雏鸭,颈静脉接种0.2ml DHBV-DNA强阳性病毒血清。于接种后52天分别从颈静脉采血0.5ml。采用聚合酶链式反应(PCR)法检测筛选出阳性感染鸭,随机分为5组,每组8只。模型组(等容量双蒸水)；玉郎伞叶水提物高剂量组(20 g.kg-1)；玉郎伞叶水提物低剂量组(10 g.kg-1)；玉郎伞根水提物高剂量组(20g.kg-1)；玉郎伞根水提物低剂量组(10 g.kg-1)。其余未感染的作为正常对照组(等容量双蒸水)。各组动物在同样条件下饲养,于接种后60天开始,每天空腹i.g给药,连续给药150天。分别于用药前(TO)、用药30天(T30)、60天(T60)、90天(T90)、120天(T120)、150天(T150)、及停药后7天(P7)分别取血；最后一次取血后将所有动物用戊巴比妥钠麻醉,解剖取肝组织,作适当处理,用于相关指标的检测。(1)应用FQ-PCR法检测鸭血清DHBV-DNA含量；ELISA法检测鸭血清DHBsAg、DHBeAg含量；用全自动生化分析仪检测ALT和AST活性。(2)用相应试剂盒检测肝匀浆液上清中SOD、GSH-PX的活性以及MDA、GSH的含量；采用HE染色观察肝细胞病理变化。(3)提取肝组织DNA, FQ-PCR法检测各组DHBV-cccDNA的含量。(4) ELISA法检测血清Col-I、LN、HA的含量。试剂盒法检测肝组织中Hyp的含量。(5)提取肝组织总RNA, RT-PCR法测定Col-I和TIMP-2的mRNA表达情况。结果：(1)与模型组比较,AYLSL和AYLSR各个剂量组给药后均能降低鸭血清DHBsAg, DHBeAg和DHBV-DNA含量(P<0.05,P<0.01),降低ALT和AST活性(P<0.05,P<0.01)。停药7d后,均没有明显反跳现象(P>0.05)。(2)与模型组比较,AYLSL和AYLSR各个剂量组均能增加肝组织匀浆中SOD和GSH-Px活性以及GSH含量,降低MDA的含量(P<0.05,P<0.01)。能减轻肝细胞病理损伤(P<0.05,P<0.01)。(3)与模型组比较,AYLSLH和AYLSRH各个剂量组中肝组织DHBV-cccDNA含量均减少(P<0.05,P<0.01)。(4)与模型组比较,AYLSL和AYLSR各个剂量组给药后均能降低鸭血清Col-I.LN.HA的含量,降低肝组织Hyp的含量(P<0.05,P<0.01)。(5)与模型组比较,AYLSL和AYLSR各个剂量组均能下调肝组织Col-I mRNA表达；下调TIMP-2的mRNA表达情况(P<0.05,P<0.01)。结论：AYLSL和AYLSR对DHBV引起的慢性乙型肝炎有一定的治疗作用,能抑制肝脏病情的恶化。其机制可能是与抗病毒、抑制脂质过氧化,抑制肝纤维化形成等相关。
参考文献：
[1]. 乙型肝炎病毒基因组的垂直传递及其突变与表达[D]. 王培林. 中国海洋大学. 2007
[2]. 血清中乙型肝炎病毒RNA的定量分析[D]. 张伟. 第四军医大学. 2002
[3]. 离退休人员HBV和HCV感染流行病学调查[J]. 刘楚华, 陈小苹, 郭良业. 广东医学. 2004
[4]. 1、HBV相关原发性肝癌生物标志物的筛选及G6PD在HBV复制中机制的初步研究 2、血清血小板衍生生长因子（PDGF-BB）与慢性乙型肝炎（CHB）临床相关因素的研究[D]. 丁向春. 重庆医科大学. 2013
[5]. 宁夏地区HBV基因分型、耐药突变及HLA-DRB1基因多态性与乙型肝炎进展的相关性研究[D]. 孙珍. 宁夏医科大学. 2014
[6]. 病毒性肝炎基因芯片诊断技术研究和临床应用[D]. 赵伟. 南京农业大学. 2004
[7]. B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究[D]. 李晓光. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[8]. 慢性乙型肝炎肝内cccDNA定量测定的临床意义研究[D]. 马艳丽. 山东大学. 2006
[9]. 输血与乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染相关性的调查研究[D]. 刘建萍. 吉林大学. 2005
[10]. 玉郎伞叶、根水提物对鸭慢性乙型肝炎治疗作用的研究[D]. 农志欢. 广西医科大学. 2015
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