陈晶[1]2002年在《反义转化酶基因转入西瓜的研究》文中指出本实验以亲本西瓜品种“火洲一号”为材料，研究西瓜高频再生体系的构建，农杆菌转化过程中各种参数的确定，再生植株的筛选鉴定等问题。并以西瓜子叶为外植体通过农杆菌介导的遗传转化方法将反义甜瓜转化酶基因转入西瓜基因组中获得转基因再生植株，主要结果分析如下： 高频再生体系构建的成功是遗传转化成功的最基本的要求。它涉及两个方面：第一，种子的无菌萌发。它直接关系到再生芽的分化率。从经济、省时、高质的角度考虑，以37℃恒温水浴箱浸种3～4小时，0.1％HgCl_2消毒5分钟，无菌水冲洗4～5次，插入方式置于0.8％琼脂培养基的方法最好。它可使污染率和畸芽率降至零，出苗率最高达97％，2天左右时间种子全部萌发。第二，再生芽获得的多寡与外植体种类、离柄距、苗龄、培养温度、光照时间、摆放方式、激素浓度等因素关系密切。外植体以离柄距0～1mm处，苗龄4～5天颜色由黄色完全变为绿色的子叶为最好；培养温度、光照长度分别以24～28℃、16h为宜；摆放方式呈自然状态，向阳面朝上时分化率显着提高；BA是西瓜子叶再分化必需的物质，AgNO_3有效提高芽分化率，两激素浓度的最佳配比为MS+2.0mg／lBA+4.5mg／lAgNO_3。在以上八种适宜条件下，再生芽的分化率可高达92％。分化芽多为双子叶丛生芽，畸形芽极为少见；1～2月后分化芽可长到2～3厘米，并长出不定根。 农杆菌介导的遗传转化方法研究深入，技术方法成熟，使用广泛，是双子叶植物较为理想的转化方法。质粒pGA643大小约为11.6Kb，它以花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子，抗性标记分别为卡那霉素和四环素。目的基因片段invertase大小为41Obp，以反向插入的方式置于T-DNA左右边界间。本实验采用冻融法将表达载体pGA643—INV转入农杆菌LBA4404中，使用抗生素Str、Rif、Kan对阳性菌落进行筛选。阳性菌落PCR检测表明农杆菌LBA4404中有INV基因，从而获得农杆菌工程菌株。工程菌液对外植体的侵染过程中涉及多个参数。实验表明：预培养时间2～3天，污染率低，转化率有所提高；菌液浓度OD_(600)≈0.4，浸泡时间9分钟，晾干时间20分钟转化效果较好；共培养时间一般要长于16小时，以5天为宜；在以上几种条件下，子叶经侵染后再生芽的转化率可达到0.97％。再生芽均为双子叶丛生芽，生长良好，2～3个月再生芽长高1～2cm，有少许不定根出现。 再生植株的筛选我们使用卡那霉素(Kan)。用未经农杆菌侵染的子叶为材料对选择压进行确定。卡那霉素浓度(mg／l)分别取25，50，75，100，125五个浓度梯度。当 — —卡那霉素浓度为25，50lug／1时，多数子叶能产生愈伤组织，愈伤组织呈白色或白绿色，富有光泽；分化芽数目以卡那霉素浓度25my 时较多，无褐化现象产生；卡那霉素浓度升至 75mg八，愈伤组织形成时间推迟 3～4天，15～20天愈伤组织多褐化死亡无分化芽产生；卡那霉素浓度进一步提高，愈伤组织不形成，外植体呈现黑绿色，皱缩，我们确定卡那霉素浓度75mg／1为筛选用浓度；同时对抑菌用抗生素梭节青霉素浓度进行筛选。浓度低于500mg／1时，农秆菌仍能小量生长，外植体边缘可见菌体，这将影响再生 1植株鉴定的真实性；浓度高于5009／l时，外植体易产生过敏反应。从经济、高效的角度考虑，梭芋青霉素浓度确定为500mg八。，” 通过组织培养、农杆菌侵染等步骤，获得得6棵再生植株。取植株叶片用CTAB法皋二二品柴器二宁2滥江器岩之二二功转入西瓜基因组中。
牛胜鸟[2]2004年在《病毒基因介导的抗性机制及抗病毒转基因西瓜的研究》文中认为为了探讨不同转基因结构形式对诱发植物基因沉默，以及在病原介导抗病性中的作用，构建了五种不同结构形式的烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白(CP)基因植物表达载体：pS18、pR29、pDS24、pⅡ38和pⅢ19，借助于根癌农杆菌(Agrobacterium turnefaciens)菌株LBA4404(pALA404)将它们转入烟草(Nicotiana tabaccum cv. NC89)。经过Southern-blot检测，证明五种载体均成功地转入了烟草植株，转化率约在37-59％之间，插入拷贝数1到6个不等。T_0代的RT-PCR显示，除载体pDS24转基因植株中的外源基因没有按照预期的那样转录产生反义RNA以外，其它基因结构形式均得到了正常转录。5种基因结构形式的T_2代转基因植株的抗病试验证明，到开花期为止仍有部分植株不表现病状，而且载体pⅡ38、pⅢ19转基因植株的发病率低于其它结构形式的转基因植株。这说明，外源基因的直接重复序列所介导的抗病性水平较其它结构形式更高。对T_2、T_3代转基因植株的甲基化分析显示，与重复序列相比，外源基因的插入拷贝数与其甲基化关系更密切，甲基化程度也和植株的抗性有一定的正相关。至于外源基因直接重复对转录后基因沉默水平的影响，Northern-blot结果显示，相对于含有2个基因直接重复序列的转基因植株，由3个相同基因构成的直接重复序列的外源基因更容易形成转录后基因沉默。 针对目前我国西瓜生产种植中的病毒病危害，为了培育抗多种病毒的转基因西瓜，我们构建了同时含有西瓜花叶病毒(WMV)外壳蛋白(CP)基因、西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)复制酶(NIb)基因和黄瓜花叶病毒(CMV)复制酶基因的叁价植物表达载体pBWCZ-44，经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pALA404)介导转化西瓜子叶外植体，获得再生植株。经PCR和Southern-blot检测，证明目的基因成功地导入西瓜植株，并能够在后代植株中遗传，最终转化效率约为1.7‰。分别在温室和大田中对T_2、T_3代转基因株系进行的病毒接种试验和抗病性筛选鉴定结果表明，所得到的转基因西瓜株系分别表现出感病、免疫和症状恢复等不同的类型。其中对T_3代植株的检测表明，转基因株系BH1-7对ZYMV和WMV的抗病能力普遍达到中等水平以上，并保持了受体西瓜品系原有的优良农艺性状，为抗病毒西瓜新品系的获得奠定了基础。
胡京昂[3]2005年在《小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因介导的对西瓜病毒抗性的研究》文中研究指明通过病毒或植物来源的基因转化植物获得抗病毒的工程植株,已经成为生物工程中获得抗病毒资源的主要措施之一。病毒的外壳蛋白基因作为目的基因的转基因策略是研究最早、最成熟的技术,其介导抗性的机理(RNA水平或蛋白质水平)虽目前还存在争议,但由于RNA水平介导的抗性更安全、高效,已成为植物抗病毒基因工程研究的热点。本研究主要开展以下的工作: 1.构建非翻译的小西葫芦黄花叶病毒(Zuccini yellow mosaic virus,ZYMV)外壳蛋白基因植物表达载体。本研究以该病毒中国分离物外壳蛋白基因(不含起始密码子)的克隆载体ZCP-87为材料,利用分子生物学技术与pBin438载体连接构建非翻译的植物表达载体(重组质粒命名为:pBZCP5)。重组质粒经PCR和Sal Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证,均表明已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上,本工作为利用植物基因工程培育抗病毒西瓜奠定了基础。 2.建立ZKM西瓜材料高效再生体系。该材料成熟胚的最佳消毒方案是70%酒精预处理30s,然后0.1%升汞消毒5min,无菌水冲洗3-5次,最适萌发培养基为0.8%琼脂糖,先暗培养3d,再转至培养室光照培养3d,种子萌发很快,无菌苗生长健壮。用生长一周后的无菌苗子叶作为外植体,适宜的诱导分化培养基是MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L IAA,分化频率达97.7%,芽苗在MS固体培养基且附加KT浓度0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L时均可得到良好的伸长效果,都能促进芽苗生长健壮。西瓜转化体的卡那霉素(Kan)筛选浓度为100mg/L。 3.应用叶盘法将外源基因导入ZKM西瓜材料,再生苗在含有卡那霉素(Kan)的培养基上筛选培养,获得了抗卡那霉素抗性的芽,并对少许芽进行了PCR鉴定,已扩增出与目的基因大小一致的条带,这表明目的基因已经整合到植物基因组中。
肖守华[4]2006年在《西瓜、甜瓜遗传转化体系的建立及转基因植株的抗病性分析》文中研究指明植物真菌病害一直是影响农作物产量,降低农作物品质的主要原因,西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Mantsum.et Nakai]和甜瓜(Cucumis melon Linn.)是经济价值很高的水果,其栽培面积和产量我国在世界上均占首位,但其病害种类繁多,尤其以真菌性病害最为严重,是瓜类生产中存在的主要问题。在植物抗病基因工程中,通过将抗真菌蛋白基因转入植物来提高农作物对真菌病害的抵抗能力已成为一种直接有效的方法,虽然植物抗病基因工程在一些重要农作物改良中取得了一定进展,但是由于瓜类遗传基础狭窄、抗病种质资源缺乏、抗病遗传规律的复杂性和西瓜、甜瓜存在组培再生困难、试管苗移栽成活率低和遗传转化体系较难优化等问题,使基因工程在瓜类作物的抗病遗传育种应用受到限制,因而这方面的应用研究起步较慢。我们系统研究了西瓜、甜瓜组织培养体系,优化了农杆菌介导的西瓜、甜瓜遗传转化体系.构建了含有烟草的几丁质酶基因(CHI )和烟草β-1,3-葡聚糖酶基因(GLU )和小麦的硫堇蛋白基因(THI)的叁价抗真菌融合基因植物表达载体转化西瓜、甜瓜,成功地获得了9株转基因甜瓜和7株转基因甜瓜株系,并进行了相关分子生物学鉴定,期望从中筛选出抗病性增强的品种来为常规育种提供材料,以求在生产上达到提高瓜类对真菌病害的抵抗能力。主要实验结果如下:1建立了高效西瓜、甜瓜组织培养体系①茎尖与子叶切块可诱导分化不定芽,愈伤组织也可诱导不定芽分化,但频率很低,真叶、下胚轴和茎段仅能诱导出愈伤组织。②建立了以西瓜、甜瓜子叶块为外植体的不定芽分化再生体系,其最适培养基分别为MS+6-BA1.0 mg/L +IBA0.5 mg/L和MS+6-BA2.0 mg/L +IBA0.5 mg/L,在最适培养基上二者的不定芽诱导率分别可达91.2%和94.3%.③一定浓度的6-BA是诱导瓜类子叶块外植体分化的关键,基因型不同的诱导率不同,但对于瓜类不同品种而言,附加低浓度的IBA则有利于这种分化的发生,无激素培养基上的外植体则不能诱导出不定芽。④无菌苗子叶颜色由黄色转呈浅绿色时的子叶块最适合于不定芽的诱导,诱导率最高。
秦新民[5]2005年在《NPR1基因的克隆及西瓜的遗传转化的研究》文中提出NPR1 基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因。本实验以PCR方法从拟南芥中克隆到NPR1基因,通过酶切,连接等技术构建了NPR1基因的植物表达载体。并以亲本西瓜品种”昌农黑冠”为材料,研究西瓜高频再生体系的建立,农杆菌转化过程中各种参数的确定,再生植株筛选、鉴定等问题。并以西瓜子叶为外植体通过农杆菌介导的遗传转化方法将NPR1 基因转入西瓜基因组中获得转基因再生植株;主要结果如下:以DNA-PCR 扩增的方法,从拟南芥中克隆到NPR1 基因,序列分析结果表明,该基因与发表的NPR1 基因序列完全相同。构建了NPR1 基因的植物表达载体——pCaMVNPR,并将该表达载体导入农杆菌,获得农杆菌基因工程菌株。在西瓜的组织培养中,不定芽的分化与外植体种类、苗龄、激素等因素密切相关。3～5 日龄的子叶诱导效果最好;BA 是诱导子叶芽分化的关键因素,但浓度在0.2～1.0mg/L 范围内对芽分化没有明显影响。诱导培养基内添加BA 即可使子叶外植体直接再生出不定芽,再生频率高,而且再生时间短,8-12 天可观察到不定芽的出现。筛选出的最佳诱导培养基为: 子叶:MS+BA1.0mg/L,再生频率为96%; 茎尖:MS+BA0.2mg/L,再生频率为100%。西瓜根的诱导比较容易,MS 基本培养基或添加少量的生长素IBA,NAA 等均能诱导根的分化,最佳生根诱导培养基为1/2MS+ NAA0.2+IBA0.05。农杆菌介导的遗传转化方法研究深入,技术方法成熟,使用广泛,是双子叶植物较为理想的转化方法。介导西瓜遗传的最适宜条件为:3d 苗龄的子叶预培养1d,侵染10-15min,共培养3d。非转化再生芽在含潮霉素20mg/L 的MS 诱导培养2~3周后,全部褪绿变枯,最后死亡。只有少数转化外植体在含潮霉素20mg/L 的诱导培养基上2~3 周后仍保持绿色, 并分化出再生芽。把抗性芽继代到MS+BA0.2+NAA0.05 的成苗培养基中培养。把1.5～2cm 高的植株切下,转接到含Hy 的生根培养基中进行生根筛选,但根对潮霉素等抗生素比较敏感,5mg/l 的潮霉素即可抑制西瓜根的分化。本实验共获得200 多株抗性植株,对部分西瓜转化试管苗进行微量DNA 提取,PCR检测12株,其中5株呈阳性,初步证明目的基因已经整合到西瓜基因组中。
尹涛[6]2008年在《西瓜AGPL1启动子果实特异调控机理的研究及在番茄遗传转化中的应用》文中研究表明植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase,ADP-glucose pyrophosphorylase)含有两个大亚基和两个小亚基。小亚基一般具有一个或两个异型体,在物种之间高度保守并在各组织中组成型表达;大亚基具有多个异型体并具有组织特异性表达的特征。刘敬梅等(2002)根据AGPase大亚基基因在西瓜(Citrullus vulgaris S.)果实中特异表达的现象,克隆到西瓜AGPase大亚基基因5′端1.8kb的序列AGPL1,发现该区段能引导报道基因在瞬时转化的西瓜果实和稳定转化的番茄果实中特异表达。本文对果实特异启动子AGPL1的调控机制进行了较为详细的研究。首先通过引物延伸法对西瓜AGPL1启动子进行转录起始位点定位,发现TATA-box下游33bp处的A为该基因转录的起始位点。为了从AGPL1启动子中分离与果实特异性表达相关的cis元件,我们通过PCR扩增对该启动子进行了一系列5′端和3′端缺失突变,并与gus基因(β-glucuronidase)融合构建瞬时表达载体,利用基因枪介导的瞬时转化研究该启动子在西瓜果实中的表达调控。结果表明在-868～+433之间1301bp的启动子片段具有最大的驱动活性,并保持果实特异地驱动功能。随着启动子5′端的连续缺失,该启动子在西瓜果实中的活性表现出下降趋势并直至丧失功能。在AGPL1启动子下游的5′-UTR中长度为323bp富含AT(65%)的内含子序列(+136～+459)能增强启动子在果实中的驱动活性,但对特异性表达的模式没有显着影响。将AGPL1启动子的系列缺失突变与GFP/RFP双荧光指示瞬时表达载体融合,在叶片中检测报道基因的活性。发现在-986～-959之间27bp和-464～-424之间41bp两个区段的缺失能引起该启动子在叶片表皮细胞中类似组成型表达,分别命名为PN1和PN2(putatively negative region 1 and 2);而这两个区段的下游序列-892～-868和-424～-368之间24bp、56bp相继从5′端缺失时又能引起叶片中驱动活性丧失,分别命名为PP1和PP2(putatively positive region 1 and 2)。将PN1和PN2与CaMV 35S基本功能启动子融合,瞬时转化后抑制了基本启动子在叶片中的驱动活性,最终确定PN1和PN2是抑制AGPL1启动子在叶片中活性的关键区段。在凝胶迁移率分析实验中,PN1和PN2都能与西瓜叶片核蛋白结合形成特异的滞后条带,充分说明了这两个区段作为cis元件的调控作用;PP1和PP2与叶片核蛋白结合的现象充分验证了该正向调控序列的功能。根据上述现象,我们发现了与其他果实特异性启动子完全不同的调控机理,即西瓜果实特异性启动子AGPL1中存在cis元件抑制该启动子在果实外基因的表达,形成果实特异性的现象。为了更精确的分离cis调控元件中的核心碱基序列,我们通过4碱基内部缺失突变和单碱基突变的研究,发现PN1中起作用的cis元件序列为TC/TCAAAA,而且第11、12位的A是该元件的核心碱基;并在多种单子叶和双子叶植物中验证了该元件存在的普遍性。为了充分验证西瓜AGPL1果实特异性启动子的功能,我们将该启动子与番茄红素β-环化酶基因RNAi融合构建植物表达载体,对番茄进行稳定的遗传转化。在转化阳性植株中验证了该启动子的果实特异性表达特性,并获得了高番茄红素积累的番茄果实。
黄玉吉[7]2006年在《根癌农杆菌介导的ACS反义基因和PEAS基因转化香蕉研究》文中研究表明本研究以香蕉(Musa spp．)品种“天宝蕉”(Musa spp．，AAA类群)为试验材料，采用根癌农杆菌介导法对香蕉遗传转化体系进行了较为全面的研究。优化了香蕉横切薄片转化系统：并以该系统进行了ACS反义基因转化香蕉的研究，筛选抗性香蕉芽并再生植株：对转ACS反义基因的薄片进行GUS瞬时表达检测、再生植株叶片的GUS稳定表达检测及gus基因的PCR检测；并在实验室原有基础上进行PEAS基因转化体系的优化、再生植株叶片hpt基因的PCR检测、移栽等工作。主要研究结果如下： 1 优化香蕉横切薄片培养系统。通过调整香蕉横切薄片直接出芽过程中外植体来源、激素种类及浓度、AgNO_3等影响因素，优化香蕉转基因受体系统。选取香蕉低代试管苗的球茎顶端分生组织直接接于不附加其他生长调节剂的MS基本培养基上，可获得较高的出芽率：附加2 mg·L~(-1)AgNO_3的芽诱导培养基可促进香蕉芽的分化：于MS+1.0 mg·L~(-1)BA+0.1 mg·L~(-1)NAA+80 mg·L~(-1)Ad培养基继代20 d的香蕉低代试管苗的球茎顶端分生组织的横切薄片适宜作为香蕉遗传转化的直接受体；香蕉薄片对卡那霉素较为敏感，确定100 mg·L~(-1)为筛选工作浓度。 2 以根癌农杆菌介导将ACS反义基因导入香蕉，并对转化条件进行了优化研究。优化后的条件为：不经预培养的香蕉茎尖横切薄片，侵染前用附加0.1 mg·L~(-1)甘露醇的高渗固体培养基前处理4 h，农杆菌重悬液浓度为OD_(600)1.0左右，重悬液中含100 g·L~(-1)的蔗糖，接菌时间为10～15 min，于26℃黑暗条件下共培养4 d，共培养培养基pH值为5.8。以此条件进行了稳定转化试验。 3 建立香蕉抗性芽筛选、再生植株与转基因检测的技术体系，对转化ACS反义基因薄片进行抗性芽筛选及转基因植株再生研究，对薄片进行GUS瞬时表达检测、再生植株叶片的GUS稳定表达检测和gus基因的PCR检测。采用附加100 mg·L~(-1)卡那霉索、2 mg·L-1 AgNO_3的筛选培养基对共培养后的香蕉横切薄片进行筛选，共获得5个转ACS反义基因的抗性芽系，其中AgNO_3可以抑制残留农杆菌的生长、促进抗性芽的分化。并以这些抗性芽为试验材料进行再生植株的研究，共获得了再生植株30株。经PCR检测，gus基因已整合进香蕉基因组，其中来自稳定表达GUS的抗性芽，经GUS组织化学检测为转基因植株，其余来自不表达GUS的抗性芽，经检测为不表达GUS的植株。 4 PEAS基因导入香蕉研究的后续工作。在实验室原有的PEAS基因转化香蕉初步研究的基础上进行优化，并对转基因再生植株进行分子检测、移栽及其生长情况的观察。结果表明，通过活化农杆菌、在抗性筛选培养基上添加3 mg·L~(-1)AgNO_3抑制残留的农杆菌生长，提高转化效率：经PCR检测，hpt基因已整合进香蕉基因组中；移栽的50株转基因植株中发现了1株嵌合体植株。 本研究对转基因技术在香蕉品种改良上有重要意义，并为香蕉转基因的研究提供了技术基础。
曹迪[8]2009年在《西瓜黄瓜乙烯合成及传导途径中基因克隆与分析》文中提出西瓜、黄瓜和甜瓜是重要的葫芦科瓜类作物,乙烯对瓜类作物果实的成熟、性别分化和产量具有重要影响,因此探索乙烯生物合成、信号转导与瓜类作物果实发育、性别分化和产量的关系一直是瓜类作物的研究重点。目前,多数研究集中在黄瓜、甜瓜乙烯生物合成和信号转导途径中相关基因的分离、克隆,关于西瓜乙烯合成和信号转导途径中关键基因克隆的研究报道相对较少。本试验依据甜瓜、黄瓜等作物乙烯合成和信号转导途径中关键基因的保守序列设计引物,分别以西瓜的强雌性(新红宝突变体)/普通性型材料(新红宝)以及黄瓜的强雌性(欧洲8号)/普通性型材料(秋棚)基因组DNA为模板,采用同源序列克隆方法从西瓜、黄瓜基因组中分别克隆获得ACS、ACO、ETR1、ETR2、ERS、EIN3、ERF等7个乙烯合成和信号转导途径中关键酶的基因/片段。同时利用生物信息学方法对相关瓜类作物基因/片段序列进行比较分析和功能预测,对进一步研究瓜类作物性别分化的分子调控机制具有实践意义。实验结果如下:1根据ACS基因的保守序列设计引物,分别从西瓜新红宝突变体和新红宝基因组DNA中克隆获得一条具有完整阅读框的ACS基因序列,二者核苷酸序列100%相同,命名为CLACS。CLACS全长3385bp,该序列编码区长度为1485bp,编码494个氨基酸,与报道的甜瓜、黄瓜ACS氨基酸序列同源性都在90%以上。CLACS蛋白质有7个保守的区域,其中第5个保守区为ACS酶的活性中心。推测CLACS的分子量为5.57KD,等电点为6.61,其叁维结构与番茄ACS(MMDB:15810;PDB:1IAX)的叁维晶体结构十分类似。2根据ACO基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1522bp的西瓜基因片段,命名为CLACO,包含4个外显子,3个内含子,编码区序列长912bp,编码303个氨基酸;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1270bp的黄瓜基因片段,命名为CSACO,包含4个外显子,3个内含子,编码区序列长909bp,编码302个氨基酸。CLACO和CSACO的编码序列92.3%同源,氨基酸序列93.4%同源。推测CLACO、CSACO蛋白质叁级结构与矮牵牛中的ACO蛋白质(MMDB:35451;PDB:1W9Y)的叁维晶体结构类似。系统进化树分析表明,CLACO和CSACO片段与葫芦科作物中的同类基因亲缘关系最近。3根据ETR1基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1633bp的基因片段,命名为CLETR1;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为1491bp的黄瓜基因片段,命名为CSETR1。去除内含子后,CLETR1和CSETR1编码序列均为795bp,编码264个氨基酸,二者编码序列96%同源,氨基酸序列98%同源。CLETR1和CSETR1的编码序列存在明显的单核苷酸变异,共23个核苷酸位点存在SNPs,其中5个SNPs导致4个编码氨基酸的改变。4根据ETR2基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得2个序列完全一致基因片段,命名为CLETR2;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致的黄瓜基因片段,命名为CSETR2。CLETR2和CSETR2序列长度均为417bp,属于编码区序列,推测编码138个氨基酸,二者编码区序列同源达95.68%,氨基酸序列98.5%同源。获得的基因克隆片段编码的蛋白质具有REC信号保守结构域特征,结构域叁维结构预测与拟南芥乙烯受体(PDB:1DCF_A)的叁维晶体结构相似性极高。5根据ERS基因的保守序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为837bp西瓜基因片段,命名为CLERS;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为757bp黄瓜基因片段,命名为CSERS。CLERS和CSERS都由2个外显子片段、1个内含子和3'UTR区组成,编码序列长度均为291bp,编码96个氨基酸,二者编码区序列94.85%同源,氨基酸序列93.76%同源,获得的基因克隆片段编码的蛋白质具有HATPase-c保守结构域特征。6根据西瓜果实发育EST文库中相关EIN3序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为603bp的西瓜基因片段,命名为CLEIN3;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列长度分别为619bp和604bp的基因片段,命名为CSEIN3A、CSEIN3B,叁者编码序列长度分别为399bp、423bp、408bp,推测编码132、140、135个氨基酸。叁者编码区序列92.83%同源,氨基酸序列93.1%同源。CSEIN3A比CSEIN3B在靠近羧基端多5个天冬酰胺。7根据本实验室西瓜枯萎病菌SSH文库中相关ERF的序列设计引物,以西瓜新红宝突变体/新红宝基因组DNA为模板获得两个序列完全相同、长度为627bp西瓜基因片段,命名为CLERF;以黄瓜欧洲8号/秋棚基因组DNA为模板获得2个序列完全一致、长度为625bp黄瓜基因片段,命名为CSERF。CLERF和CSERF编码序列长度均为363bp,推测编码120个氨基酸,二者编码区序列94.49%同源,氨基酸序列95%同源。
陶雷, 吴莹, 袁红梅, 赵丽娟[9]2007年在《转基因蔬菜研究的进展》文中研究表明利用DNA重组技术将目的基因转入蔬菜中,培育成的蔬菜称为转基因蔬菜。它主要是用来选育具有特殊性状的蔬菜新品种。通过转基因技术人们能最大限度地利用感兴趣的外源基因,使蔬菜育种工作具有更强的针对性。本文综述了转基因蔬菜在抗病毒、抗虫、抗除草剂、延迟成熟及品质改良等方面的进展和现状,展示了基因转化技术在蔬菜品种改良上广阔的应用前景。
刘岚[10]2006年在《百合遗传转化体系建立及转ACC合酶反义基因的研究》文中进行了进一步梳理延长百合花朵的寿命已成为近20年来专家们研究的主要课题之一，研究表明，抑制乙烯的生物合成是延缓切花衰老的有效途径。 本文以东方百合“西伯利亚”、“索邦”和铁炮百合为研究材料，通过外植体再生和抗生素筛选实验确定了百合遗传转化受体系统，利用GUS基因和ACC合酶反义基因对“西伯利亚”进行了根癌农杆菌介导的遗传转化，从而建立了高效稳定的百合遗传转化体系。 百合鳞片在诱导愈伤组织、不定芽及生根的能力上有一定的差异，“西伯利亚”的再生能力最强，其次为“索邦”、铁炮百合。在含有0.2、0.5mg／L 6-BA和0.5～2.0mg／L2.4-D或0.1、0.2mg／L NAA的MS培养基中，3个品种都能高效再生。抗生素筛选实验结果表明，50～100mg／L卡那霉素或7.5～10mg／L潮霉素浓度范围对百合愈伤组织和鳞片效果较理想。 在建立“西伯利亚”农杆菌介导的遗传转化体系中，农杆菌侵染愈伤组织外植体转化效率较高；乙酰丁香酮(AS)的添加能大大提高根癌农杆菌转化百合的效率；LBA4404菌株的侵染效果好于GV3101菌株。另外，预培养时间、农杆菌浓度、侵染时间、及共培养时间均对转化效率有一定的影响，转化材料在OD_(600)为0.4的菌液中侵染15min，共培养2～3天转化效率最高。筛选后获得的抗性植株经PCR检测和GUS组织化学染色证实外源基因已经整合到基因组DNA中并获得表达，转化频率为5％～8％。 利用ACC合酶反义基因对“西伯利亚”遗传转化获得了9株转化植株，经PCR检测其中2株呈阳性，初步证实了外源基因已整合进百合基因组中，从而证实了所建立的转化系统的可应用性。
参考文献：
[1]. 反义转化酶基因转入西瓜的研究[D]. 陈晶. 西南农业大学. 2002
[2]. 病毒基因介导的抗性机制及抗病毒转基因西瓜的研究[D]. 牛胜鸟. 中国农业大学. 2004
[3]. 小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因介导的对西瓜病毒抗性的研究[D]. 胡京昂. 河南农业大学. 2005
[4]. 西瓜、甜瓜遗传转化体系的建立及转基因植株的抗病性分析[D]. 肖守华. 山东农业大学. 2006
[5]. NPR1基因的克隆及西瓜的遗传转化的研究[D]. 秦新民. 广西师范大学. 2005
[6]. 西瓜AGPL1启动子果实特异调控机理的研究及在番茄遗传转化中的应用[D]. 尹涛. 浙江大学. 2008
[7]. 根癌农杆菌介导的ACS反义基因和PEAS基因转化香蕉研究[D]. 黄玉吉. 福建农林大学. 2006
[8]. 西瓜黄瓜乙烯合成及传导途径中基因克隆与分析[D]. 曹迪. 东北农业大学. 2009
[9]. 转基因蔬菜研究的进展[J]. 陶雷, 吴莹, 袁红梅, 赵丽娟. 植物研究. 2007
[10]. 百合遗传转化体系建立及转ACC合酶反义基因的研究[D]. 刘岚. 大连理工大学. 2006
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