谢冬[1]2013年在《肺癌表观遗传的临床基础研究》文中进行了进一步梳理肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，NSCLC约占全部肺癌的80～85%。目前，肺癌的主要治疗手段包括手术治疗、放疗、化疗和靶向治疗等，尽管近年来上述治疗措施已取得长足进步，但其复发率和病死率仍很高，总体疗效差，主要原因在于其发病、复发及转移等相关机制尚不明确。肺癌起源于一系列遗传和表观遗传的变化，DNA甲基化和miRNA是表观遗传修饰的主要机制，已成为胸外科的研究热点之一。实验共分为两个部分：第一部分，在肿瘤组织、癌旁组织、正常组织中，评估hOGG1和HYAL1基因启动子甲基化的表达差异，在NSCLC患者和良性对照患者外周血中，评估hOGG1及HYAL1基因启动子甲基化的差异；第二部分，在NSCLC患者与良性对照患者外周血中,评估miRNAs的表达差异能否用于NSCLC的早期诊断，评估外周血中miRNAs的表达差异能否用于预测早期肺癌的复发。第一部分肺癌组织及血浆中HYAL1与hOGG1基因启动子甲基化的状况与临床意义目的：在肿瘤组织、癌旁组织、正常组织中，评估hOGG1和HYAL1基因启动子甲基化的表达差异，在NSCLC患者和良性对照患者外周血中，评估hOGG1及HYAL1基因启动子甲基化的差异;观察hOGG1和HYAL1基因启动子甲基化与NSCLC临床病理因素的关系。方法：评估80例NSCLC肺癌组织，80例癌旁组织，以及20例肺良性病变组织中hOGG1及HYAL1基因启动子甲基化差异，并分析肺癌组甲基化状况与临床病理资料相关关系；评估80例NSCLC患者和20例肺良性病变患者外周血中hOGG1及HYAL1基因启动子甲基化状况；评估10例肺癌组织与相应转移纵隔淋巴结中hOGG1及HYAL1基因启动子甲基化状况。结果：肺癌组织中，HYAL1启动子甲基化的阳性率明显高于正常对照组（48.8%vs10%, p=0.002）；癌旁组织中，HYAL1启动子甲基化的阳性率高于正常对照组（32.5%vs10%, p=0.045）；NSCLC患者血浆中HYAL1启动子甲基化的阳性率显着高于对照组血浆（40%vs5%, p=0.003）。肺癌组织中，hOGG1启动子甲基化的阳性率明显高于正常对照组（52.5%vs15%,p=0.003）；癌旁组织中，hOGG1启动子甲基化的阳性率高于正常对照组，但两者差异无显着性（23.8%vs15%, p=0.587）；NSCLC患者血浆中hOGG1启动子甲基化的阳性率显着高于对照组血浆（42.5%vs10%, p=0.007）。恶性组肺癌组织中HYAL1和hOGG1启动子甲基化率与患者的性别、年龄分组、肿瘤大小、病理类型、组织学分级、T分期均无明显关系(P>0.05)。肺癌组织中，III期组HYAL1启动子甲基化阳性率高于I－II期组（66.7%vs39.6%, p=0.022）；淋巴结阳性组HYAL1启动子甲基化阳性率高于淋巴结阴性组（63.6%vs38.3%,p=0.026）。肺癌组织中，III期组hOGG1启动子甲基化阳性率高于I－II期组（74.1%vs41.5%, p=0.006）；淋巴结阳性组hOGG1启动子甲基化阳性率高于淋巴结阴性组（69.7%vs40.4%, p=0.001）。恶性组血浆中HYAL1和hOGG1启动子甲基化率与患者的性别、年龄分组、肿瘤大小、病理类型、组织学分级、T分期均无明显关系(P>0.05)。恶性组血浆中，III期组HYAL1启动子甲基化阳性率高于I－II期组（66.7%vs26.4%, p=0.001）；淋巴结阳性组HYAL1启动子甲基化阳性率高于淋巴结阴性组（60.6%vs25.5%,p=0.002）；恶性组血浆中III期组hOGG1启动子甲基化阳性率高于I－II期组（59.3%vs34.0%, p=0.030）；淋巴结阳性组hOGG1启动子甲基化阳性率高于淋巴结阴性组，但两者差异无显着性（54.5%vs34.0%, p=0.068）。血浆中HYAL1启动子甲基化阳性用于肺癌诊断的ROC曲线，AUC为0.675(95%的可信区间为56%-79%)。血浆中hOGG1启动子甲基化阳性用于肺癌诊断的ROC曲线，AUC为0.663(95%的可信区间为54.3%-78.2%)。血浆中hOGG1联合HYAL1启动子甲基化阳性用于肺癌诊断的ROC曲线，AUC为0.728(95%的可信区间为61.9%-83.8%)。10例肺癌组织与相应转移纵隔淋巴结比较显示，二者之间HYAL1启动子甲基化状况存在差异4例，二者之间存在hOGG1启动子甲基化状况存在差异4例。结论：hOGG1和HYAL1在NSCLC组织和血浆中存在启动子高甲基化，肺癌组织中hOGG1和HYAL1的启动子高甲基化与NSCLC病理分期和淋巴结转移相关，提示hOGG1和HYAL1的启动子高甲基化可能参与了NSCLC的发生、发展及转移。血浆hOGG1和HYAL1的检测可用于NSCLC的辅助诊断。NSCLC肿瘤内部可能存在肿瘤异质性。第二部分血浆miR-155、miR-182和miR-21对早期非小细胞肺癌诊断价值的研究目的：研究非小细胞肺癌（NSCLC）患者与良性对照患者外周血中miRNAs的表达差异能否用于NSCLC的早期诊断，外周血中miRNAs的表达差异能否用于预测早期肺癌的复发。方法：采用实时荧光定量RT-PCR检测血浆中9种miRNAs（miR-30d，miR-383， miR-223，miR-25，miR-21、miR-126、miR-210、miR-155、miR-182）的表达量，在20例NSCLC患者和20例良性对照组中筛选出可能有诊断价值的miRNAs。在总计135例早期NSCLC和85例良性对照组中，评估miR-21、miR-155以及miR-182的计算其诊断的ROC曲线；随访135例NSCLC患者3年，评估复发组与无复发组miRNAs表达差异。结果：NSCLC组血浆miR-21、miR-155以及miR-182的表达显着高于良性对照组，在miR-21曲线下面积（theAreas under the ROC Curve，AUC）为0.805（95%的可信区间：0.749-0.861），其最佳诊断临界点，诊断敏感性68.1%，诊断特异性78.8%；miR-155曲线下面积为0.821（95%的可信区间：0.767-0.875），其最佳截断点，诊断敏感性81.5%，诊断特异性69.4%；miR-182曲线下面积为0.745（95%的可信区间：0.681-0.809），其最佳截断点，诊断敏感性55.6%，诊断特异性82.4%。将这3种miRNAs联合起来，可更明显地将NSCLC组与良性对照组区分出来，AUC值为0.894（95%可信区间：0.862-0.936），其最佳截断点，诊断敏感性为73.3%，诊断特异性为95.3%。复发组患者血浆miR-21、miR-155以及miR-182的表达显着高于未复发组。结论：血浆miR-21、miR-155以及miR-182可用于NSCLC早期诊断，可以有助于与肺内良性病变相鉴别。miR-21、miR-155以及miR-182升高是早期NSCLC复发的高危因素。
张胜[2]2010年在《舌鳞癌基因组DNA甲基化谱的初步构建》文中指出随着肿瘤机制研究的不断深入,表观遗传学(epigenetics)已日益受到重视。表观遗传学是指在基因组序列不变的情况下,可以决定基因表达与否并可稳定遗传下去的调控信息；而表观遗传组学(epigenomics)是指在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。目前,表观遗传组学研究已成为肿瘤研究领域的新前沿。DNA甲基化是哺乳动物基因组最为常见、研究最为深入的一种表观遗传学事件,参与调节多种生命活动。每种类型的肿瘤都有其特定的DNA甲基化模式,不同肿瘤或同一肿瘤的不同发生阶段中基因组DNA上CpG岛甲基化状态的差异,构成了肿瘤特定DNA甲基化谱。舌鳞状细胞癌(Tougue Squamous Cell Carcinoma, TSCC)是口腔鳞状细胞最为常见的恶性肿瘤,其发生发展的分子机制还未阐明。过去十几年中,在口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC)中相关基因的DNA异常甲基化研究方面取得了一些进展,但大部分研究只是针对几个或一群基因采取候选基因研究方法,迄今还没有基于全基因组层面上直接、全面、系统分析TSCC中DNA甲基化情况的报道。舌鳞癌DNA甲基化谱建立不仅有助于全面揭示舌癌发生发展的分子机制,更重要的是可为舌鳞癌的早期诊断、治疗及预后评价等提供非常有价值的依据。缺少高通量筛选技术可能是影响基因组水平研究DNA甲基化谱系的关键因素。DNA甲基化芯片的发展为推动表观遗传组学研究提供了新的契机。NibmbleGen公司制备的甲基化芯片是目前国际上覆盖人类基因组CpG岛最多、注释最全面的一种芯片,而且这种芯片具有较高灵敏度和特异性的特点。基于以上因素,本课题采用最新发展的甲基化DNA免疫沉淀(Methylated DNA Immunoprecipitation, MeDIP)结合NimbleGen HG18 CpG Promoter芯片高通量分析舌鳞癌组织DNA甲基化情况,并结合芯片提供的信息,进一步在舌鳞癌组织和癌旁正常对照组织中分析基因的表达情况,初步筛选出舌鳞癌相关的基因。[甲基化芯片检测舌鳞癌基因组DNA甲基化分布]本课题收集了9例患者舌鳞癌肿瘤组织及其癌旁正常对照组织标本,并将9例标本分别抽提获得DNA,组成肿瘤和正常两组样品。采用MeDIP方法富集两组样品基因组DNA中甲基DNA片段,在严格的质控检验后,分别与两张甲基化芯片进行杂交,对杂交信号进行扫描以及初步数据处理,并对两组间数据进行比较分析。结果显示,有1269个DNA甲基化位点只存在于肿瘤组织中,其中涉及到330个基因,这些基因分布在不同的染色体上。定位在1号染色体上的甲基化差异基因最多,有28个,占肿瘤组织内甲基化差异基因的8.48%；其次,19号染色体上有27个,占差异总数的8.18%；而定位在18号染色体上的差异基因最少,只有4个,所占比率为1.21%;330个舌鳞癌组织中甲基化基因的甲基化区域有218个(66.1%)位于基因的启动子区,并有70%为CpG岛。同样,在癌旁正常对照组织中,差异DNA甲基化的位点共有1385个,涉及基因有321个。基因分布于各染色体上,其定位和分布数量差别较大。其中,定位在19号染色体上的甲基化差异基因最多,高达40个,占癌旁组织中甲基化差异基因的12.46%；其次为X染色体和1号染色体,分别有32个和23个,占差异总数的9.97%、7.17%；而定位在14号染色体上的差异基因最少,只有2个,所占比率为0.62%。321个甲基化基因的甲基化区域有210个(65.4%)位于基因的启动子区,43.6%为CpG岛。筛选得到的差异甲基化基因具有一定家族聚集性,四个角蛋白家族基因和六个跨膜蛋白家族基因均在肿瘤组织中发生甲基化；而7个黑色素瘤抗原家族成员则在癌旁正常对照组织中发生甲基化。采用在线GO分析网站Gostat对芯片筛选出来的差异甲基化基因进行功能分类,发现差异基因参与了基因转录调控、生殖、发育、代谢、离子转运、细胞生长和增殖、细胞分化和凋亡、细胞通讯、信号转导、细胞粘附等广泛的生物学过程,同时还涉及多条与机体免疫及肿瘤发生有关的信号通路,如Cell Communication、Purine metabolism、Cell adhesion molecules (CAMs)、Natural killer cell mediated cytotoxicity、Neuroactive、ligand-receptor、interaction、Glycerophospholipid metabolism、leukocyte transendothelial migration、Fc epsilon RI signaling pathway等。由此可以推测,这些甲基化异常的基因可能与TSCC的发生发展密切相关。[芯片结果的初步验证及肿瘤相关基因的初步筛选]从海量的芯片杂交数据中挑选出肿瘤组织中发生异常甲基化的ITIH5基因和FBLN1基因以及癌旁正常对照组织中发生异常甲基化的RUNX3基因,采用MSPCR方法检测叁个基因分别在肿瘤组织和癌旁正常对照组织中的甲基化改变情况。结果发现,在癌旁正常对照组织中检测到ITIH5、FBLN1两个基因分别存在25%和20%的DNA异常甲基化,但两个基因在肿瘤组织中均存在较高频率的DNA异常甲基化,分别为70%(14／20)、55%(11／20)。统计学分析证实,两个基因在肿瘤组织和对照组织中的甲基化程度存在显着差异(P=0.004<0.01,P=0.026<0.05)。另外,RUNX3基因的DNA异常甲基化在癌旁正常对照组织和肿瘤组织中发生的频率分别为55%和15%,两者之间同样存在显着差异(P=0.008<0.01).MSPCR初步验证结果与芯片结果相似,初步证明芯片结果的可靠性。为了进一步筛选舌鳞癌相关的肿瘤基因,我们通过分析芯片结果,选择出与肿瘤发生密切相关的并在舌鳞癌组织中未深入研究的6个基因(BCL2L14、CDCP1、DIRAS、FBLN1、ITIH5、RUNX3)进行初步分析。采用RT-PCR方法对6个基因在舌鳞癌组织中的表达情况进行初步筛选,结果提示,DIRAS、FBLN1、ITIH5在舌鳞癌组织中表达下调(P<0.05),下调频率分别是45%(9／20)、40%(8／20)、55%(11／20)；而BCL2L14、CDCP1、RUNX3则在舌鳞癌组织中表达显着上调(P<0.05),上调频率分别是60%(12／20),50%(10／20),75%(15／20)。提示6个功能不同基因可能与舌鳞癌的发生发展有关。进一步对FBLN1、ITIH5、RUNX3叁个基因进行表达异常与甲基化关系分析,结果发现,FBLN1、ITIH5基因分别在87.5%(7／8)、90.9%(10／11)表达下调的舌鳞癌组织标本中存在DNA异常甲基化；同样,RUNX3基因则在66.7%(10／15)表达上调的肿瘤组织对应的癌旁对照组织中存在异常甲基化。说明DNA异常甲基化与叁个基因在组织中的表达异常有关。综上所述,通过本研究初步构建了人舌鳞癌组织与癌旁正常对照组织基因组DNA甲基化谱,得到了大量的DNA甲基化分布信息,为进一步建立更为精确的舌鳞癌DNA甲基化谱奠定了基础,也为阐明舌鳞癌发病的分子机制提供了可能。另外,本课题初步筛选出6个与舌鳞癌发生发展密切相关的基因,可作为以后更深入研究的靶标,为舌鳞癌临床诊断、治疗或预后等分子标志物的筛选提供了实验依据。
刘文斌[3]2010年在《致癌物诱导大鼠肺鳞癌癌变过程中DNA甲基化动态改变与作用机制的研究》文中指出研究背景与目的:肺癌是全球性的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在我国以及世界其它地区的肿瘤性疾病中均居第一位,严重危害人们的健康和生命。因此,深入研究肺癌发生的分子机制,尤其是癌前病变的分子机制,对于开展高危人群的筛选和利用有效的分子生物标记进行早期诊断,降低肺癌发生率和死亡率具有十分重要的意义。肺癌的发生是一个多阶段、多步骤的过程。例如:肺鳞癌由支气管粘膜上皮恶变所经历的病变包括:增生→鳞状上皮化生→轻度、中度、重度不典型增生→原位癌→浸润癌。既往的研究表明,在肺癌发生过程中需要一系列的遗传学改变的积累,包括DNA突变、缺失、扩增、重组、染色体畸变等引起的基因表达的改变。近年来,人们逐渐认识到基因表达调控的另一重要机制—DNA甲基化,在肺癌的发生发展过程中也起着重要的作用,但是相关的研究还不够深入。DNA甲基化是表遗传学修饰的主要形式,其主要特点是通过对CpG序列的胞嘧啶进行甲基化修饰来调控基因的表达,而DNA序列本身并不改变。已有的研究表明,DNA异常甲基化是人类肿瘤组织中常见的改变之一。一方面,基因组范围内散发的CpG二核苷酸序列普遍发生低甲基化,从而导致染色体的断裂、易位、丢失、以及部分原癌基因的激活;另一方面,抑癌基因的启动子区域CpG岛DNA发生高甲基化,造成相关基因的表达失活。目前,已有较多文献报道肺癌肿瘤组织和细胞株中许多肿瘤相关基因启动子区发生了高甲基化,这些基因涉及到细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复、细胞黏附等多条信号通道。可见,在肺癌的发生发展过程中,以DNA甲基化为主的表遗传学机制与遗传学机制占有同等重要的地位。但是,对肺癌癌前组织中DNA甲基化的研究相对较少,DNA异常甲基化在癌前病变中的作用机制也还不清楚。研究表明, 3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene, MCA)和二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine, DEN)诱导的大鼠肺鳞癌的发生与人类肺癌的发生经历了相似的形态学过程,在分子生物学水平上,也都有相似的变化,并导致相似的基因表达的改变。上述研究为利用此肺癌模型探讨人类肺癌发生的表遗传学机制提供了依据。基于以上考虑,我们以致癌物MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌模型为基础,研究癌变过程中DNA甲基化的动态改变情况及作用机制,包括全基因组低甲基化动态变化趋势、各种肿瘤相关基因甲基化状态的改变及对蛋白表达的影响以及DNA甲基转移酶的改变情况等,初步揭示DNA甲基化在化学致癌过程中的作用,为阐明肺癌癌变的表遗传学机制奠定基础。材料和方法:1. Wistar大鼠90只,雌雄各半,6周龄,体重200g±20g,随机分为实验组80只,对照组10只。实验组每只大鼠左肺下叶一次性灌注0.1ml致癌物碘油混悬液(含10 mg MCA和10μl DEN),对照组每只大鼠灌注0.1ml碘油。于灌注后第15、35、55、65、75天随机抽取各实验组动物16只和对照组动物2只处死。取灌注部位病变组织,一分为二,一份抽提组织RNA和蛋白质,另一半置于4%多聚甲醛固定液中,常规石蜡包埋,制备成4μm和10μm厚的切片。利用激光捕获显微切割的方法获取正常和处于不同癌变阶段的组织细胞并提取DNA。2.采用抗5-甲基胞嘧啶(5-methycytosine, 5-mC)抗体免疫组化的方法,检测大鼠肺鳞癌癌变各阶段基因组甲基化水平,利用图像分析系统测量其平均光密度值和积分光密度值,从细胞形态学水平获取DNA低甲基化的发生情况;利用甲基化敏感性随机引物PCR(Methylation-sensitive arbitrarily primed PCR, MS-AP-PCR)方法分析了11例癌前病变组织和11例肿瘤组织及其配对的正常支气管上皮组织基因组DNA中异常甲基化的改变情况,观察癌变过程中DNA甲基化的差异;分离差异甲基化片段,克隆并进行测序;利用BLAST软件对序列的同源性进行分析,确定是否为已知基因。3.采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)和测序的方法检测癌变过程中肿瘤相关基因p15、p16、p27、p57、RASSF1A、TSLC1、TIMP-3、E-cadherin、N-cadherin、DAPK1、FHIT、SOCS-3高甲基化的发生情况;采用免疫组化检测p16、p27、p57、RASSF1A、TSLC1、TIMP-3、N-cadherin、DAPK1、FHIT、SOCS-3蛋白在大鼠肺鳞癌癌变各阶段的表达水平,采用Western blot检测各蛋白在正常、癌变和鳞癌组织中的表达水平。4.采用免疫组化检测DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)1、3a和3b在大鼠肺鳞癌癌变各阶段的表达水平,分析其与各肿瘤相关基因甲基化之间的关联;原代培养p16、p57、TSLC1基因甲基化大鼠肺鳞癌细胞,采用不同浓度(2μM、5μM、10μM)去甲基化试剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-aza-dC)处理,MSP和逆转录PCR(Reverse transcription-PCR, RT-PCR)分别检测处理前后各基因甲基化和mRNA表达的情况。5.所有参数均采用SPSS13.0统计软件分析处理,各基因甲基化发生频率和各蛋白阳性率差异比较以及甲基化和表达的相关性分析采用χ2检验,方差分析用于分析组间均数差别,双侧概率检验,检验水平α为0.05及0.01两种。结果:1.灌注后15-75天分批处死大鼠,大体病理观察发现对照组左肺无明显改变,实验组大鼠左肺下叶有直径0.5cm-1cm不等的肿块。HE切片染色,光镜下观察发现,对照组无明显的增生性或肿瘤性病变;实验组出现从正常支气管上皮组织到肺鳞癌各阶段病变,包括支气管粘膜上皮过度增生、鳞状上皮细胞化生、不典型增生、原位癌以及广泛浸润癌,且多为一例病变组织中同时存在多个癌变阶段。癌变过程各阶段的计数结果:正常支气管上皮20例(包括对照组和实验组各10例)、上皮增生25例、鳞状化生27例、不典型增生37例、原位癌30例、浸润癌25例。2.抗5-mC抗体在支气管上皮细胞胞核表达,正常对照组胞核呈棕黄至黄褐色,随着癌变过程的延续,染色程度逐渐变淡,至浸润癌阶段胞核呈浅黄色。癌变各阶段细胞胞核染色基底层较腔细胞层深。支气管粘膜上皮增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌、浸润癌5-mC免疫组化平均光密度值和积分光密度值呈总体下降趋势,与正常对照组比值均有显着差异(P < 0.01);正常与癌变各阶段支气管上皮基底层细胞平均光密度值和积分光密度值比腔细胞层细胞层高,差异有显着性意义(P < 0.01)。3.利用MS-AP-PCR方法分析了11例癌前病变组织和11例肿瘤组织,及其配对的正常支气管上皮组织DNA中异常甲基化的改变情况,结果发现多数标本中均能发现异常甲基化片段。在200bp-700bp范围内,我们一共回收了8个扩增片段,其中低甲基化片段7个,高甲基化片段1个。通过克隆、测序和BLAST分析显示,8个DNA片段中有7个与大鼠基因组序列有高度同源(99%-100%的同源性)。这些序列位于大鼠的染色体1、3、9、12、13、20和X上,与细胞周期调控、细胞生长分化相关。采用MSP和测序的方法对高甲基化片段Hyper-1进行了鉴定分析,结果发现Hyper-1在正常组织中未发现甲基化,而在肿瘤和癌变组织中均发现甲基化。4. p15和E-cadherin在正常和癌变各阶段均未发生甲基化。其余肿瘤相关基因在癌变过程中甲基化程度逐渐增强,至少一个基因发生甲基化的频率和平均甲基化基因个数不断增加。正常、增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌和浸润癌各阶段组织中甲基化频率分别为:p16:0%、8.00%、22.22%、40.54%、50.00%和56.00%;p27:0%、0%、0%、0%、3.33%和8.00%;p57:0%、0%、11.11%、18.92%、26.67%和36.00%;RASSF1A:0%、0%、3.70%、8.11%、6.67%和16.00%;TSLC1:0%、0%、18.52%、24.32%、40.00%和48.00%;TIMP-3:10.00%、12.00%、18.52%、24.32%、30.00%和60.00%;N-cadherin:0%、0%、7.41%、18.92%、26.67%和36.00%;DAPK1:0%、0%、7.41%、10.81%、26.67%和36.00%;FHIT:0%、0%、3.70%、16.22%、43.33%和48.00%;SOCS-3:0%、0%、7.41%、16.22%、26.67%和48.00%。相反,除N-cadherin表达增强外,其余各肿瘤相关基因蛋白在正常、增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌和浸润癌各阶段组织中表达不断下降,阳性表达率分别为:p16:90.00%、84.00%、70.37%、59.46%、40.00%和32.00%;p27:95.00%、88.00%、74.07%、67.57%、60.00%和44.00%;p57:95.00%、92.00%、81.48%、75.68%、63.33%和56.00%;RASSF1A:100.00%、92.00%、70.37%、64.86%、53.33%和48.00%;TSLC1:95.00%、88.00%、55.56%、48.65%、43.33%和40.00%;TIMP-3:100.00%、96.00%、77.78%、70.27%、53.33%和24.00%;N-cadherin:0%、0%、14.81%、21.62%、33.33%和44.00%;DAPK1:100.00%、100.00%、88.89%、81.08%、70.00%和56.00%;FHIT:100.00%、96.00%、81.48%、62.16%、43.33%和36.00%;SOCS-3:100.00%、100.00%、88.89%、86.49%、73.33%和56.00%。Western blot结果:未甲基化且免疫组化阳性的标本蛋白表达较强,甲基化且免疫组化阴性的标本蛋白表达较弱或无表达。p16、p57、TSLC1、TIMP-3、DAPK1、FHIT、SOCS-3基因甲基化与蛋白表达呈显着负相关。5.正常、增生、鳞状化生、不典型增生、原位癌和浸润癌各阶段DNA甲基转移酶的阳性表达率分别为:DNMT1:0%、16.00%、29.63%、40.54%、46.67%和64.00%; DNMT3a:0%、0%、18.52%、37.84%、40.00%和68.00%;DNMT3b:0%、0%、0%、5.41%、10.00%和12.00%。DNMT1与DNMT3a、DNMT3b表达均呈显着正相关(P < 0.05),DNMT3a与DNMT3b表达无相关(P > 0.05)。DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的表达与肿瘤相关基因甲基化相关性分析结果显示:p16、p57、TSLC1基因甲基化分别与DNMT1和DNMT3a的表达呈显着正相关(P < 0.01),此外,RASSF1A、TIMP-3、N-cadherin基因甲基化与DNMT3a的表达呈显着正相关(P < 0.01)。DNMT1和DNMT3a表达阳性的标本中平均甲基化基因数目是2.43±1.85和2.65±1.82,显着高于表达阴性的标本中平均甲基化基因数目1.35±1.98和1.34±1.95。对p16、p57、TSLC1基因甲基化的大鼠肺鳞癌原代细胞进行去甲基化试剂处理后,其基因mRNA表达水平显着升高。结论:1.采用支气管灌注MCA和DEN两种致癌物成功建立Wistar大鼠肺鳞癌癌变模型。2.基因组甲基化水平的降低在肺癌癌变早期就已发生,高甲基化和低甲基化共同存在于癌变组织和肿瘤组织中,并且在MCA和DEN诱导的大鼠癌变过程中起到非常重要的作用。筛选出的差异性甲基化片段所在区域可能是化学致癌癌变过程中改变的敏感地区,这些序列可以探索作为接触致癌物质的潜在生物标志物。经鉴定的高甲基化片段,提示其可能来自新基因,并且高甲基化可能与相关基因转录抑制有关。3.细胞周期调控相关基因p16、p27、p57、RASSF1A,细胞黏附相关基因TSLC1、TIMP-3、N-cadherin,凋亡相关基因DAPK1、FHIT以及SOCS-3基因高甲基化导致的基因沉默是MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌癌变过程中的早期和频繁的事件,并在此过程中起重要作用。4. DNMT1和DNMT3a表达的增加是癌变过程中一个具有特征的早期分子改变,共同调控基因甲基化的发生,参与了MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌发生发展的全过程。5. DNA甲基化是肿瘤相关基因失活的重要机制,并且CpG岛高甲基化导致的基因沉默是一个可以逆转的过程。综上所述,MCA和DEN诱导的大鼠肺鳞癌模型可以从表遗传学机制来阐明致癌物在诱发癌变过程中的作用及其机制,丰富传统的“遗传学致癌理论”。建立的实验体系,为进一步全面评价环境因素与DNA甲基化相互作用参与肺癌癌变的发生奠定了基础,也将对传统的基于“突变检测”的致癌物的评价体系起到完善作用。同时,本研究为进一步研究相关基因如何通过表遗传学/遗传学的相互作用介导相关信号通路参与癌变提供资料,也为利用该模型筛选新的脱甲基化制剂用于肺癌治疗以及评价我国环境因素与DNA甲基化相互作用在肺癌发生中的机制提供方法学和实验模型。
魏源华[4]2006年在《APC基因甲基化特异性PCR检测方法的建立及其在肺癌诊断中的应用》文中提出背景 DNA甲基化对转录的抑制作用是表观遗传学中一项非常重要的内容。人类基因组中约有29000个CpG岛，超过60％的基因启动子和第一外显子都包含CpG岛。DNA甲基化与肿瘤的关系正日益引起人们的关注，检测DNA的异常甲基化有助于深入理解肿瘤形成机制，并且可为肿瘤的早期诊断、病理分型、疗效评估及复发监测等提供十分重要的信息。 2004年我国卫生部提供的资料显示肺癌的发病率与死亡率已居恶性肿瘤之首。APC基因，即腺瘤性结肠息肉病相关基因(ademomatous polyposis coli，APC)，其蛋白质的表达在肺癌中降低，却很少发现突变。 目的 建立含有弱阳性质控品的甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)检测技术。研究APC基因甲基化对转录的影响及其与肺癌的关系。 方法 酚-氯仿法提取脐带血淋巴细胞DNA，转甲基制备阳性模板，化学修饰，MSP后获得目的片段，克隆到pMD18-T质粒载体，测序筛选阳性和阴性质粒，紫外分光光度法对阳性质粒定量，优化MSP的
张祖萍[5]2009年在《脑胶质瘤的表观遗传学研究》文中认为[LRRC4基因的前期研究结果]LRRC4(Genbank登录号为AF196976)是我室采用EST介导的定位候选克隆策略结合5'RACE的方法从染色体7q31-32克隆的一个富亮氨酸重复(Leucine-rich repeat, LRR)超家族新成员。多组织膜Northern Blot和组织芯片分析显示LRRC4在人、鼠组织均表现出脑特异表达的特点。Northern-blot和RT-PCR结果显示LRRC4基因不仅在多种恶性胶质瘤细胞系(如U251、U87、SF126、SF767、BT325和M17)中表达缺失；而且在87.5%(21/24)原发性胶质瘤中存在显着表达缺失和下调。外源性的LRRC4基因的转染可使U251生长速度减慢；细胞周期阻滞在G0/G1期；软琼脂集落形成率下降；裸鼠成瘤体积明显缩小和成瘤时间明显延迟。进一步研究显示,LRRC4通过LRR结构域调控ERK/AKT/NF-κB和JNK2/c-Jun/p53信号通路共同将U251细胞阻滞在G0/G1期,抑制细胞的增殖和侵袭。以上结果表明：LRRC4不仅是脑组织特异性基因,而且是与胶质瘤密切相关的抑瘤基因。前期研究表明：LRRC4基因虽然在原发性胶质瘤组织和多种恶性胶质瘤细胞系中表达下调甚至缺失,但其编码区并未发生突变、缺失、重排。【LRRC4基因启动子成功定位和克隆]为了揭示LRRC4基因在胶质瘤细胞和组织中表达下调的分子机制,我们开展了LRRC4基因的转录调控机制研究。采用高特异性的启动子预测软件PromoterInspector和PromoterScan对其启动子进行了预测分析,同时采用CpGplot软件对LRRC4基因5’端调控区的CpG岛进行了分析,叁者预测结果大部分重迭,综合分析我们初步锁定LRRC4基因启动子区可能位于其翻译起始位点上游2151bp至101bp以内,因此我们设计引物扩增LRRC4基因-2475/-101的调控区片段,并构建成荧光素酶报告载体pGL3--2475/-101。荧光素酶活性分析系统结果表明,pGL3--2475/-101在Cos7和Hela细胞具有与pGL3-control几乎同等活性,这一结果表明LRRC4基因-2475/-101区域内包含了LRRC4基因的启动子片段。为了进一步定位LRRC4基因的启动子片段,以pGL3--2475/-101为模板,分别在它的5’或3’端缺失部分序列,构建了一系列缺失突变体荧光素酶的报告载体,并将它们分别转染Cos7和Hela细胞中,发现-835/-293区域是LRRC4基因发挥启动子活性的必需序列,缺失这一区域LRRC4基因启动子则丧失了全部的启动活性。为了验证该结果我们又构建了pGL3-835/-293/eGFP报告载体,转染Cos7和Hela细胞,发现LRRC4基因的-835/-293区域能驱动eGFP在Cos7和Hela细胞中的表达,从另一方面证明的-835/-293区域的启动活性。总之,通过以上研究我们成功地定位和克隆了LRRC4基因的启动子。[LRRC4基因启动子在胶质瘤中呈高甲基化状态]生物信息学分析LRRC4基因的启动子序列,发现该序列不含有TATA盒和CAAT盒,GC含量高达70%左右,为一典型的CpG岛,该结果提示LRRC4基因启动子甲基化可能参与其转录调控。采用甲基化特异性PCR (MS-PCR)对2株胶质瘤细胞、30例胶质瘤组织和3例正常脑组织进行检测,结果显示在胶质瘤细胞SF767和SF126中LRRC4基因的启动子呈完全的甲基化状态,在30例胶质瘤病人组织中均呈不同程度的部分甲基化状态,而在3例正常人脑组织中则呈完全非甲基化状态。为了明确LRRC4基因的启动子序列中究竟哪些位点发生了甲基化,选取胶质瘤细胞SF767和SF126,两例胶质瘤组织及一例正常脑组织进行了亚硫酸氢钠测序,结果表明与正常的脑组织相比,在胶质瘤细胞和组织中LRRC4基因的启动子区存在高密度的甲基化位点。该结果提示LRRC4基因启动子甲基化可能为肿瘤特异性的,它有可能成为区别胶质瘤组织与正常脑组织的一个重要的分子标志物。[5-Aza-CdR能逆转LRRC4基因在胶质瘤细胞中的表达]为了弄清楚LRRC4基因启动子甲基化和其在胶质瘤中失活之间的功能上联系,采用不同浓度甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理胶质瘤细胞SF126和SF767,观察了LRRC4基因启动子甲基化改变与其表达的关系,结果表明5-Aza-CdR能逆转LRRC4基因启动子甲基化状态,并且能够上调LRRC4基因的表达水平。该结果从反面证明了启动子甲基化对LRRC4基因表达的抑制作用,另一方面也证明了LRRC4基因启动子甲基化是其在胶质瘤中表达缺失的重要分子机制。在5-Aza-CdR处理胶质瘤细胞逆转LRRC4基因表达的同时,我们还观察了5-Aza-CdR对SF126和SF767细胞增殖及细胞周期的影响,发现5-Aza-CdR对SF126和SF767细胞增殖具有明显的抑制作用,它能使胶质瘤细胞G0/G1期细胞数量明显增加,S期和G2/M期的细胞数量明显减少,从而出现G0/G1期的细胞阻滞。总之,5-Aza-CdR抑制了胶质瘤细胞SF126和SF767生长,并且逆转了LRRC4基因在胶质瘤中甲基化状态,恢复其转录活性,从而能够发挥LRRC4基因的肿瘤抑制作用,这为LRRC4基因作为胶质瘤去甲基化治疗的潜在靶标提供了科学依据。【LRRC4基因启动子甲基化抑制转录因子SP1和E2F1与其结合]为了进一步分析LRRC4基因启动子甲基化抑制其表达的分子机制,采用在线软件MatInspector分析了LRRC4基因启动子区(-835bp至-293bp)潜在的转录因子结合位点,发现该区域可能存在多种转录因子结合位点,我们选取了五个位点设计探针,进行了凝胶迁移实验(EMSA),我们只在E2F1(-655/-631)和Spl(-568/-547)两个位点检测出了特异性结合条带,说明E2F1和Sp1参与了LRRC4基因的转录调控。为了确定甲基化是否影响了E2F1和Sp1两个转录因子的结合,利用SssI甲基转移酶处理了E2F1(-655/-631)和Sp1(-568/-547)结合位点的双链寡核苷酸探针,然后进行EMSA实验,发现其特异性结合条带消失,说明DNA甲基化抑制了E2F1和Sp1两个位点与转录因子的结合。为了反映体内真实情况,我们又进行了染色质免疫共沉淀实验(CHIP),结果发现未经5-Aza-CdR处理SF126和SF767细胞,经SP1和E2F1抗体沉淀的基因组DNA中未能扩增出LRRC4基因启动子序列；5-Aza-CdR处理SF126和SF767细胞后,在经SP1和E2F1抗体沉淀的基因组DNA中却特异地扩增出LRRC4基因启动子序列。因此,LRRC4基因启动子区受转录因子SP1和E2F1的调控,胶质瘤中由于LRRC4基因启动子的甲基化,干扰转录因子SP1和E2F1与其结合,抑制了LRRC4基因的转录。[与LRRC4基因启动子甲基化相关联的组蛋白修饰]在表观遗传学机制中,DNA甲基化修饰和组蛋白修饰都不是孤立事件,它们往往相互影响、相互作用共同调控着基因表达。为了分析与LRRC4基因启动子甲基化相关联的组蛋白修饰,采用H3乙酰化抗体,H3K4叁甲基化抗体及H3K9叁甲基化抗体对5-Aza-CdR处理前后的胶质瘤细胞SF126和SF767进行了染色质免疫共沉淀实验(CHIP)。结果表明未经5-Aza-CdR处理的胶质瘤细胞,只在经H3K9叁甲基化抗体沉淀的gDNA中特异地扩增出LRRC4基因启动子区片段,而经H3乙酰化抗体和H3K4叁甲基化抗体沉淀的gDNA中却未能特异地扩增出LRRC4基因启动子区片段。在经5μM5-Aza-CdR处理胶质瘤细胞4天后,H3乙酰化抗体和H3K4叁甲基化抗体沉淀的gDNA中才特异地扩增出LRRC4基因启动子区片段,而经H3K9叁甲基化抗体沉淀的gDNA中扩增出LRRC4基因启动子区片段的强度有所减弱。说明5-Aza-CdR处理胶质瘤细胞后在LRRC4基因启动子减少甲基化H3K9的水平,同时提高乙酰化H3和甲基化H3K4的水平。因此我们得出结论：H3K9叁甲基化与LRRC4基因启动子的甲基化状态密切关联,与LRRC4基因转录抑制相关；而H3乙酰化和H3K4叁甲基化与LRRC4基因启动子的去甲基化状态密切关联,与LRRC4基因转录激活相关。第二部分脑胶质瘤DNA甲基化谱的初步构建每种类型的肿瘤都有特定的DNA甲基化模式,不同肿瘤或同一肿瘤不同发生阶段,基因组DNA上CpG岛甲基化状态的差异,构成了肿瘤特定DNA甲基化谱。胶质瘤DNA甲基化谱建立不仅有助于全面揭示胶质瘤发生发展的分子机制,更重要的是可为胶质瘤的早期诊断、治疗及预后评价等提供非常有价值的线索。目前虽然在胶质瘤的异常甲基化相关基因研究方面取得了一些进展,但大部分研究只是针对几个或一群基因采取候选基因研究方法。迄今,尚无学者对胶质瘤的DNA异常甲基化在全基因组层面上进行直接、全面系统分析。缺少高通量的筛选技术一直是阻碍基因组水平研究DNA甲基化谱系的关键因素。本研究采用最新发展的甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)结合启动子区及CpG岛芯片(NimbleGen, HG18 CpG Promoter)高通量技术对年龄、性别相匹配的6例胶质瘤病人的瘤组织(T1,T2,T3,T4,T5,T6)和4例正常人的脑组织的脑白质(N1,N2,N3,N5),进行初步筛选。在我们界定的高甲基化基因(位点)和低甲基化基因(位点)标准下,共筛选出高甲基化位点562个,其中涉及基因数325个；低甲基化位点108个,其中涉及基因数74个,它们在染色体上分布比较均匀；这些甲基化异常基因参与了细胞通讯、信号转导、细胞粘附、细胞迁移、凋亡、代谢、转运、细胞蛋白翻译后修饰及神经系统发育等广泛的生物学过程,同时还涉及多条与肿瘤发生有关的信号通路,如MAPK signaling pathway, Wnt signaling pathway, Jak-STAT signaling pathway及Cell cycle等,因此,这些甲基化异常的基因可能与胶质瘤的发生发展有着密切的关系。为了验证甲基化芯片结果,我们挑选了甲基化区域为CpG岛且位于启动子区的8个基因(ANKDD1A, SST, SIX3, GAD1, PHOX2B, HIST1H3E, PCDHA13和PCDHA8)采用MassArray检测系统在40例胶质瘤组织(包括T1,T2,T3,T4,T5,T6)、11例正常脑组织(包括N1,N2,N3,N5)及4株胶质瘤细胞系(U251、U87、SF126和SF767)进行了验证和检测。ANKDD1A,SST,HIST1H3E,PHOX2B,PCDHA13, GAD1, SIX3和PCDHA8在正常脑组织平均甲基化率分别为13.29%±2.12%,9.72%±2.42%,16.34%±4.13%,11.81%±3.76%,23.06%±4.49%,21.39%±3.13%,31.46%±4.28%和31.66%±12.77%；在胶质瘤组织中平均甲基化率分别为36.24%±23.71%,35.08%±19.44%,51.36%±21.25%,29.22%±15.13%,50.38%±19.15%,41.67%±25.56%,55.77%±21.77%和69.42%±19.49%；在胶质瘤细胞系中平均甲基化率分别为76.14%±27.99%,47.64%±31.61%,72.55%±25.49%,62.21%±16.80%,22.44%±18.00%,63.05%±20.35%,58.09%±30.00%和55.00%±21.29%。除了PCDHA13基因甲基化水平在胶质瘤细胞系与正常脑组织中无差别外(p>0.05),其他基因在胶质瘤组织和胶质瘤细胞中甲基化水平明显高于正常脑组织,且具有统计学意义(p<0.01)。而且,除了PCDHA8和PCDHA13基因外,其他基因在胶质瘤细胞细胞系中的甲基化水平明显高于胶质瘤组织,且具有统计学差异(p<0.01)。在NimbleGen启动子区及CpG岛芯片上,LRRC4基因探针覆盖区位于其翻译起始位点上游-1472bp至-2218bp一个CpG岛处,芯片筛选结果显示该区域在胶质瘤中不存在甲基化。为了进一步证实我们克隆的LRRC4基因启动子活性区(其翻译起始位点上游-835bp至-293bp)在胶质瘤中的甲基化状态,我们采用MassArray检测系统在上述40例胶质瘤组织,11例正常脑组织及4株胶质瘤细胞系进行了检测。结果显示该区域在正常脑组织、胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中平均甲基化率分别为15.47%±3.96%,38.29%±21.69%及68.57%±25.46%。LRRC4基因的启动子活性区域(-835bp至-293bp)在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中甲基化水平明显高于正常脑组织,且具有显着统计学差异(p<0.01),该结果与前一章研究结果一致。因此,我们认为LRRC4基因确实是胶质瘤中的高甲基化基因,可以归结为胶质瘤DNA高甲基化谱基因之一。总之,通过本研究筛选出了胶质瘤中异常甲基化的基因,为胶质瘤DNA甲基化谱建立奠定了基础,同时也为寻找胶质瘤的诊断、治疗或预后等分子标志物提供线索。
俞婷婷[6]2016年在《Cpn感染、全基因组DNA甲基化与肺癌发病风险的关联性研究》文中认为[目的]研究肺炎衣原体(Cpn)感染与肺癌发病风险的关联;检测Cpn阳性/阴性肺癌组织及癌旁组织全基因组DNA甲基化水平,筛选出肺癌组织中Cpn感染相关差异甲基化基因,探讨Cpn感染、DNA甲基化与肺癌间的关系。[方法]1、本研究采用以医院为基础的病例-对照研究设计,收集2012年12月至2015年7月福建医科大学附属第一医院、协和医院和南京军区福州总医院的胸外科,经病理或细胞学确诊为原发性肺癌新发病例298例;按性别、年龄(±2岁)与病例组进行频数匹配的健康对照362例。所有研究对象首次入院时,采用统一编制的调查表,面访收集研究对象的一般情况、病例情况、居住环境、吸烟史、饮酒史、饮茶史等资料。然后由该医院护士采集晨起空腹外周静脉血5 ml,离心分离血清,采用微量间接免疫荧光(MIF)法检测血清中Cpn抗体IgG,IgA。2、按年龄、性别、病理类型、肿瘤分期、疾病史、吸烟、饮酒等因素进行1:1匹配的方法,在病例组中筛选出6个Cpn阳性肺癌患者和6个Cpn阴性肺癌患者。收集术中切除的肺癌组织和癌旁组织标本,提取基因组DNA,进行重亚硫酸盐转化,应用Illumina HD 450K Infinium Methylation BeadChip分析Cpn阳性/阴性肺癌组织及癌旁组织DNA的甲基化水平,找出与Cpn感染相关差异甲基化基因,对差异甲基化基因进行非监督聚类分析和生物功能富集分析。[结果]1、对照组Cpn-IgG阳性率为51.4%,Cpn-IgA阳性率为22.4%;病例组Cpn-IgG阳性率为68.8%,Cpn-IgA阳性率为41.3%。调整人口学及相关因素后,Cpn-IgG阳性者发生肺癌的风险是Cpn-IgG阴性者的2.13倍(95%CI:1.47-3.09);Cpn-IgA阳性者发生肺癌的风险是Cpn-IgA阴性者的2.57倍(95%CI:1.72-3.82),提示Cpn感染与肺癌的发病风险密切相关。2、按性别、年龄、吸烟进行分层分析,结果发现除了女性人群Cpn感染与肺癌的关联无统计学意义(Cpn-IgG:OR=1.54,95%CI:0.81-2.96;Cpn-IgA:OR=1.87,95%CI:0.91-3.84),而在男性、吸烟、非吸烟、年龄<60岁、年龄≤60岁人群中,Cpn感染与肺癌的关联均有统计学意义,其OR值及95%CI分别为,Cpn-IgG:2.70(1.69-4.30)、2.42(1.42-4.13)、1.83(1.08-3.11)、2.09(1.29-3.40)、2.41(1.31-4.43);Cpn-IgGA:2.80(1.71-4.59)、3.49(1.91-6.40)、1.88(1.07-3.31)、2.41(1.38-4.21)、3.01(1.67-5.42)。3、分别对Cpn-IgG、IgA与吸烟、室内外环境(居住地污染、室内装修)对肺癌影响的联合作用分析,发现Cpn-IgG、IgA阳性分别与吸烟、室内外污染因素间存在联合作用。4、比较Cpn阳性肺癌患者的肺癌组织及相应癌旁组织的全基因组DNA甲基化模式,结果显示有2349个差异甲基化基因仅存在于Cpn阳性肺癌组织中而不存在相应的癌旁组织中,其中1525个基因发生异常高甲基化,824个基因发生异常低甲基化;比较Cpn阴性肺癌患者的肺癌组织及相应癌旁组织的全基因组DNA甲基化模式,结果显示有2622个差异甲基化基因仅存在于Cpn阴性肺癌组织中,不存在相应的癌旁组织中,其中1570个基因发生异常高甲基化,1052个基因发生异常低甲基化。5、综合比较分析发现肺癌组织中共有73个差异甲基化基因与Cpn感染有关。采用Gene ontology富集分析,发现这73个差异甲基化基因参与10条生物学通路,其中7条生物学通路涉及生物学过程,3条生物学通路涉及分子功能。[结论]1、肺炎衣原体感染不仅是肺癌独立的危险因子,而且可能与吸烟、室内外环境污染因素间存在协同致癌作用。2、Cpn感染可能通过改变某些基因的甲基化水平而参与肺癌的发生发展。
何丽霞[7]2010年在《CHFR基因DNA和组蛋白异常调控与喉癌发生机制研究》文中指出前言目前研究表明,恶性肿瘤的发生与发展是一个多因素、多阶段的复杂过程,涉及多种基因的功能异常。引起基因表达异常的机制有两种：一为遗传学机制即DNA结构改变。二为表遗传学机制。表遗传学是研究非DNA序列变化引起的,可遗传的基因表达的改变。肿瘤发生中的主要表遗传学改变是肿瘤抑制基因发生DNA高甲基化和染色质中的组蛋白修饰。近几年来,表遗传学改变的研究取得了长足进展,也成为喉癌临床基础研究的前沿。现在普遍认为DNA甲基化是除缺失与突变之外导致基因失活的第叁种机制,在肿瘤的发生发展中起着不可忽视的作用。肿瘤甚至可以被认为是由DNA的突变和表观遗传学的改变共同导致的,而且表观遗传学的变化在肿瘤发生中早于DNA的突变。组蛋白的甲基化作为另一种表遗传学机制,可以改变染色体的状态,进而调节基因的转录,间接导致肿瘤的发生。H3-K9甲基化可以抑制基因表达；而H3-K4甲基化则具有激活效应。H3-K9的甲基化与DNA的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用,而H3-K4的甲基化拮抗DNA甲基化所产生的基因沉默,研究表明在DNA甲基化及组蛋白甲基化之间存在着相互关系,在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。喉癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,其发病率在我国北方地区位于头颈部恶性肿瘤的第一位,在我国南方地区,仅次于鼻咽癌居于第二位；在世界范围内,居于全身恶性肿瘤的第十一位。其发病率有逐年上升的趋势,大约占新发恶性肿瘤的1%左右。近30年虽然外科技术,放化疗手段不同程度的得到提高,但是目前喉癌仍是仅有的两个五年生存率未增长的肿瘤之一。原因之一就是目前喉癌发病的分子学机制仍不清楚,早期诊断及治疗不理想。因此深入研究喉癌的发病机制,寻找早期诊断及早期治疗的新靶点非常重要。有研究表明检测特定基因甲基化状态有望为肿瘤的早期诊断提供帮助,但目前在喉癌中的研究刚刚起步,比较理想的靶基因非常少。另外一个原因可能是喉癌的治疗方面不理想,目前在我国喉癌的治疗主要是手术治疗和放射治疗,手术给患者带来很大的痛苦,远期疗效尤其是晚期患者不尽人意,从长远看,化疗联合治疗方案更能够保全器官和功能,化疗效果值得深入研究,目前去甲基化治疗已经成为全世界肿瘤研究的热点,为攻克肿瘤这一顽疾提供新的思路。CHFR基因是一个新的有丝分裂前期检查点基因。在正常组织中广泛表达,位于纺锤体组装稽查点的上游。当存在有丝分裂应激时,CHFR通路激活,通过泛素化降解Plkl(Polo-like kinase 1),Plkl调控Cdc25和’Weel激酶的磷酸化,在G2期进入M期时控制Cdc2激酶的活性,而延迟染色体凝集,使细胞周期停滞于有丝分裂早期,纺锤体不能形成,直至错误被纠正。CHFR基因如发生改变不能阻断异常细胞通过G2期进入有丝分裂中前期,从而导致细胞的恶性增殖。已有研究发现,MAD,BUB等有丝分裂检查基因在多数肿瘤中很少失活,而CHFR在胃癌,肺癌,食道癌等恶性肿瘤中因启动子区甲基化表现为失活或低表达,与肿瘤的发生关系密切,因其具有肿瘤特异性,受到越来越多的人关注,而与喉癌发生的关系及DNA甲基化和组蛋白甲基化对其的调控目前国内外未见报道。目的通过探讨喉癌组织及Hep-2人喉癌细胞系中CHFR基因表达,启动子区甲基化以及组蛋白H3-K4,H3-K9甲基化,以及5-Aza-dC及TSA对基因表达和甲基化水平的影响,从而明确其与喉癌发生发展的关系,探讨喉癌的发生分子学机制及其早期诊断及治疗靶点。材料与方法一、实验对象Hep-2人喉癌细胞系、50例喉癌患者肿瘤及15例正常粘膜。二、实验方法1、细胞培养Hep-2人喉癌细胞按常规培养于含10%胎牛血清RPMI-1640的培养液,NaHCO2浓度2g／L,青霉素G浓度100U／L,链霉素浓度100μg／L,37℃含5%CO2的湿润空气的恒温密闭式培养箱培养。2、实验分组(1)Hep-2人喉癌细胞对照组：同期培养不加药的Hep-2人喉癌细胞。实验组：①5-Aza-dC组：加5umol/L 5-Aza-dC培养72小时；②TSA组：加TSA 300 nmol培养24小时；③5-Aza-dC及TSA组：加5umol/L 5-Aza-dC培养48小时后加TSA 300nmol继续培养24小时。(2)喉癌组织标本临床病例的收集：选择2008年1月-2009年1月中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科住院的喉鳞状细胞癌患者50例(喉癌组),男44例,女6例,年龄40-74岁,平均58±9.76岁。选取其中的15例喉全切除术标本中,距离肿瘤边缘>2.0cm的粘膜组织作为对照组。按照2002年UICC喉癌分期标准将本研究的喉癌标本进行分期：早期(Ⅰ期+Ⅱ期)22例(T1N0 5例T2N0 17例),声门上型12例,声门型10例。中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)28例(T2N1 1例,T2N2 1例,T3N0 9例,T3N18例,T3N2 4例,T4N0 7例),声门上型16例,声门型12例,所有喉癌组织均经病理证实为鳞癌。术前均未经放、化疗治疗。3、引物设计MSP、实时荧光定量PCR、CHIP引物序列和反应条件见表1-3,引物由TaKaRa公合成。4、甲基化特异性PCR (MSP)法检测DNA甲基化水平分别提取喉癌细胞系,喉癌组织中DNA。紫外分光光度仪定性、定量。亚硫酸氢钠修饰DNA, Wizard DNA Clean-up Systerm(Promega)纯化。离心沉淀DNA。采用甲基化特异性PCR方法。PCR反应条件：95℃12min后,95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,45个循环,72℃再延伸7min,琼脂糖凝胶电泳,EB染色。结果经Alpha Image 2000自动成像仪成像采集数据,分析电泳结果。实验重复叁次,取其平均值进行统计分析。5、实时荧光定量PCR (Realtime fluro-genetic quantitative PCR)法检测mRNA水平用TRIzol试剂一步法分别提取喉癌细胞系,喉癌组织总RNA(按说明书进行)。按照反转录试剂盒说明将其反转录成cDNA第一链。无RNA酶的双蒸水将cDNA10倍稀释。进行荧光定量PCR扩增,由PCR反应曲线得到Ct值,以GAPDH为内参,采用2-ΔΔct方法进行相对定量。实验重复叁次,取其平均值进行统计分析。6、染色质免疫沉淀分析(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)检测组蛋白H3K9,H3K4甲基化水平收集细胞,甲醛交联组蛋白和DNA。酶切后分别加H3-K9,H3-K4甲基化抗体,免疫血清或Tris-EDTA缓冲液。收集抗体／蛋白复合物,沉淀下来的染色质通过PCR扩增检测结果。结果经Alpha Image 2000自动成像仪成像采集数据,分析电泳结果。实验重复叁次,取其平均值进行统计分析。7、Western Blot法检测CHFR蛋白、H3总蛋白、H3K9甲基化蛋白、H3K4甲基化蛋白水平提取蛋白,电泳,PVDF膜转膜,BSA封闭。分别加入CHFR, H3, H3K4甲基化、H3K9甲基化、actin兔单克隆抗体,然后加入单克隆二抗,成像,采集数据。采用条带密度值与相应actin密度值的比值作为指标进行比较,实验重复叁次,取平均值进行分析。叁、统计学处理应用SPSS17.0软件分析,mRNA表达水平定量测定结果用t检验,启动子甲基化结果用χ2检验(Fisher,精确概率法),mRNA的表达和临床病理参数的关系采用t检验,甲基化和临床病理参数的关系采用χ2检验。Western印迹的蛋白结果应用χ2检验统计,P<0.05,认为差异具有统计学意义。结果1、喉癌组织中CHFR基因启动子区甲基化情况在喉癌组织中,正常对照组未发现CHFR基因启动子区甲基化,在喉癌组中CHFR基因启动子区甲基化率为22%(11／50),两者相比,差异显着,有统计学意义(P<0.01)。其中T1+T2期10例,T3期1例,T4期未发现甲基化,T1+T2期甲基化率(41.6%1／24)明显高于T3+T4期(3.8%1／26),甲基化程度在临床T分期方面具有统计学意义P<0.01(x2=7.50)。而在年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、病理分化和有无淋巴结转移方面无统计学意义(P>0.05)。2、喉癌组织中CHFR基因mRNA表达CHFR基因在对照组mRNA全部表达。在喉癌组mRNA有2例表达缺失(4%),48例表达量明显下调,有统计学意义(P<0.01)。50例喉癌组织中,T1+T2期CHFR基因mRNA相对表达量0.29±0.18,T3+T4期相对表达量0.69±0.15,前者明显低于后者,两者差异有统计学意义(P<0.01),在不同的性别、年龄、肿瘤位置、分化程度和有无淋巴结转移方面CHFR基因mRNA水平没有统计学差异(P>0.05)。甲基化组CHFR基因mRNA表达量为0.16±0.13,非甲基化组mRNA表达量为0.65±0.17,前者明显低于后者,二者有密切关系。(P<0.05)。3、在Hep-2人喉癌细胞系中5-Aza-dC和TSA处理前后CHFR基因CHFR启动子区甲基化情况在Hep-2人喉癌细胞系中,CHFR启动子区表现为高甲基化,5-Aza-dC作用后DNA甲基化程度减弱,出现半甲基化,TSA作用后DNA甲基化程度无明显变化。联合使用5-Aza-dC+TSA后DNA甲基化程度明显减弱。4、在Hep-2人喉癌细胞系中5-Aza-dC和TSA处理前后CHFR基因mRNA表达情况同对照组比较,用5-Aza-dC作用后CHFR基因mRNA表达量上调(1.75±0.21)。用TSA作用后mRNA表达量(1.05±0.13)无明显变化。联合使用5-Aza-dC+TSA后mRNA表达量明显上调(2.15±0.18)5、在Hep-2人喉癌细胞系中CHFR基因启动子区组蛋白H3-K4甲基化,组蛋白H3-K9甲基化情况及与DNA甲基化的关系在Hep-2人喉癌细胞系中,CHFR基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA甲基化正相关,而组蛋白H3K4甲基化与DNA的甲基化负相关。基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA的甲基化在基因的表达下调机制中具有协同作用,而组蛋白H3K4甲基化拮抗DNA甲基化所产生的基因表达下调。6、在Hep-2人喉癌细胞系中,5-Aza-dC和TSA处理前后的CHFR基因启动子区域组蛋白H3K9甲基化、H3K4甲基化状态分析(1) 5-Aza-dC对启动子区域H3K9甲基化有明显作用,5-Aza-dC明显降低启动子区H3K9甲基化程度,TSA对启动子区甲基化无影响,联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。(2)5-Aza-dC对启动子区域H3K4甲基化的作用与对启动子区域H3K9甲基化的作用恰好相反,5-Aza-dC明显提高启动子区H3K4甲基化程度,TSA对启动子区域H3K4甲基化无影响,联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。7、Western Blot法分析喉癌组织中CHFR蛋白表达喉癌组46.0%(23／50)的喉鳞状细胞癌未检测到CHFR蛋白表达；所有黏膜均有CHFR蛋白表达。β-actin蛋白在喉鳞癌和正常黏膜中表达水平相似。CHFR蛋白表达水平的差异有统计学意义(χ2=13.85；P<0.001)8、Western Blot法分析5-Aza-dC和TSA处理前后Hep-2人喉癌细胞系中CHFR蛋白,H3蛋白,甲基化组蛋白H3-K9,甲基化组蛋白H3-K4表达5-Aza-dC作用后,CHFR蛋白表达量能明显增加,TSA对CHFR蛋白表达无明显影响,联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。5-Aza-dC及TSA作用后甲基化H3K9蛋白,甲基化H3K4蛋白,总H3蛋白无明显变化。结论1、在喉癌组织中抑癌基因CHFR启动子区CpG岛过甲基化与mRNA和蛋白表达缺失或下调有关,可能与喉癌的发生发展有关,与临床T分期的关系可能更为密切,检测其甲基化状态可有助于喉癌早期诊断。2、在Hep-2人喉癌细胞系中甲基转移酶抑制剂能够逆转抑癌基因CHFR启动子区甲基化状态,同时mRNA和蛋白表达上调,为临床治疗喉癌提供新思路。3、在Hep-2人喉癌细胞系中抑癌基因CHFR基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA甲基化在其基因转录调控中呈正相关,而组蛋白H3K4甲基化与DNA的甲基化呈负相关。DNA甲基化与组蛋白H3-K9甲基化在其基因表达缺失或下调中起协调作用,而DNA甲基化与组蛋白H3-K4甲基化起拮抗作用。4、在Hep-2人喉癌细胞系中甲基转移酶抑制剂能明显影响抑癌基因CHFR启动子区组蛋白H3K9甲基化和H3K4甲基化程度,而组蛋白脱乙酰基抑制剂对启动子区甲基化无明显影响。
王雪玮, 史卫红, 王熙才[8]2017年在《DNA甲基化在肿瘤中的调控机制及其在肺癌中的研究进展》文中认为表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等,DNA甲基化成为表观遗传学肿瘤研究的热点。DNA甲基化在基因的转录和转录后调控、miRNA基因表达调控和长链非编码RNA的转录后调控中发挥着关键作用,与肿瘤发生密切相关。DNA甲基化与miRNA在肿瘤中相互作用,两者之间存在反馈调节。PR结构域蛋白(PRDI-BF1 and RIZ homology domain containing protein,PRDM)基因甲基化在肺癌中发挥重要作用,P16、RASSF1A、FHIT等基因甲基化与肺癌密切相关;EGFR甲基化、miRNA启动子区的甲基化,长链非编码RNAHOTAIR、TUG1等调控下游靶基因启动子区的甲基化均与肺癌密切相关。
毕婧[9]2012年在《肺癌RASSF10基因启动子甲基化的研究》文中研究说明目的：肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织（WorldHealth Organization, WHO）公布的资料显示，肺癌的发病率和死亡率在世界各国呈明显上升的趋势。对于早期肺癌的治疗，首选外科手术切除，但约60%左右的患者在就诊时就已发生远处转移，从而无法进行手术。尽管应用手术切除、放疗、化疗和生物治疗等多种综合治疗措施，但非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）的5年生存率未见明显提高。肺癌的发生是多病因、多途径共同参与和长期发展的复杂过程，其中包括环境因素影响、吸烟、家族遗传等，而基因异常改变则是最关键的因素。大量研究结果显示，抑癌基因表达下调或者缺失在肺癌的发生发展中发挥着极为重要的作用。DNA启动子区域CpG岛异常高甲基化，是抑癌基因表达失活的重要机制。因此，从表观遗传学角度出发，研究抑癌基因的启动子甲基化，探讨肿瘤发生、发展机制，并寻找有效的治疗靶点成为目前研究肿瘤发病机制的难点和热点。RAS相关结构域家族基因-10（Ras association domain family10, RASSF10）是近几年发现的一个新型抑癌基因，在儿童急性白血病、甲状腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤中表达异常，并有研究显示RASSF10基因与神经胶质瘤的预后有重要关系。但目前尚无研究结果显示RASSF10在肺癌中存在异常表达或DNA甲基化。本研究旨在分析RASSF10基因启动子甲基化在肺癌细胞株中的甲基化情况，并探讨去甲基化药物对RASSF10表达的影响及对细胞增殖、凋亡的影响，为研究肺癌发病机制提供新的理论依据和新的治疗靶点。方法：本实验采用亚硫酸氢盐修饰结合限制性内切酶分析法（CombinedBisulfite Restriction Analysis，COBRA）检测RASSF10基因在多种人肺癌细胞系（腺癌A549、NCI-H157、SPCA-1、大细胞癌NCI-H460、小细胞癌NCI-H446、鳞癌QG56）中RASSF10基因的启动子甲基化状况；应用不同浓度梯度的甲基转移酶抑制剂5-aza-dC(5-aza-2-deoxycytidine)处理甲基化阳性的细胞株，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同浓度药物对细胞中RASSF10基因mRNA表达的影响；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖活性；流式细胞仪检测细胞凋亡，运用统计学软件SPSS17.0对数据进行统计学分析。结果：1.COBRA分析法从67%（4/6）的人肺癌细胞株中检测到RASSF10启动子甲基化。其中SPCA-1细胞株为完全甲基化， H446、H157、H460细胞株为部分甲基化。2.5-aza-dC处理肺癌细胞株SPCA-1、H446后，RASSF10mRNA恢复表达或表达上调；MTT结果显示细胞存活率与药物浓度和作用时间呈负相关；流式细胞仪证实：与对照组相比，不同浓度的5-aza-dC处理细胞72h后，H446组的凋亡率从0.23%±0.10分别增长到15.09%±0.26和34.9%±0.32，SPCA-1组的凋亡率从0.77%±0.10，分别增长到为14.82%±0.23和35.4%±0.30。以上结果不同种系细胞组别之间无明显差异，实验组间差异具有统计学意义（p<0.05）。结论：1.首次发现新型抑癌基因RASSF10在人肺癌细胞系中发生了启动子甲基化；2.去甲基化药物5-aza-dC能有效恢复RASSF10mRNA的表达，RASSF10mRNA表达降低与其启动子甲基化有关；3.去甲基化药物5-aza-dC能抑制人肺癌细胞系H446、SPCA-1细胞体外生长、诱导细胞凋亡。
张笑[10]2016年在《柴油机尾气暴露所致DNA甲基化改变及其与微核组学指标间的关联性研究》文中指出近些年来,空气污染物对机体造成的健康危害越来越为公众所关注。在众多空气污染物中,颗粒物与不良健康效应的关系最为密切,而且先前的研究提示细颗粒物相较于粗颗粒物可能对人体的健康危害更大。柴油发动机尾气(Diesel engine exhaust, DEE)是空气中细颗粒物的主要来源之一。鉴于柴油发动机在市区的广泛应用,大量的城市居民已经成为DEE最主要的暴露人群。此外,许多职业人群如矿工、卡车司机也会在工作环境中暴露于DEE。流行病学研究表明长期暴露于DEE与肺癌发生风险增高间存在关联。遗传损伤被认为是癌症引发阶段的关键分子事件。胞质阻滞微核试验(Cytokinesis-block micronucleus assay, CBMN)常被用来评价暴露于遗传毒物后机体内的遗传损伤程度,它可以测定外周血淋巴细胞微核(Micronucleus, MN)、核质桥(Nucleoplasmic bridge, NPB)、核芽(Nuclear bud, NBUD)率等指标。虽然已有人群研究报道过DEE暴露可以引起MN率发生改变,但是由于存在混合暴露的问题,DEE暴露与微核组学指标改变间的关系尚不完全清楚。此外,DEE诱导遗传毒效应通路中和遗传毒效应发生后机体应答通路中的调控模式仍然不清楚。表观遗传是指不涉及DNA序列并且可以遗传的基因表达的改变。越来越多的研究表明表观遗传修饰改变作为一种新的调控基因表达的机制在环境暴露-毒效应-机体应答这一连续模式中发挥着重要的作用。一方面,特异的表观遗传修饰改变可以反映机体接触环境暴露的程度。另一方面,表观遗传修饰改变能够参与或者响应环境暴露引起的遗传毒效应。因此,表观遗传修饰不仅可能作为介导环境暴露与癌症风险间关联的生物学机制,还可能作为环境暴露和遗传损伤的生物标志物。DNA甲基化是迄今为止研究最为深入的一种表观遗传修饰,它指的是CpG位点的胞嘧啶末端共价结合甲基形成5-甲基胞嘧啶。一般情况下,DNA甲基化的发生与基因沉默有关。DNA损伤应答(DNA damage response, DDR)相关基因和重复序列的甲基化状态对于维持基因组的稳定性十分重要。有研究在肺癌患者中发现DDR相关基因和重复序列发生了异常甲基化改变。近年来,关于DEE暴露和DNA甲基化改变的人群研究逐渐增多,已有研究在哮喘患者中发现短期暴露于DEE可以引起蛋白激酶和核因子kB通路中基因的甲基化水平发生改变。然而仍然有许多关键的科学问题亟待解决,比如长期暴露于DEE能否引起DDR相关基因和重复序列的甲基化水平发生改变,这些甲基化水平改变反过来是否与DEE暴露导致的遗传毒效应间存在关联。为了解决以上科学问题,本研究选取了117名暴露于单纯DEE的柴油机试车工人和112名非DEE暴露工人,以DDR相关基因和重复序列甲基化为切入点,结合微核组学指标,探讨DEE暴露、DNA甲基化、遗传毒效应叁者间的关联。一.DEE的成分解析与表征分别用扫描电迁移率粒径谱仪和碳分析仪测定了DEE颗粒相的粒径分布及元素碳和有机碳的含量,用气相色谱质谱仪测定了DEE颗粒相和工人个体暴露样本中多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)的含量,用便携式气相色谱质谱仪测定了DEE气相有机物的浓度,用被动采气管测定了DEE气相二氧化氮和二氧化硫的浓度,用高效液相色谱质谱测定了工人尿中6种羟基多环芳烃(Mono-hydroxylated PAHs, OH-PAHs)的浓度。结果表明84.3%的DEE颗粒为100nm以下。元素碳和有机碳分别占细颗粒物的百分比平均为28.6±6.3%和36.2±6.5%,有机碳／元素碳平均为1.31±0.31。致癌性PAHs和非致癌性PAHs分别占总PAHs的83.3%和16.7%。DEE气相有机物主要包括链烃及其衍生物、环烷烃衍生物、苯及其衍生物。元素碳与有机碳呈显着正相关(r=0.630,P=0.002),与二氧化氮和二氧化硫呈临界显着正相关(r=0.370,P=0.090和r=0.385,P=0.077)。DEE暴露工人对萘、芴、菲、芘四种PAHs的个体暴露水平及尿中总羟基萘、二羟基芴、总羟基菲、一羟基芘的浓度均高于非DEE暴露工人,差异具有统计学意义(P<0.001)。二.DEE暴露与DNA甲基化间的关联性研究用焦磷酸测序的方法测定了工人外周血淋巴细胞叁个DDR相关基因(p16、RASSF1A、MGMT)和LINE-1重复序列的甲基化水平。结果表明DEE暴露工人较非DEE暴露工人p16、RASSFIA、MGMT基因甲基化水平降低,差异具有统计学意义(P<0.001),并未发现LINE-1甲基化水平在两组间具有显着差异。随着尿总OH-PAHs浓度的增高,p16、RASSF1A、MGMT基因甲基化水平呈显着降低的趋势(Ptrend分别为0.018、0.006、<0.001)。非吸烟工人中,在校正了混杂因素的影响后,尿总OH-PAHs浓度每上升一个四分位间距,p16、RASSF1A、 MGMT基因经logit转换后的甲基化水平平均改变分别为-0.13、-0.18、-0.19。DEE暴露工人中,DEE暴露时长与p16、RASSF1A基因甲基化水平呈显着正相关(r=0.293,P=0.001和r=0.409,P<0.001)。与溶剂对照组相比,DEE提取物处理组原代淋巴细胞p16、RASSF1A、MGMT基因甲基化水平改变方向大体与人群研究结果一致。叁.DEE暴露与微核组学指标间的关联性研究用CBMN法测定了工人外周血淋巴细胞MN、NPB、NBUD率并求得叁者之和计算出基因组不稳定指数。用基因组不稳定指数加上本课题组先前报道的凋亡率和坏死率计算出微核组学指数。结果表明DEE暴露工人较非DEE暴露工人MN、NPB、NBUD率、基因组不稳定指数、微核组学指数升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。随着尿总OH-PAHs浓度的增高,MN、NPB、NBUD率、基因组不稳定指数、微核组学指数呈显着升高的趋势(Ptrend<0.001)。非吸烟工人中,在校正了混杂因素的影响后,尿总OH-PAHs浓度每上升一个四分位间距,MN、NPB、NBUD率、基因组不稳定指数、微核组学指数平均变化百分比分别为93.48%、467.46%、160.39%、128.64%、121.22%。DEE暴露工人中,在校正了混杂因素的影响后,尿总OH-PAHs浓度每上升一个四分位间距,MN和微核组学指数平均变化百分比分别为38.13%和27.63%。四.DEE暴露、DNA甲基化、DNA损伤指标、微核组学指标的相互关系用因子分析、相关分析、中介效应分析、交互作用分析等方法探讨了本研究所测指标及本课题组先前报道的DNA链损伤指标[外周血淋巴细胞Olive尾距(Olive tail moment, OTM)]和DNA氧化损伤指标[尿1,N6-乙烯基脱氧腺苷(1,N6-ethenodeoxyadenosine, εdA)和3,N4-乙烯基脱氧胞苷(3,N4-ethenodeoxycytidine, εdC)]间的相互关系。结果表明p16、RASSF1A、 MGMT基因甲基化与εdA间呈显着负相关(r=-0.187,P=-0.008；r=-0.177,P=0.013;r=-0.251,P<0.001),与OTM间呈显着负相关(r=-0.300,P<0.001；r=-0.305,P<0.001；r=-0.311,P<0.001),与基因组不稳定指数间呈显着负相关(r=-0.183,P=0.007; r=-0.212, F=0.002; r=-0.244, P<0.001)。p16和RASSFIA基因甲基化与核分裂指数间呈显着正相关(r=0.220,P=0.001;r=0.225, P=0.001)。OTM和基因组不稳定指数分别对核分裂指数效应的24.9%和6.1%可以被p16甲基化所介导,26.1%和6.6%可以被RASSFIA甲基化所介导。非吸烟工人中,自然对数转换后的尿总OH-PAHs每上升一个单位,LINE-1甲基化水平<85.6%和≥85.6%的工人基因组不稳定指数平均变化百分比分别为64.38%和45.50%(Pinteraction=0.016)。基因组不稳定指数与εdA和OTM间呈显着正相关(r=0.204,P=0.004;r=0.353,P<0.001)。用尿总OH-PAHs和εdA的第一和第四分位数作为分界分别判定DEE暴露水平高低和遗传损伤大小时,MGMT甲基化对应的曲线下面积分别为0.758和0.711。用OTM的第一分位数和第四分位数作为分界判定遗传损伤大小时,p16和RASSFIA甲基化对应的曲线下面积分别为0.705和0.724。结论1)DEE颗粒的粒径大小大多属于超细颗粒物的范畴,其上吸附的PAHs主要是致癌性PAHs。DEE气相有机组分主要包括链烃、苯及它们的衍生物。元素碳与其它DEE主要组分间呈显着或临界显着正相关。DEE暴露工人较非DEE暴露工人尿OH-PAHs浓度显着增高。随着DEE暴露工人对PAHs个体暴露水平的增高,其尿中相应PAHs代谢产物的浓度也随之增高。2)DEE暴露可以引起外周血淋巴细胞p16、RASS1F、MGMT基因发生低甲基化改变。DEE暴露与p16、RASSFIA、MGMT基因甲基化水平间呈显着负关联。DEE暴露时长与p16、RASSFIA基因甲基化水平间呈显着正相关。MGMT基因甲基化水平可以作为DEE暴露水平的生物标志物。3)DEE暴露可以导致外周血淋巴细胞MN、NPB、NBUD率、基因组不稳定指数、微核组学指数增高。DEE暴露与MN、NPB.NBUD率、基因组不稳定指数、微核组学指数呈显着正关联。DEE暴露水平与MN率和微核组学指数间呈显着正关联。4) εdA、OTM、基因组不稳定指数与p16、RASSF1A、MGMT基因甲基化水平间呈显着负相关。εdA和OTM与基因组不稳定指数间呈显着正相关。p16和RASSFIA以及MGMT基因甲基化水平可以分别作为DEE暴露所致OTM、εdA水平的生物标志物。5)p16和RASSF1A基因甲基化可以介导OTM和基因组不稳定指数与核分裂指数间的关联,LINE-1甲基化可以修饰DEE暴露与基因组不稳定指数间的关联。
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