李荔霞[1]2000年在《CEA分泌性肿瘤微转移检测方法的建立及其临床意义》文中提出建立一种外周血循环中CEA分泌性肿瘤微转移检测的方法，并研究其临床意义。首先分离外周血有核细胞，进行细胞总RNA的快速抽提。以抽提出的RNA为模板，分别以引物①、②进行逆转录得到cDNA，再以其为模板进行PCR扩增，得到特定的CEA DNA片段。5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析逆转录PCR产物，并进行限制性内切酶酶切分析及DNA序列测定。结果：外周血有核细胞总RNA OD260/280值为1.5～1.8，电泳鉴定为28S、18S RNA。逆转录PCR产物经电泳分析其分子量大小分别为131bp及338bp。前者经酶切后得到59bp和72bp两个片段。两种PCR阳性产物经DNA测序，均与文献报道一致。46例CEA分泌性肿瘤检测CEA mRNA阳性25例（54.35％），对照组中有1例检出CEA mRNA。CEA分泌性肿瘤病人中，临床有远处转移组CEA mRNA阳性率明显高于无远处转移组（P＜0.005）。对无远处转移而CEA mRNA阳性的病人随访半年，3例出现远处转移，提示CEA mRNA的RT-PCR检测可作为预测肿瘤早期转移的指标之一。CEA mRNA阳性率与肿瘤的临床分期成正相关（P＜0.005），而与年龄、血清CEA水平无显著关系（P＞0.05）。术前CEA mRNA阴性，术后转为阳性的有2例，可能与手术操作导致肿瘤细胞入血有关。
佚名[2]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中提出14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显著差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
韦露薇[3]2008年在《乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移关系的相关研究》文中提出卵巢癌死亡率在妇科肿瘤中居首位。尽管肿瘤减灭术及以铂类为基础的联合化疗在卵巢癌的治疗中起到了积极的作用,但因缺乏有效的早期诊断方法,70%的患者初诊时已为晚期患者。手术及化疗后复发率高、易出现耐药,因而患者的5年生存率长期停留在30%左右。乙酰肝素酶(Hpa)通过降解细胞外基质(ECM)在肿瘤的侵袭和转移中起了关键性的作用。因此,本课题探讨Hpa表达与卵巢恶性肿瘤发生、发展、转移及其预后价值。卵巢肿瘤组织中乙酰肝素酶mRNA表达与其临床病理的关系目的:探讨乙酰肝素酶(Hpa)mRNA在卵巢癌中的表达及与其临床病理的相关性。方法:应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测49例卵巢恶性肿瘤患者,23例卵巢良性肿瘤患者,22例正常卵巢组织中Hpa的mRNA表达,并分析其与卵巢癌临床病理相关性。结果:(1)恶性卵巢组织中Hpa mRNA阳性表达率为57.14%,良性组织Hpa mRNA阳性率为26.09%,正常组织Hpa mRNA阳性率为22.73%。癌组织Hpa mRNA阳性表达率显著高于良性组及正常组(P＜0.01)。良性组与正常组之间Hpa mRNA阳性表达率相比较,差异无显著性(P＞0.05)。(2)Ⅲ-Ⅳ期卵巢恶性肿瘤患者中Hpa mRNA的阳性表达率显著高于Ⅰ-Ⅱ期患者(P＜0.05)。低分化肿瘤组织中Hpa mRNA的阳性表达率显著高于中、高分化者(P＜0.05)。(3)Long-rank分析显示Hpa mRNA表达阳性者的累积生存率明显低于阴性者,相比较差异有显著性(P＜0.05)。经Cox模型多因素生存分析,Hpa及腹水量多少可作为卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:卵巢癌中Hpa mRNA阳性表达率明显增高,并与卵巢癌病情进展有关,可作为卵巢癌预测转移和预后的一个重要指标。卵巢肿瘤组织中乙酰肝素酶蛋白表达与其临床病理的关系目的:探讨Hpa蛋白在卵巢癌中的表达及与其临床病理的相关性。方法:应用SABC免疫组织方法检测50例卵巢恶性肿瘤患者,20例卵巢良性肿瘤患者,20例正常卵巢组织中Hpa蛋白的表达。并同时分析Hpa与恶性卵巢肿瘤组织学类型、分化程度、FIGO分期、腹水、淋巴结转移等临床病理因素的关系。并进行单因素生存分析及Cox回归模型分析。结果:恶性卵巢组织中Hpa蛋白阳性表达率为80%,显著高于良性组(30%)及正常组(20%),差异均有显著性,P＜0.05。良性组与正常组之间Hpa mRNA阳性表达率相比较,差异无显著性(P＞0.05);在卵巢恶性肿瘤中,Hpa蛋白的表达与恶性肿瘤组织学来源、FIGO分期、腹水的多少、有无肝、大网膜转移无关;与病理分化程度、术后残余灶、有无淋巴结转移有关。低分化肿瘤组织中Hpa蛋白阳性表达率显著高于高、中分化者,比较差异有显著性(P＜0.05);淋巴结转移组Hpa蛋白阳性表达率为85.71%,明显高于淋巴结阴性组72.41%,差异有显著性;残余灶＞2cm肿瘤组织中Hpa蛋白阳性率显著高于残余灶＜2cm者,差异亦有显著性(P＜0.05);经Cox模型多因素生存分析,大网膜有无转移可作为卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:Hpa蛋白在卵巢恶性肿瘤组织中的表达增加,并与卵巢癌病情进展有关,可作为卵巢癌预测转移和预后的一个重要指标。卵巢肿瘤患者外周血乙酰肝素酶测定及临床价值目的:探讨卵巢肿瘤患者外周血乙酰肝素酶的表达及与其临床病理的相关性。方法:采用ELISA酶联免疫吸附法检测了51例卵巢恶性肿瘤、17例卵巢良性肿瘤及16例正常对照的血清中Hpa的表达和10例卵巢恶性肿瘤患者术前、术后血清中Hpa的表达。将结果与临床及病理资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox回归模型分析。结果:恶性卵巢肿瘤患者血中Hpa的表达显著高于良性组及正常对照组,差异有显著性p＜0.05);同一患者术前、术后血清Hpa的表达亦有显著性(P＜0.05);在恶性卵巢肿瘤患者血清中,Hpa的表达与肿瘤的临床分期、病理分化程度、腹水量和有无肝转移有关,与组织学类型、有无淋巴结、大网膜转移无关;相关分析显示Hpa与CA125呈正相关(r=0.293,P=0.015);即随Hpa含量增高,CA125含量亦增高。结论:Hpa的表达与卵巢恶性肿瘤的发生,发展有关,并与恶性肿瘤的浸润转移有关。认为Hpa有望在临床上成为判断侵袭、转移的指标之一。
李荔霞, 王晓怀, 郑文岭, 王捷, 林金容[4]2001年在《癌胚抗原分泌性肿瘤患者外周血中癌胚抗原mRNA的表达》文中研究说明目的观察外周血中癌胚抗原（ＣＥＡ）分泌性肿瘤标志基因的表达。方法设计特异的引物，用逆转录ＰＣＲ方法检 测正常人及肿瘤病人外周血有核细胞成分中的 ＣＥＡ ｍＲＮＡ。结果 ４６例肿瘤患者中有 ２５例检出 ＣＥＡ ｍＲＮＡ，阳性率 为５４．３５％；正常对照者 １２例均阴性。肿瘤临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的患者血清ＣＥＡｍＲＮＡ检出率明显高于Ⅰ、Ⅱ期的病人 （Ｐ＜０．０５）。 ＣＥＡ ｍＲＮＡ阳性率与血清 ＣＥＡ水平无显著性关系（Ｐ＜０．０５）。临床有远处转移者 ＣＥＡ ｍＲＮＡ阳性率明显高 于无远处转移者（Ｐ＜０．０５）。对临床无远处转移征兆，而 ＣＥＡ ｍＲＮＡ检测阳性的 １２例患者进行半年的随访，３例出现脏 器的转移。结论外周血标志基因检测是肿瘤微转移检测的灵敏方法。ＣＥＡｍＲＮＡ阳性率与肿瘤临床分期正相关，与肿 瘤的远处转移密切相关，而与血清ＣＥＡ水平无显著性关系。血中标志基因阳性可能提示肿瘤的早期转移。
史芸[5]2004年在《结直肠癌外周血癌胚抗原mRNA的表达及临床意义》文中研究说明目的：结直肠癌为我国发病率较高的恶性肿瘤之一，尽管结直肠癌在手术、化疗、放疗、免疫和生物等各种治疗方法上有了很大提高，但遗憾的是仍然有30-50％的患者出现复发和转移，为此，人们不断寻找着一种监测评估微转移和病情发展的特异性强敏感性高的指标。基因检测具有高度敏感性、特异性，被认为是目前检测微转移的最敏感的方法。目前国内外基础和临床研究常将CEA mRNA作为血液循环中消化道癌细胞的靶基因。本实验采用RT-PCR的方法检测CEA mRNA在结直肠癌、结肠息肉、正常人群中的表达，并探讨其在结直肠癌诊断与治疗中的意义。 方法：收取了海军401医院普外科及肿瘤科自2002年10月至2003年12月收治的结直肠癌患者60例，采集外周血样本。同期取结肠息肉患者40例。正常对照40例，为健康献血者。结直肠癌组男性35例，女性25例，年龄35-80岁，中位年龄58岁。临床分期按Dukes标准分期：其中Dukes A期10例(16.7％)，Dukes B期19例(31.7％)，Dukes C期16例(26.7％)，Dukes D期15例(25.0％)。其中结直肠癌伴肝转移9例。结肠息肉组，男性22例，女性18例，年龄25-75岁，中位年龄42岁。健康对照组，男性20例，女性20例，年龄25-50岁，中位年龄35岁。分别用逆转录-PCR(RT-PCR)法检测其外周血中CEA mRNA的表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其血清CEA蛋白的含量。所有数据使用SAS6.04统计软件包进行分析。计数资料用X~2分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：cDNA PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳在紫外数字成像仪下观察结果并成像，CEA mRNA的阳性扩增条带为300bp。CEA正常值0～5ng／ml，超过5ng／ml为阳性。60例结直肠癌患者CEA mRNA阳性率为68.3％，健康对照组有1中文摘要例呈弱阳性，两者比较有显著性差异(P<0.001);40例结肠息肉患者CEA mRNA仅3例阳性。CEA mRNA阳性表达率在DukeSC+D期患者明显高于DukeSA+B期。外周血CEA mRNA的表达与其它病理因素无明显关系。CEA mRNA阳性表达与肝转移密切相关。 结论:外周血细胞中CEA mRNA的表达与肿瘤分期及肝转移相关，有可能作为结直肠癌转移的一个辅助监测指标。
杨莹珠[6]2009年在《趋化因子配体18基因与卵巢肿瘤的关系研究》文中研究说明卵巢恶性肿瘤以其发病隐匿、症状不明显、进展迅速、早期发现率低以及生物学特性错综复杂,加之术后易复发,5年生存率徘徊在25%至30%,而成为目前女性生殖器恶性肿瘤中威胁最大的疾病。目前CA125在临床上得到广泛应用,但临床实践表明单一指标对于早期卵巢癌的诊断特异性、敏感性仅能达到25～30%,各种新的肿瘤标志物仍然无法替代CA125的诊断效果。而各种影像学检查和外科手术存在费用高、创伤大等缺点,对于早期卵巢恶性肿瘤妇女诊断率低。故寻找一种更加可信的肿瘤标志物,以提高临床早期诊断率,改善患者预后已成为急需。趋化因子配体18是一种炎性趋化性小分子分泌蛋白,但新近的研究表明,CCL18可以起着局部抗肿瘤免疫调节因子的作用,从而影响肿瘤的浸润、转移等生物学行为及患者的预后。本研究是在课题组先期使用表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)结合IMAC-Cu和WCX-2蛋白质芯片分析卵巢恶性肿瘤患者与卵巢良性病变患者和健康人血清差异蛋白表达谱,筛选出31个潜在血清标志物蛋白,其中被鉴定为CCL18的标志蛋白对卵巢恶性肿瘤临床判断具有重要意义的基础上,进一步探讨趋化因子配体18在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其在卵巢恶性肿瘤的发生发展中的作用。本研究通过分子生物学技术及体外细胞实验对CCL18与人卵巢癌的发生发展的关系进行了研究,取得以下学术进展:1、通过用实时荧光定量PCR的方法检测31例卵巢恶性肿瘤组织、14例良性卵巢肿瘤组织及14例正常卵巢组织中CCL18的表达量,发现CCL18在卵巢恶性肿瘤组织中的阳性表达率和表达量明显高于良性和正常卵巢组织(p＜0.05);分析CCL18的表达量与卵巢恶性肿瘤的临床病理及预后联系,结果均无明显相关。2、通过基因工程技术,构建PET SUMO-CCL18原核表达质粒,并表达、纯化获得趋化因子配体18的重组成熟肽段。进一步将此肽段作为标准品,使用LCM联合免疫磁珠及MALDI-TOF检测不同卵巢上皮细胞中CCL18蛋白表达情况,发现卵巢恶性肿瘤上皮细胞确实表达CCL18蛋白,且表达阳性率高(9/10),良性卵巢上皮细胞中CCL18表达率50%,正常卵巢上皮细胞无明显CCL18蛋白表达。3、检测各种体外培养的卵巢上皮癌细胞株发现有CCL18基因的表达。构建CCL18真核表达载体,并通过体外实验了解CCL18过表达对卵巢癌细胞浸润转移过程中的作用。流式细胞仪检测显示SKOV_3-CCL18组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为32.8%,较对照组明显增加(p＜0.05);CCL18组和对照组的生长曲线无明显区别;SKOV_3细胞在转染前后的侵袭能力、粘附能力及迁移能力均有明显增加(p＜0.05)。4、构建CCL18的RNAi真核载体,转染卵巢上皮癌细胞株SKOV_3后测定细胞功能,细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间无明显变化;干扰组细胞周期中处于增殖状态(S+G2+M)的细胞明显减少;侵袭、迁移、粘附实验均发现干扰组细胞有明显降低,差异有统计学意义(p＜0.05)。总之,本研究在体外培养的卵巢上皮癌细胞及冰冻切片的卵巢上皮癌细胞中均发现有CCL18表达,且其在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于卵巢良性肿瘤及正常卵巢,体外细胞学实验表明CCL18对卵巢上皮癌细胞的浸润转移也有明显相关。表明CCL18有潜力成为卵巢上皮癌的早期诊断标志物和分子靶点。
姚舒洋[7]2005年在《LUNX mRNA、CK19 mRNA、CEA mRNA在非小细胞肺癌患者淋巴结及外周血微转移中的比较研究》文中认为目的:应用RT—PCR法检测LUNX mRNA、CK19 mRNA、CEA mRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)患者区域性淋巴结及外周血中的表达情况并进行比较分析,探讨它们在NSCLC发生、转移及预后中的意义。 方法:NSCLC患者56例,均行手术切除肿瘤,术前抽取外周血。对照组:①阳性对照:Ⅳ期NSCLC患者20例,取外周血;②阴性对照70例,包括:Ⅳ期非肺癌恶性肿瘤患者30例,肺良性疾病患者15例,健康志愿者20例,均抽取外周血。56例肺癌患者术中切取部分肺癌组织和以气管旁淋巴结为主的区域性淋巴结103枚;15例肺良性疾病患者术中切取局部淋巴结35枚。以上血液和组织标本均通过逆转录-聚合酶链反应(Reserve TranscriDtase-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测其LUNX mRNA和CK19 mRNA的表达情况,以巢式逆转录-聚合酶链反应法(nested RT-PCR)检测CEA mRNA的表达,并对其进行半定量分析。另外,所有淋巴结标本均行HE染色病理组织学检查,观察转移情况。 结果:①56例NSCLC患者肺癌组织LUNX mRNA、CK19 mRNA、CEA mRNA的阳性表达率分别为100%(56/56)、96.4%(54/56)和89.2%(48/56);②76例NSCLC患者外周血标本中LUNX mRNA的阳性表达率为55.3%(42/76),CK19 mRNA为42.1%(32/76),CEA mRNA为56.6%(43/76);30例Ⅳ期非肺癌恶性肿瘤患者外周血的LUNX mRNA表达率为0(0/30),CK19 mRNA为23.3%(7/30),CEA mRNA为40.0%(11/30);15例肺良性疾病者外周血LUNX mRNA阳
何群[8]2010年在《胃癌患者CEA和CK20检测的意义及免疫传感器应用初探》文中认为背景胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病在各种恶性肿瘤中居第二位,死亡率居首位。转移和复发是导致胃癌患者死亡的主要原因,许多患者即使给予了标准D2根治手术,仍死于复发和远处转移,传统的临床分期是决定治疗方案的主要依据,但我们经常会发现一些分期很早的患者仍然会发生局部复发或远处转移。肿瘤微转移概念的引入,使人们对于肿瘤的认识从局部扩展到了全身,胃癌是一个全身性疾病的观念已被广为认同,治疗不仅仅局限在局部手术治疗,应该是建立在手术去除病变基础上的全身综合治疗,要强调全面认识病变,重视有无微转移的存在,根据每个患者的情况采取个体化的监测和综合治疗,只有这样才能够使胃癌的治疗取得阶段性的进步。因此,确定胃癌有无转移倾向,早期诊断胃癌的微转移,对患者的预后判断及指导综合治疗至关重要。目的研究不同方法、不同位点CEA及CK20检测对于胃癌患者的临床意义,并初步探讨CEA电化学免疫传感器的临床应用价值。方法(1)用免疫组织化学法测定胃癌组织石蜡切片中CEA及CK20的表达,并结合临床病理资料进行分析。(2)用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应分别检测胃癌患者腹腔游离细胞、淋巴结及外周血中CEAmRNA及CK20mRNA的表达情况,以及用酶联免疫吸附法检测外周血中CEA及CK20的表达情况,结合临床病理资料及随访结果进行分析。(3)建立CEA电化学免疫传感器,验证其效能,并用于胃癌患者外周血的检测,初步探讨其临床应用价值。结果(1)CEA在慢性胃炎对照组中无表达,在胃癌组织及癌旁组织中高表达,其阳性表达率分别为87.76%和44.90%,两者与慢性胃炎对照组相比均显著增高(P<0.05),胃癌组与癌旁组比较表达增高亦有统计学意义(P<0.05)。CK20在胃癌组、癌旁组及对照组均有不同程度的表达,阳性表达率分别为77.55%、38.78%及20.00%,胃癌组表达较其他两组高(P<0.05),癌旁组与对照组表达无差异。CEA在胃癌组织中的表达与年龄、性别、有无淋巴结转移不相关(P>0.05),与细胞分化程度、肿瘤的UICC分期及肿瘤侵犯深度有关(P＜0.05)。CK20在癌组织中的表达与年龄、性别、细胞分化程度及肿瘤有无淋巴结转移无明显相关(P>0.05),但与肿瘤的UICC分期、及肿瘤侵犯深度有关(P＜0.05)。(2)腹腔游离细胞CEAmRNA阳性率42.85%,CK20mRNA阳性率38.78%,对照组均无阳性表达,与对照组相比两者表达增高均有统计学差异(P<0.05)。CEAmRNA及CK20mRNA表达与有无淋巴结转移及瘤浸润深度相关(P<0.05),与组织分化程度无关(P>0.05)。CEAmRNA和CK20mRNA表达都与患者预后有关,阳性表达者的平均生存时间显著缩短(P<0.01)。(3)Ⅰ期和Ⅱ期胃癌患者淋巴结中CEAmRNA和CK20mRNA的阳性表达率分别为30.69%和31.77%,CEA及CK20阳性表达率分别为22.38%和23.10%,两者阳性率有显著性差异。阳性表达病例预后差。(4)外周血CEAmRNA及CK20mRNA胃癌组中阳性表达率分别为65.31%及57.14%,对照组均无阳性表达,两者与对照组相比均有显著性差异(P<0.01)。从阳性表达率分析,外周血CEAmRNA及CK20mRNA的表达与临床病理类型的关系,与癌组织中CEA及CK20的表达有着完全相同的意义,从基因表达量分析,CK20mRNA在分化程度低的肿瘤表达量明显增高,有统计学差异(P＜0.05)。(5)血清CEA及CK20在对照组均阴性,胃癌患者CK20阳性率20.41%,阳性组平均值为2.67±1.21ng/ml; CEA阳性率51.02%,阳性组平均值为14.46±7.29ng/ml,阴性组平均值为1.02±0.79ng/ml。与正常对照组比较CEA阳性表达率增高有统计学意义(P<0.01),CK20阳性表达率增高无统计学意义(P>0.05)。CK20的阳性率明显低于血CK20mRNA水平,两者比较有统计学差异(P<0.01), CEAmRNA与CEA比较两者的阳性表达率无显著性差异(P>0.05)。(6)外周血CEAmRNA、CK20mRNA、CEA及CK20的表达都与患者预后有关,阳性表达者的平均生存时间显著缩短(P<0.01)。(7)所建立的CEA免疫传感器具有良好的响应性、重现性及再生性,血清标本检测结果与ELISA法比较具有很好的相关性(r=0.999),两者检测CEA的敏感度无差别。(8)CEA免疫传感器进行胃癌术后监测显示,术后CEA持续阳性及阴性转阳性者与持续阴性及阳性转阴性者比较预后差(P<0.01),化疗有效组与化疗无效组比较CEA阳性率差别有统计学意义(P＜0.05)。结论(1)CEA在胃癌组织中表达增强,阳性表达与肿瘤分期、分化及侵犯深度有关；CK20在胃癌组织中表达增强,阳性表达与肿瘤分期及浸润深度有关。CEA、CK20可作为胃癌相关肿瘤标志物使用。(2)腹腔游离细胞、淋巴结及外周血CEAmRNA及CK20mRNA检测可早期诊断微转移、指导治疗及评估预后。外周血CEA检测同样具有一定的价值。(3)腹腔微转移与肿瘤浸润深度及淋巴结转移相关,外周血微转移与组织分化、有无淋巴结转移及肿瘤浸润深度有关。(4)成功构建了CEA免疫传感器,能够用于胃癌术后监测。定期监测胃癌患者外周血CEA表达有助于评估疗效、指导治疗和评估预后。
程继文[9]2007年在《卵巢恶性肿瘤腹后腔淋巴结转移临床与生物学意义探讨》文中研究指明腹膜后淋巴结清扫在卵巢上皮癌治疗中的作用目地:探讨了卵巢癌腹膜后淋巴结清扫的临床意义。方法:收集整理了广西肿瘤医院妇瘤科1985-2002年间治疗的361例卵巢癌患者临床信息,采用Kaplan-Meier法描绘生存曲线图,Log-rank test进行差异性检验,Cox风险比例模型进行预后多因素回归分析等进行回顾性研究。结果:早期卵巢上皮癌行腹膜后淋巴结清扫与提高生存率无显著相关性(P＞0.05);晚期卵巢上皮癌行腹膜后淋巴结清扫能提高患者的生存率(p＜0.05);其中残余灶＜2cm的生存率高于残余灶≥2cm的患者(P＜0.05)。Cox回归多因素分析显示:临床期别、残余灶、腹膜后淋巴清扫和化疗疗程是卵巢癌上皮癌的独立预后因素。结论:在卵巢癌的手术中建议有选择进行腹膜后淋巴结清扫,主要针对早期或者残余灶≥2cm的卵巢癌患者,以改善卵巢癌患者生存率。卵巢恶性肿瘤腹后腔淋巴结的分子生物学改变及临床意义目的:探讨CK18与CA125作为卵巢癌腹后腔淋巴结微转移临床检测意义。主要方法:是从361例卵巢癌患者中,选取清扫淋巴结部位记录详细的病例60例,针对原发灶与淋巴结进行CK18与CA125免疫组化检测,采用数据进行四格表、行×列卡方检验或配对卡方检验以及Kaplan-Meier生存分析,分析CA125和CK18在微转移的诊断价值以及临床预后判断的意义。结果:卵巢癌腹膜后各组淋巴CK18、CA125阳性表达率均显著高于临床病理检测阳性表达率,卵巢癌原发灶CK18、CA125蛋白表达的阳性表达率显著高于其淋巴结,而且在CK18、CA125与临床分期有关,卵巢癌腹膜后各组淋巴CK18、CA125阳性表达率均显著高于临床病理检测阳性表达率,在临床的诊断价值较高,CK18、CA125阳性表达对预后影响不明显。结论:CA125和CK18可以应用于临床中卵巢癌淋巴结微转移的诊断,作为淋巴结转移病理诊断有益补充。卵巢恶性肿瘤腹后腔淋巴结微转移的诊断及临床意义目的:我们从肿瘤转移相关基因角度分析腹后腔淋巴结转移灶细胞的生物学特性。主要采用免疫组织化学法对卵巢癌腹后腔淋巴结组织染色,检测原发灶与转移淋巴结中等基因表达,并转移淋巴结中相关基因表达分析与卵巢癌临床病理特征、预后的关系。结果显示Ki-67在转移灶的阳性率显著高于原发灶,而P53、PTEN、PTTG蛋白表达阳性率各组间差别无显著意义,发现化疗对Ki-67P53、PTEN、PTTG以及预后影响较大,其中Ki-67与临床分期有关,Kaplan-Meier生存分析P53、PTEN、Ki-67、PTTG阳性表达对预后影响不明显。在COX分析中,大网膜转移对预后影响最大。这些结果说明P53、PTEN、PTTG、Ki-67在淋巴结转移中扮演重要角色,其中Ki-67的异常表达增高在其中的意义尤其重大。
赵丹懿[10]2007年在《胃癌腹膜转移相关标志物的初步筛选及其功能研究》文中指出胃癌发病率在我国很高，死亡率居恶性肿瘤之首。胃癌的主要治疗手段是胃癌根治术，术后5年生存率为大概为32％～40％，其中约30％～50％的患者发生腹膜转移，是导致患者死亡的重要原因。胃癌腹膜转移的过程为：癌细胞浸透胃浆膜，向腹腔脱落，进而与腹膜粘附着床，增殖形成癌结节。转移病灶一旦形成，治疗十分困难。近年来提出了恶性肿瘤微转移概念，即肿瘤细胞散播并存活于腹腔、淋巴结、外周血及骨髓及其他各组织器官中，却又尚未形成转移结节。根据这一概念，在术前或术中检出脱落的癌细胞，进而采取有效的阻断治疗，成为提高疗效的关键。腹腔冲洗细胞学(peritoneal lavage cytology，PLC)检查是目前常规用于腹腔脱落癌细胞检测的方法，但其缺点是对微量癌细胞检测敏感性低，阳性率仅为14％～21％，有较高的漏诊率。胃癌细胞脱落入腹腔后，其在腹腔内的生物学活动导致许多特异性分子的产生，因此能够检测到这些特异性分子的存在就证明了腹腔中肿瘤细胞的存在。有鉴于此，许多国内外学者利用各种分子生物学方法在胃癌患者的腹腔冲洗液中检测胃癌腹膜转移相关的特异性分子，以期提高脱落癌细胞的检出率。研究对象主要集中在肿瘤细胞相关抗原、细胞外基质及相应的降解酶类、粘附分子与细胞因子等。但各种研究结果并不一致，究竟何种分子指标能够切实有效的提高脱落肿瘤细胞的检出率，目前尚无法达成共识。在各种分子生物学检测方法中，RT-PCR方法具有较高的灵敏度，从而使得胃癌腹腔微转移检测成为可能。本研究从上述问题出发，选取与胃癌腹膜转移密切相关的8种分子生物学检测标志物，分别为癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、肝素酶(heparanase，HPA)、多巴脱羧酶(dopa decarboxylase，DDC)、转化生长因子β1(transforminggrowth factor p1，TGF-p1)、基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase,7，MMP-7)、细胞角蛋白20(cytokeratin 20，CK20)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、磷酸丝氨酸磷脂酶(L-3-phosphoserine phosphatase，L-3-PP)，用RT-PCR方法对92例胃癌患者的腹腔冲洗液进行并行检测，对上述标志物进行初步筛选，以期找出提高脱落肿瘤细胞检出率的理想指标，用以进一步指导临床的诊断治疗。材料与方法1、标本采集选取中国医科大学附属第一医院肿瘤外科2005～2006年间胃癌患者的腹腔冲洗液标本92例。腹腔液标本静置5分钟后，以2000 r／min离心10min，取部分沉渣HE染色、细胞学检查；其余沉渣深低温冰箱冻存，用于提取总RNA。胃癌原发病灶的侵袭深度、浆膜类型、大体类型、生长方式等临床病理因素按13版日本胃癌病理规约标准判定。2、提取腹腔冲洗液总RNATRIZOL法提取胃癌腹腔冲洗液沉渣标本中的总RNA。取少量RNA用于含量及纯度测定，其余分装后置-70℃保存。3、RT-PCR扩增各个分子mRNA(1)cDNA第一链合成用反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA第一链。(2)PCR扩增各个指标cDNA引物序列利用Primer 3.0软件设计，β-actin做内对照。(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用安莱图像分析仪扫描和Chemilmager5500软件分析半定量。4、统计学分析实验数据应用软件SPSSll.5分析，选用x~2检验和方差分析对数据进行分析。结果1、RT-PCR与PLC检查结果92例胃癌腹腔冲洗液中，CEA mRNA阳性率为65.2％(60／92)，HPA mRNA阳性率为58.7％(54／92)，DDC mRNA阳性率为62.0％(57／92)；TGF-β1 mRNA阳性率为35.9％(33／92)，MMP-7 mRNA阳性率为39.1％(36／92)，CK20 mRNA阳性率为42.4％(39／92)，bFGF mRNA阳性率为48.9％(45／92)，L-3-PP mRNA阳性率为23.9％(22／92)；PLC阳性率为25％(23／92)。而10例良性疾病腹腔冲洗液中均未检测到这8种标志物的mRNA。8种标志物中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的阳性率明显高于TGF-β1 mRNA、MMP-7 mRNA、CK20 mRNA、bFGF mRNA和L-3-PP mRNA这5种标志物以及PLC检查(P＜0.05)，显示了较好的敏感性。而TGF-β1 mRNA、MMP-7 mRNA、CK20 mRNA、bFGF mRNA、L-3-PP mRNA与PLC检查相比，虽有增高，但无统计学差异(P＞0.05)。在浸润深度为透浆膜层和浆膜层外的21例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表达阳性率分别为95.2％、90.5％、90.5％；PLC结果阳性的23例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表达阳性率分别为95.7％、87.0％、91.3％；肉眼腹膜转移阳性的13例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA阳性表达的比例分别为100％、92.3％、100％，也显示了较好的敏感性。在浸润深度为粘膜层、粘膜下层和肌层的29例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表达特异性分别为86.9％、86.9％、93.1％，说明其具有较好的特异性。2、CEA tuRNA、HPA tuRNA、DDC tuRNA的表达与胃癌腹膜转移相关临床病理因素比较胃癌腹腔液中CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA表达相对值随着肿瘤浸润深度的增加而显著增加，亦随着浆膜类型的恶变而有显著增加(P＜0.05)。另外CEA mRNA和DDC mRNA的表达还与胃癌生长方式有关，浸润型生长要明显高于限局型生长(P＜0.05)。CEAmRNA的表达还与胃癌的大体类型相关，Borr3+Borr4型要高于Borr1+Borr2型(P＜0.05)。结论(1)RT-PCR作为一种检测胃癌腹腔脱落癌细胞的方法具有较好的灵敏性；(2)CEA、HPA、DDC作为胃癌腹膜转移相关的3种标志物，用于胃癌腹膜转移的预测和腹膜亚临床转移的筛检，具有较好的灵敏性和特异性，优于PLC检查。胃癌是我国人群中发病率和死亡率均占第一位的恶性肿瘤，胃癌的转移是胃癌患者术后死亡的重要原因之一。因此阐明胃癌转移的分子机制并发现新的防治靶点具有重要的理论和实践意义。以往许多研究都表明，肝素酶(heparanase，HPA)和多巴脱羧酶(dopa decarboxylase，DDC)都是胃癌侵袭转移过程中的重要因子，本人的前期实验也发现HPA和DDC与胃癌腹膜转移特异性相关。探讨HPA和DDC在胃癌转移过程中的作用，可以为今后胃癌的基因治疗以及预防转移提供新的靶点。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是一种新兴的基因治疗技术，能高效、特异的降解细胞内有关基因的mRNA，具有广阔的应用前景，目前已成为探寻肿瘤相关基因领域的一个重要热点。本研究在体外合成能够特异性抑制HPA和DDC表达的siRNA，分别转染人胃癌细胞株BGC823，用RT-PCR和Western blotting方法检测转染后胃癌细胞HPA和DDC的表达情况，并通过体外侵袭实验观察转染后胃癌细胞侵袭能力的变化，旨在探讨HPA和DDC基因在胃癌侵袭转移中的作用。材料与方法1、细胞培养胃癌细胞BGC823培养于含10％小牛血清、100U／ml青霉素和100ug／ml链霉素的RPMll640培养基，培养条件为37℃、5％CO_2。实验选用对数生长期细胞，通过0.20％胰蛋白酶消化后收集。小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞的培养同前。2、小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)体外合成用Ambion公司提供的网上在线设计工具进行引物设计。用AmbionSilencerTM siRNA Construction Kit体外合成正义链和反义链RNA并退火形成双链RNA(double strand RNA，dsRNA)。3、siRaNA转染转染前1d，将对数生长期的人胃癌细胞BGC823消化、离心、重悬，4×105／孔接种于6孔板上，第二天当细胞融合达80％左右时进行转染。靶基因siRNA的转染用TransMessenger转染试剂(Qiagen，Chatsworth，CA)。按说明书操作。第4天分析mRNA抑制程度。第8天分析蛋白抑制程度。第9天用Transwell分析细胞侵袭力。4、RNA提取及RT-PCR检测转染胃癌细胞BGC823第4天时，TRIZOL法提取细胞总RNA，反转录成cDNA。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，自动电泳凝胶成像分析系统下成像分析。5、Western blotting检测转染胃癌细胞BGC823第8天时，用0.2％胰蛋白酶消化细胞，加入裂解缓冲液静致10min，4℃12000rpm离心1h，上清为细胞浆蛋白组分；样品(蛋白)浓度的定量；样品调成相同浓度，加入5xSDS凝胶加样缓冲液，沸水煮5min；蛋白电泳40V 90min然后转为80V 120min；转印40V 2h)；TBS浸泡10min；5％脱脂奶粉封闭1h，TTBS洗5min2次；一抗稀释500倍4℃杂交过夜；TTBS洗5min2次；二抗稀释1000倍4℃杂交2h；TTBS洗5min2次，ECL显色；获取图象。6、细胞侵袭力实验转染胃癌细胞BGC823第9天时，用0.2％胰蛋白酶消化、收集，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10~6／ml。将Millicell培养小室放入24孔板中，各取细胞悬液200μl加入Millicell小室，在小室的下室加入400l无血清培养24h的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞上清液，每处理组各设3个复孔。培养8h后取出小室，用棉签擦净小室内的细胞，切取微孔膜，95％酒精固定，苏木素伊红染色。随机于400倍显微镜下取上、下、左、右、中心共5个视野计数穿膜细胞数，取各视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。7、统计学分析利用SPSSll.5软件对组间差异进行方差分析和t检验。结果1、siRNA转染对胃癌细胞BGC823的mRNA表达的影响化学合成的siRNA-HPA与siRNA-DDC分别转染BGC823细胞4天后HPA与DDC基因mRNA表达受到抑制，而未转染组和阴性对照组并未发现HPA与DDC基因表达抑制现象。2、siRNA转染对胃癌细胞BGC823的蛋白表达的影响化学合成的siRNA-HPA与siRNA-DDC分别转染BGC823细胞8天后HPA与DDC基因蛋白表达明显下降，而未转染组和阴性对照组并未发现HPA与DDC蛋白表达抑制现象。3、siRNA转染对胃癌细胞侵袭能力的影响细胞体外侵袭实验显示三组细胞均能穿过附有Matrigel胶的滤膜，但实验组细胞数明显低于未转染组和阴性对照组(P＜0.05)，而未转染组和阴性对照组之间细胞数无明显差异，提示分别抑制HPA和DDC基因表达均能显著降低胃癌细胞的侵袭能力。结论(1)用体外合成的siRNA-HPA和siRNA-DDC转染胃癌细胞BGC823可以抑制其HPA和DDC的表达；(2)胃癌细胞BGC823分别转染siRNA-HPA和siRNA-DDC后，HPA和DDC表达下调，其侵袭和转移能力降低。
参考文献：
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[10]. 胃癌腹膜转移相关标志物的初步筛选及其功能研究[D]. 赵丹懿. 中国医科大学. 2007
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