高吉照 许 伟 郭 雷 李 艳 卢立慧 薛天阳
徐州医学院附属医院儿科医院 江苏徐州 221002
摘要：目的 探讨由载体介导的靶向hTERT基因的RNAi技术对白血病HL-6细胞hTERT基因和细胞增殖的影响。方法 用已经构建好的表达针对hTERT基因siRNA的质粒载体，经转染试剂RNAi-Mate转染HL-60细胞；以空质粒、转染试剂及空白组作对照，将转染后24h、72h、120h的细胞作为三个实验组，用RT-PCR检测细胞hTERT基因mRNA的表达，MTT检测细胞增殖活性。结果 三个实验组HL-60细胞hTERTmRNA表达水平低于各对照组，细胞增殖活性抑制率高于各对照组（P＜0.05），实验组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；三个对照组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 载体介导的靶向hTERT基因的RNAi技术能在体外抑制HL-60细胞hTERT基因的表达，抑制细胞增殖。
关键词：端粒酶逆转录酶；RNA干扰；HL-60细胞；hTERT基因表达；细胞增殖抑制率
Abstract Objective To explore the effect of RNAi technology targeting hTERT by vector on hTERT gene expression and cell proliferative of leukemia HL-60 cell. Methods hTERT-siRNA plasmid that has been structured was transfered into HL-60 cells by RNAi-Mate，the empty plasmid，transfering reagent and blank cells were used as control.Cells were collected at 24h，72h，120h after transfered，and RT-PCR，Western-blot were used to detect the expression of hTERT mRNA and hTERT protein，flow cytometry was used to observe the apoptosis，MTT assay was used to observe the proliferative effects of cells. Results hTERT mRNA expression of test groups at 24h，72h，120h after transfered were 0.31±0.08，0.28±0.05，0.32±0.06 respectively，expression level of empty plasmid，transfering reagent and blank groups were 0.55±0.13，0.49±0.08，0.58±0.19 respectively.Compared with control groups，hTERT mRNA in test groups was significantl low（P＜0.05）；compared with blank group，hTERT mRNA in the empty plasmid and transfering reagent groups had no significant change（P＞0.05）.The antiproliferative effects of RNAi in HL-60 cells in 24h，72h，120h test groups were（23.7±4.0）%、（35.1±5.9）%、（29.6±3.8）%，they were（3.7±0.8）%、（2.1±0.5）%、（2.7±0.9）% in the empty plasmid group，（4.0±1.8）%、（2.6±1.3）%、（2.2±1.1）% in transfering reagent group and in blank group，all 0.The antiproliferative effects of cells in test groups were higher than that in control groups（P＜0.05）；compared among the three test groups，there had no distinguished change（P＞0.05）；compared with blank group，the antiproliferative effects in the empty plasmid and transfering reagent groups had no distinguished change（P＞0.05）in 24h，72h，120h.Conclusion RNAi technology targeting hTERT by vector could inhibit the expression of hTERT gene and proliferation activity of HL-60 cell in vitro.
Key words hTERT；RNAi；HL-60 cell；expression of gene；cell proliferation
分子生物学技术的发展以及对肿瘤发病机制认识的深入，肿瘤的基因治疗越来越受到医学界的重视。本研究利用载体介导的靶向hTERT基因的RNAi技术，检测其对白血病HL-6细胞hTERT基因、蛋白表达、细胞凋亡和增殖活性的影响，探讨儿童白血病的基因治疗。
1 材 料 和 方 法
1.1 主要材料和试剂 HL-60细胞株购自中科院上海细胞所，RMPI1640购自美国Gibco公司 胎牛血清购自杭州四季青生物公司，质粒pSilencer1.0-U6购自美国Ambion 公司，转染试剂RNAi-Mate购自上海吉玛制药技术有限公司，pSilencer1.0-U6/hTERT由徐州医学院附属医院泌尿外科郑骏年博士惠赠[1]，
RT-PCR试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，Annexin V-FITC试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，碘化丙啶（PI）购自美国Sigma公司，恒温培养箱购自美国Thermo elecrton 公司，倒置显微镜CH20型购自日本 Olympus，PCR反应仪购自美国PE公司，752紫外光栅分光光度计购自上海第三分析仪器厂，低温超速离心机购自德国Eppendorf公司，WB电泳仪购自美国Bio-Rad公司，凝胶成象系统购自美国 UVP 公司， 酶标仪美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 实验分组：对照组：（1）pSilencer1.0-U6空质粒组，（2）RNAi-Mate转染试剂组，（3）0.9%氯化钠溶液空白对照组；实验组：pSilencer1.0-U6/hTERT质粒转染24、72、120h组。
1.2.2细胞培养 HL-60细胞采用含10%胎牛血清、青霉素100×103U/L、链霉素100×103g/L的RPMI 1640培养基，在5%CO2、饱和湿度、37℃条件下培养，细胞融合80%～90%时按1：4比例传代。
1.2.3 pSilencer1.0-U6/hTERT转染HL-60细胞，收集传至第3代的HL-60细胞，离心后弃上清液，用RPMI1640培养液调整细胞密度为2.0×105个/ml。取用无血清培养液稀释的pSilencer1.0-U6/hTERT和pSilencer1.0-U6质粒DNA0.8μg、RNAi-Mate2.4μg（RNAi-Mate：DNA为3：1）混合，于37℃培养30min；将细胞悬液加入以上复合物，按实验分组于37℃继续培养不同时间。
1.2.4 RT-PCR检测细胞hTERT基因mRNA表达
收集各组细胞，按照总RNA提取试剂盒说明进行RNA提取，分别取RNA 4μg，按照RT-PCR试剂盒说明进行逆转录和PCR仪扩增，每管样品对应配制一管内参照β－actin。hTRET上游引物序列：5′- TCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAA -3′，hTRET下游引物序列：5′- GCTCCCACGACGTAGTCCATGTTCA -3′，β－actin上游引物序列：5′- GGCATCGTGATGGACTCCG -3′，β－actin下游引物序列：5′- GCTGGAAGGTGGACAGCGA -3′。hTRET基因产物大小为202bp，β－actin基因产物大小为603bp，所用引物均由上海生物工程公司合成；反应结束后分别取反应液10?l，1%琼脂糖100V、50mA条件下电泳30 min；置于凝胶成像系统进行分析。实验设4个复孔。
1.2.5 MTT检测hTERT对HL-60细胞增殖的影响
取对数生长期细胞，调整细胞密度为2×10个/mL，接种于96孔培养板中，分别在质粒转染后继续培养24h、72h、120h；加入20?lMTT（5mg/mL）20?L/孔，继续培养4h；离心后弃上清液，DMSO加入20?L/孔，振荡10min；在酶联免疫检测仪检测490nm处各孔的吸光度（D值），各组设7个复孔，按一下公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组平均D值/空白对照组平均D值）×100%。
1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以 ±s表示，各组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用SNK法检验，检验水准：α=0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 RT-PCR检测 各实验组HL-60细胞hTERT mRNA表达水平低于空质粒转染组、转染试剂组和空白对照组（P＜0.05），三个实验组之间和三个对照组之间hTERT mRNA表达水平无明显差异，组间比较差异无统计学意（P＞0.05）。见表1，图1。
Effect of hTERT-siRNA on hTERT mRNA expression
1：Transfected with pSilencer1.0-U6 2：RNAi-Mate 3：Blank control
4-6：Transfctiected with pSilencer1.0-U6/ hTERT for 24，72 and 120 h，respevely；
图1 RT-PCR检测细胞hTERT基因mRNA表达
Fig.1 Expressions of hTERT mRNA in different groups detected by RT-PCR
表1 各组HL-60细胞hTERT mRNA表达
Table 1 Expression of hTERT mRNA of HL-60 cells in different groups（n=4， ±s）
Group Expression of hTERT mRNA
A 0.55±0.13
B 0.49±0.08
C0.58±0.19
D0.31±0.08﹡
E0.28±0.05﹡
F0.32±0.06﹡
A：Transfected with pSilencer1.0-U6 B：RNAi-Mate C：Blank control D-F：Transfected with pSilencer1.0-U6/ hTERT for 24，72 and 120 h，respectively；﹡P<0.05，VS A，B and C groups.
2.2 载体介导的靶向hTERT RNAi抑制HL-60细胞的增殖 MTT法检测结果显示，各实验组HL-60细胞中的增殖抑制率高于空质粒转染组、转染试剂组和空白对照组（P＜0.05），三个实验组和三个对照组之间的细胞增殖抑制率无明显差异（P＞0.05）。见表2。
3 讨论
RNAi（RNA interference）是双链RNA导入细胞后引起的与该RNA同源的mRNA降解的过程[2]。既往研究表明，利用RNAi技术能特异性抑制癌基因、突变基因、抗凋亡基因的过度表达，使这些基因保持沉默，从而起到抗肿瘤的作用[3～6]，且不良反应小，作用稳定，能更有效、特异地抑制肿瘤基因的表达[7]。端粒酶催化端粒的自我复制以维持端粒的长度，与肿瘤的发生有
表2 MTT法检测各组HL-60细胞的增殖抑制率
Table 2 The inhibitory rate of HL-60 cell proliferation in different groups detected by MTT assay[n=7，（ ±s）/%]
A：Transfected with pSilencer1.0-U6；B：RNAi-Mate；C：Transfected with pSilencer1.0-U6/ hTERT；
﹡P<0.05 VS A and B groups
密切联系[8～9]，其过度表达可使肿瘤细胞持续分裂和增殖。hTERT是端粒酶的限速酶[10]，抑制hTERT基因的表达可以降低端粒酶的活性，从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖，因此，hTERT基因是肿瘤基因治疗的理想靶点，通过针对肿瘤细胞hTERT基因的RNAi，可沉默hTERT基因，从而达到抗肿瘤的目的[11]。本研究结果显示，3个实验组HL-60细胞均出现hTERT基因表达降低、细胞增殖抑制增加，说明hTERT RNAi重组质粒成功介导了HL-60细胞hTERT表达下调。
既往有究把体外合成的针对hTERT的RNAi转染到白血病细胞株，能产生RNAi效果，但作用时间短，转染后1～2天效果基本消失[12]。本研究以重组载体质粒介导的靶向hTERT的RNAi 作用时间较体外合成的RNAi明显延长，作用时间持续120h仍无减弱，主要是因为质粒通过自我复制，使RNAi得到扩增，克服了体外合成的RNAi不能持续表达的缺陷。本研究为小儿白血病的基因治疗提供的实验依据。
参考文献：
[1]毛立军，郑骏年，李望，郑宏祥，刘俊杰，孙小青，陈家存，温儒民。人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定。徐州医学院学报，2006；26（1）：37-39。
[2]Fire A，Xu S，Montgornetg MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.
[3]Binkhathlan Z，Alshamsan A.Emerging nanodelivery strategies of RNAi moleculs for colon cancer therapy：preclinical developments[J].Ther Deliv.2012，3（9）：1117-30.
[4]Koldehoff M，Elmaagacli AH.Therapeutic targeting of gene expression by siRNAs directed against BCR-ABL transcripts in a patient with imatinib-resistant chronic myeloid leukemia[J].Methods Mol Biol，2009，487：451-66.
[5]Folini M，Pennati M，Zaffaroni N.RNA interference-mediated validation of genes involved in telomere maintenance and evasion of apoptosis as cancer therapeutic targets[J].Methods Mol Biol，2009，487：303-330.
[6]Dirk Haussecker.The Business of RNAi Therapeutics in 2012[J].Mol Ther Nucleic Acids.2012，1（2）：e8.
[7]Bertrand JR，Pottier M，Vekris A，et al.Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，（4）：1000-1004.
[8]Shawi M，Autexier C.Telomerase，senescence and ageing[J].Mech Ageing Dev，2008，129（1-2）：3-10.
[9]Zagouri F，Sergentanis TN，Gazouli M et al.HTERT MNS16A polymorphism in breast cancer：a case-control study[J]. Mol Biol Rep.2012，39（12）：10859-63.
[10]Kaszubowska L.Telomere shortening and ageing of the immune system[J].Physiol Pharmacol，2008，59（9）：169-186.
[12]Tomás-Loba A，Flores I，Fernández-Marcos PJ，et al.Telomerase reverse transcriptase delays aging in cancer-resistant mice[J].Cell，2008，135（4）：609-622.
[13]Eid MM，Helmy NA，Omar IM et al.Clinical significance of telomerase genes（hTERC and Htert）amplification in patients with acute myeloid leukemia[J].Grlf J Oncolog.2013，1（13）：51-60.
[11]Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J].Science，2002，296：550-553.
[12]Liu X，Huang H，Wang J et al.Dendrimers-delivered short hairpin RNA targeting hTRET inhibits oral cancer cell growth in vitro and in vivo[J].Bilchem Pharmacol.2011，82（1）：17-23.
论文作者:高吉照,许伟,郭雷,李艳,卢立慧,薛天阳
论文发表刊物:《健康世界》2015年20期供稿
论文发表时间:2016/2/17
标签：细胞论文; 转染论文; 基因论文; 质粒论文; 实验组论文; 抑制论文; 美国论文; 《健康世界》2015年20期供稿论文;