王玉芳[1]2004年在《恶性黑色素瘤细胞凋亡相关基因和蛋白表达谱》文中指出研究背景与目的:恶性黑色素瘤是来源于皮肤黑素细胞的一种恶性程度很高的肿瘤,突出特点为发病早,转移率高,致死率高。大量的研究表明恶性黑色素瘤中细胞凋亡的“关闭”导致其对临床各种化疗药物耐受,从而具备了强大的生存能力。近年来,有部分研究报道了与细胞凋亡相关的凋亡调节分子和执行分子在该肿瘤中的表达以及变异情况,虽然局限于某一个分子在恶性黑色素细胞中表达异常,如Apaf-1,survivin,bcl-2等,这些研究结果对于深入认识恶性黑色素瘤耐药的分子机制提供了线索。但是恶性黑色素瘤对多种治疗措施都不敏感就说明该肿瘤的耐药机制很复杂,因此我们以四株恶性黑色素瘤细胞作为研究对象,对与凋亡相关的基因和蛋白质表达情况进行系统的研究,以期从整体的角度来认识该疾病与凋亡的关系,为筛选出可以作为临床诊断和预后的特征性的分子奠定基础。 材料与方法:运用基因芯片技术获得四株恶性黑色素瘤细胞凋亡相关基因表达谱;利用RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学和原位杂交技术在恶性黑色素瘤细胞和组织中检测caspase14的表达情况;采用MTT方法测定抗癌药和UV刺激对两大类恶性黑色素瘤细胞增殖活力的影
耿传营[2]2013年在《NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱》文中进行了进一步梳理NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱研究目的：1.从NCI-H929细胞系中分选CD20+和CD20-细胞，明确两种细胞克隆形成能力及分化能力的差异。2.探讨CD20+和CD20-的NCI-H929细胞蛋白表达谱的差异，验证其在mRNA和蛋白水平上的表达。3.选择影响CD20+细胞增殖的关键差异蛋白，抑制其功能，探讨对CD20+细胞增殖能力的影响。研究方法：1. CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选取对数生长期的NCI-H929细胞，制备单细胞悬液，每107个细胞加免疫磁珠分选缓冲液80μl，随后加阻断剂20μl，4-8℃孵育10min，然后加CD20磁珠抗体20μl，4-8℃孵育15min，免疫磁珠分选缓冲液清洗细胞，将免疫磁珠抗体孵育的细胞加入免疫磁珠分选MS柱中，分选CD20+和CD20-细胞。采用流式细胞仪检测NCI-H929细胞和分选后的CD20+和CD20-细胞的免疫表型。2. CD20+和CD20-细胞的克隆形成及分化能力取分选的CD20+和CD20-细胞，制备细胞悬液，培养于细胞克隆培养基中，培养基中细胞终浓度为1×10~3/mL，置入37℃5%CO_2培养箱中培养，14-21天后观察细胞克隆数，40个细胞记为1个克隆，计算形成率，检测CD20+和CD20-细胞的克隆形成能力。取克隆形成细胞，制成细胞悬液，重新接种于克隆培养基中，检测克隆形成情况，根据上述方法，再进行3次重新接种，观察实验细胞的自我更新能力。取分选的CD20+NCI-H929细胞，加入培养基中，置于孵箱中培养，2周后，收集培养细胞，制成细胞悬液，分别加入抗人CD20、CD45、CD38和CD138抗体，流式细胞术的方法检测CD20+细胞抗原表达。3.差异蛋白筛选取分选的CD20+和CD20-细胞，总蛋白试剂盒提取细胞总蛋白，加入12%SDS-PAGE凝胶中进行电泳，将两组的蛋白质胶图进行分析后，将各组的所有条带分为10部分切下，每块切成直径2mm的小粒。萃取胶粒中蛋白质，使用胰酶溶液进行酶解，获得肽段干粉。TMT标记后，应用高效液相色谱分离与质谱鉴定两组间差异蛋白，Sequest软件鉴定筛选的差异蛋白。选取筛选的差异蛋白，应用在线数据库PANTHER (http://www.pantherdb.org/）对差异蛋白进行分类，应用人生物信息数据库STRING9.05(http://string-db.org/)分析差异蛋白之间的相互作用，筛选对CD20+细胞生物学特性具有重要影响的蛋白质。4.差异蛋白验证选取质谱鉴定出的差异蛋白，分别利用Real-time PCR和Western Blot的方法在mRNA和蛋白水平上验证差异蛋白的表达水平。收集CD20+和CD20-细胞，提取细胞总RNA，利用Real time PCR的方法从mRNA水平验证质谱鉴定的差异蛋白的表达；提取CD20+和CD20-细胞总蛋白，利用Western Blot方法从蛋白水平上验证质谱鉴定的差异蛋白的表达。5.差异蛋白功能对细胞增殖的影响根据生物信息学分析结果及文献报道，选择影响细胞增殖的差异蛋白质，利用差异蛋白Silencer siRNA和抑制剂干扰其功能，检测差异蛋白功能抑制后，CD20+和CD20-细胞增殖能力的变化，研究差异蛋白对CD20+细胞增殖能力的作用。结果：1. CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选用流式细胞术检测H929细胞抗原表达发现，H929细胞表达CD38、CD138，不表达CD45；CD20+细胞的比例很低，且不稳定，约为0.1-1%，CD20-的骨髓瘤细胞的比率约为99-99.9%。分选的CD20+细胞表达CD20、CD45和CD38，CD138表达减弱。分选的CD20-细胞表达CD38、CD138，不表达CD20、CD45。2. CD20+和CD20-细胞的克隆形成及分化能力CD20+和CD20-细胞克隆在培养箱中培养2周后，CD20+细胞形成明显的细胞集落，但CD20-细胞的增殖能力较弱，形成较小的集簇。将CD20+细胞形成的克隆用培养基稀释，离心，制成细胞悬液，重新接种，再次进行克隆实验。在CD20+细胞形成的克隆细胞中，大部分细胞克隆再形成能力较弱，但仍有部分细胞可再次形成较大集落。但是，CD20-细胞进行连续传代培养后，逐步失去克隆形成能力，没有细胞可形成较大集落。取分选的CD20+NCI-H929细胞，加入培养基中，置于孵箱中培养，2周后，收集培养细胞，制成细胞悬液，分别加入抗人CD20、CD45、CD38和CD138抗体，流式细胞术的方法检测H929细胞抗原表达。结果CD20+细胞培养后，CD20和CD45分子表达明显减低， CD38，CD138表达增强，细胞免疫表型恢复至典型的NCI-H929免疫表型状态。3.差异蛋白筛选选取分选的CD20-和CD20+细胞，进行质谱分析，共鉴定出1082种蛋白质，658种蛋白表达的差异超过1.5倍，与CD20-细胞相比，CD20+细胞中，205种蛋白表达上调，453种蛋白表达下调。PANTHER类别分析显示，差异蛋白参与的生物学过程主要有细胞通讯、转运、凋亡、系统过程、刺激应答、发育、代谢、细胞周期、免疫和黏附。差异蛋白参与最多的生物学过程是代谢(67.30%)、细胞进程(celluar process)(30.00%)和转运过程(17.98%)。与表达下调的差异蛋白相比，表达上调的蛋白中，参与细胞通讯、转运和细胞黏附的蛋白比例较高，参与其他生物学过程的蛋白比例较低。STRING相互作用分析显示，658种差异蛋白中，405种蛋白可与其它蛋白存在相互作用，其中60种蛋白形成核心网络，每种蛋白含有30个以上的节点，主要参与能量代谢、核苷酸合成和细胞增殖等维持细胞生命活动的过程。STRING分析74种参与细胞增殖、凋亡、代谢等信号通路的差异蛋白质，结果显示，61种蛋白可与其它蛋白存在相互作用，主要分为能量代谢、核苷酸合成代谢、泛素-蛋白酶体信号通路、细胞黏附转移和FAS信号通路5类蛋白。将目前文献报道的与细胞增殖密切相关的11种蛋白质联合74种差异蛋白进行分析，结果显示，75种蛋白存在相互联结，同样可形成5类蛋白群，同时TP53、AKT1、HSPA8等蛋白可于蛋白群形成密切联结，调控细胞的生命活动。4.差异蛋白表达验证从差异表达的658种蛋白质中，选择质谱分数大于20的15种蛋白质，同时选择6种与细胞增殖密切相关，但质谱未鉴定出的蛋白质，利用Real-time PCR的方法验证其在CD20+和CD20-细胞中的表达。Real-time PCR验证的基因表达变化与质谱鉴定的结果一致。选择上述21种蛋白质中与细胞增殖密切相关的13种蛋白，利用Western Blot的方法验证其在CD20+和CD20-细胞中的表达，Western Blot验证的基因表达变化与质谱鉴定的结果一致。5. RNA干扰联合mTOR抑制剂对细胞的增殖抑制作用CD20+细胞中，NANOG及SOX2基因表达增高，利用携带NANOG及SOX2干扰序列的慢病毒感染骨髓瘤细胞，表达特异性干扰RNA，降低NANOG及SOX2基因表达，检测其对骨髓瘤细胞增殖的影响。利用MTT的方法检测NANOG SilencerRNA、SOX2Silencer RNA及mTOR抑制剂RAD001对CD20+和CD20-细胞增殖的影响。结果发现，NANOG Silencer RNA及SOX2Silencer RNA不能有效抑制CD20+和CD20-细胞增殖，RAD001对CD20+细胞的增殖较抑制作用较NANOG SilencerRNA和SOX2Silencer RNA强，但无统计学意义，RAD001对CD20-细胞的增殖较抑制作用较NANOG Silencer RNA和SOX2Silencer RNA明显增强。叁种药物联合应用后，CD20+和CD20-细胞的增殖受到明显抑制。结论：1.分选NCI-H929细胞中含有极少量CD20+细胞，其克隆形成能力较CD20-细胞强，具有自我更新和分化能力。2. CD20+细胞与CD20-细胞具有不同的蛋白表达谱，差异蛋白参与的生物学过程主要有细胞通讯、转运、凋亡、系统过程、刺激应答、发育、代谢、细胞周期、免疫和黏附，相互之间形成密切网络。3.利用CD20+细胞中表达增强的NANOG及SOX2干扰siRNA并不能有效抑制CD20+及CD20-细胞的增殖，联合mTOR抑制剂--RAD001后，CD20+和CD20-细胞的增殖受到明显抑制。
王宽松[3]2006年在《TGFβ1对胃癌浸润转移的影响及其机制研究》文中提出基因不稳定和基因变异的积累可影响生长因子和抑制因子之间的平衡，使肿瘤侵袭性增强、新生血管形成，最终引起肿瘤的转移。浸润与转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，是临床上大多数肿瘤患者的致死原因；因此，有效地针对肿瘤自发转移进行治疗是肿瘤治疗的关键环节，而深入探讨肿瘤转移的分子机制，寻求药物治疗的新靶点则成为肿瘤研究工作的重点。 转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF β)超家族是一类结构相似但功能不同的肽类物质，在肿瘤发展中，其作用较为复杂。许多体外实验证实，TGFβ1可以抑制肾细胞癌、甲状腺癌等进展；部分瘤细胞由于缺乏TGFβ受体，逃逸了TGFβ介导的负性生长调节作用，最终促进了肿瘤的发展。然而在乳腺癌中，高水平的TGFβ1却可促进其浸润与转移；同样，转染TGFβ1反义寡核苷酸表达质粒可降低结肠癌细胞株的致瘤性。由此可见，TGFβ在肿瘤发展过程中的作用尚没有完全明确，我们推测，对于不同类型的肿瘤甚至不同的瘤细胞株而言，TGFβ可能发挥不同甚至相反的生物学效应，具体机制未明。 胃癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国，其死亡率居各种恶性肿瘤之首。胃癌患者的主要死因为肿瘤病灶的浸润及转移。近年的研究表明在胃癌组织中TGFβ1的表达水平比正常胃粘膜高，且与胃癌的浸润深度和淋巴结转移呈正相关，与患者的预后呈负相关，许多临床资料亦显示胃癌患者血清中TGFβ1的水平升高，并与患者的预后呈负相关，预示着肿瘤复发的高风险。但是，迄今为止，TGFβ1对胃癌浸润、转移的确切影响及可能的作用机制尚未见相关报道。因此，本研究利用胃癌细胞株通过裸鼠成瘤等实验初步探讨了TGFβ1对胃癌细胞浸润与转移的直接影响及可能的作用机制。用10ng／ml的TGFβ1处理胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823、MKN-28，观察处理前后各细胞株浸润能力的变化，结果发现TGF-β1可明显的促进SGC-7901、BGC-823细胞的浸润，而对MKN-28细胞(TGFβ1抗性细胞株)没有影响。同时将经TGFβ1处理及未处理的叁株细胞分别接种裸鼠(腹腔注射)，建立癌细胞裸鼠转移模型，结果发现经10ng／ml TGFβ1处理的SGC-7901、BGC-823细胞株
李伟[4]2013年在《胃癌淋巴结转移信号传导通路蛋白表达谱筛选和分析》文中研究表明目的：胃癌是世界上排在第四位的高发病率的恶性肿瘤，而因为胃癌所导致的肿瘤相关死亡率仅次于肺癌，在世界上排在第二位。大多数的胃癌病人在出现症状的时候已经处于TNM分期的III期或者IV期，并且这些病人中大多数伴随有区域性淋巴结转移。手术前确定胃癌患者的淋巴结转移状态对判断胃癌的分期以及针对性地制定最理想的治疗方案是十分重要的。目前，手术对淋巴结转移状态的评估主要是基于影像学技术，而依靠淋巴结大小诊断淋巴结转移的影像学技术不是一个可靠性的指标。因此在术前找到有效地预测胃癌淋巴结转移的分子标志物是亟待解决的问题。我们实验的目的是筛选出参与胃癌淋巴结转移机制的蛋白质，找出这些蛋白质所参与的信号传导网络，寻找针对胃癌淋巴结转移的治疗靶点，建立胃癌淋巴结转移预测模型，从而帮助预测胃癌病人的淋巴结转移状态及预后。方法：本研究应用蛋白通路芯片技术（Protein pathway array，PPA）针对193个磷酸化或非磷酸化抗体，检测测试队列中的130例胃癌组织中蛋白质的表达情况。应用SAM统计学软件发现在训练组中的淋巴结转移阴性胃癌和淋巴结转移阳性胃癌之间存在的差异性表达的蛋白质，并进一步对验证组胃癌病例应用K-fold交叉验证法（K=10）以及SVM模型分类器鉴定筛选出来的差异性表达蛋白质的分类能力。本研究还应用聚类分析方法鉴定差异性表达的蛋白质，并应用Ingenuity PathwayAnalysis（IPA）分析软件研究差异性表达的蛋白质对胃癌淋巴结转移网络的影响。为了检测差异性表达的蛋白质与临床病理学特征之间的关系，应用SAM统计学软件针对测试队列中的57例淋巴结转移阴性胃癌和73例淋巴结转移阳性胃癌，探讨了胃癌淋巴结转移蛋白质表达谱与肿瘤大小、组织学分型、脉管浸润之间的关系。为了计算胃癌病人出现淋巴结转移的风险，应用差异性表达的蛋白质和临床病理学参数建立了一个胃癌淋巴结转移预测模型，并计算了模型预测胃癌淋巴结转移的准确率、敏感度和特异度，并进一步应用受试者工作特征曲线（ROC）分析胃癌淋巴结转移预测模型预测淋巴结转移的优势。我们进一步用胃癌淋巴结转移预测模型进行生存分析，找到影响生存的风险因素。最后在验证队列中应用Western Blot技术对胃癌淋巴结转移预测模型预测淋巴结转移状态及预后的能力进行验证。结果：我们的研究发现，在测试队列的训练组中淋巴结转移阴性胃癌和淋巴结转移阳性胃癌之间共有27个蛋白质或磷酸化蛋白质存在差异性表达，在这27个差异性表达的蛋白质之间有12个蛋白质被用作分类蛋白，认为这些蛋白具有较强的分类能力，其对训练组和验证组中胃癌淋巴结转移的预测的准确率分别为83%和86%，敏感度分别为86%和88%，特异度分别为80%和82.5%；应用分层聚类分析方法分析这12个具有较强分类能力的蛋白质，将淋巴结转移阴性胃癌和淋巴结转移阳性胃癌分开为两类，12个蛋白质根据表达上升或下降也分为两类；IPA系统根据这些差异性表达的蛋白质绘制出了胃癌淋巴结转移信号传导网络，分析结果表明，这些蛋白质与细胞运动、细胞死亡和生存、细胞发育、细胞生长及增殖以及基因表达相关，并且这些蛋白质也与癌症、呼吸系统疾病、生殖系统疾病、胃肠道系统疾病以及内分泌系统疾病相关，这些蛋白质的上游调节蛋白质可能作为胃癌淋巴结转移的治疗的靶点；在不同的肿瘤大小、组织学分型、脉管浸润状态的胃癌患者中，存在差异性表达的蛋白质。这些差异性表达的蛋白质可能是潜在的与胃癌进展和预后相关的分子标志物。我们的研究还表明5个蛋白质（Factor XIII B、TFIIH p89、ADAM8、COX-2和CUL-1）和脉管浸润是胃癌淋巴结转移的独立性风险因素。结合5个蛋白质和脉管浸润建立了胃癌淋巴结转移预测模型，其预测胃癌淋巴结转移的准确率、敏感度和特异度分别为84.6%、96.3%和91.2%。胃癌淋巴结转移模型还可以用来预测每一个患者的预后情况。在一组独立样本中应用Western-Blot技术检测胃癌淋巴结转移模型中的5个蛋白质的表达水平，并对胃癌淋巴结转移预测模型进行验证，其结果与以上结果一致。结论：本研究着眼于胃癌淋巴结转移信号传导通路，通过对淋巴结转移阳性胃癌组织标本和淋巴结转移阴性胃癌组织标本的蛋白质表达水平进行筛选和PPA分析，研究差异性表达的蛋白质的信号传导通路在胃癌发生淋巴结转移过程中对胃癌细胞发育、运动、生长和增殖以及凋亡的作用。本研究发现在胃癌淋巴结转移过程中存在广泛的信号传导蛋白质的表达的异常。其中部分蛋白质与肿瘤大小、组织学分型、脉管浸润状态相关，可能作为判断胃癌进展和预后的分子标志物。特别是基于Factor XIII B、TFIIH p89、ADAM8、COX-2和CUL-1这5个蛋白质以及脉管浸润所建立的胃癌淋巴结转移预测模型，为预测胃癌患者淋巴结转移以及判断患者预后建立了一个行之有效的预测系统。
参考文献：
[1]. 恶性黑色素瘤细胞凋亡相关基因和蛋白表达谱[D]. 王玉芳. 四川大学. 2004
[2]. NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱[D]. 耿传营. 首都医科大学. 2013
[3]. TGFβ1对胃癌浸润转移的影响及其机制研究[D]. 王宽松. 中南大学. 2006
[4]. 胃癌淋巴结转移信号传导通路蛋白表达谱筛选和分析[D]. 李伟. 吉林大学. 2013
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