盛艳娟[1]2002年在《大剂量甲基强的松龙对大鼠视神经挤压伤后视网膜神经节细胞凋亡的影响》文中指出外伤性视神经病变是外力经眶骨传导对视神经的间接损伤，往往导致严重视功能障碍甚至永久失明。视神经是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)轴突汇聚而成，视神经损伤后，RGC将发生继发性死亡。凋亡(apoptosis)是RGC死亡的一种重要形式。视神经损伤后，各种因素可改变神经元生存的微环境，如神经营养因子的剥夺、钙离子超载和过氧化损伤等细胞内连锁反应，启动和诱导神经元凋亡。视神经损伤的治疗首先应是减少视网膜神经节细胞凋亡和死亡，继而促进神经轴突的再生。 大剂量甲基强的松龙(methylprednisolone，MP)治疗急性视神经损伤是借鉴式应用于临床，治疗效果各家报道不一，治疗机制亦不清楚。 本研究拟通过建立视神经损伤动物模型，早期应用大剂量MP郑州大学2002年研究生论文 大剂量甲基强的松龙对大鼠视神经挤压伤后视网膜神经节细胞凋亡的影响治疗，设立对照组观察对RGC凋亡的影响。并进一步探讨大剂量MP影响凋亡的机制。 方法：选用 126只健康 Wistar大鼠，雌雄皆用，体重2002，外眼及眼底检查正常。随机分为门）正常对照组（对照组，18只 3 6眼）即未进行任何处理的健康 Wistar大鼠；Q）损伤组K4只54眼）即单眼视神经损伤后给予生理盐水治疗； 门）MP治疗组（治疗组，54只54眼）即单眼视神经损伤后给予 MP治疗。再按伤后存活时间随机分为 4 d、7 d和 14 d H个时间点，对照组每个时间点各12眼，损伤组和治疗组每个时间点为 18眼。视神经损伤模型制作：于球后 3 mm处用同一无创血管夹夹持视神经 10 S。治疗组于伤后 lh开始MP治疗，首次给予 3 0 mgthg尾静脉注射，6 h以后按 5．4 mg八kg·h）每 6 h给药一次，直到 48 h，总剂量为 246．8 mg／kg。对照组给予相等容量的生理盐水。实验动物在达到预定存活时间后，用4％多聚甲醛活体经左心室灌注，取眼球，制备视网膜铺片和切片，分别行脱氧核昔酸末端转移酶介导的缺口末端标记法kerminal－deoxynucleotldyl transferase mediated DUTP－biotin nick endlabeling，TUPNEL）染色进行凋亡细胞的计数和定位，免疫组织化学3P法）染色检测 hcf二抗凋亡基因和 bax促凋亡基因的表达情况。视网膜铺片用于视网膜阳性细胞的定量检测，视网膜切片用于检测视网膜阳性细胞所在视网膜的层面。光镜下视网膜铺片计数阳性细胞，数据运用重复测量数据方差分析进行统计学处理。 －2．一 结 果 1．TUNEL染色凋亡细胞计数和定位：视网膜切片中显示TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）仅见于视网膜神经节细胞层。凋亡细胞呈胞核染色，呈棕黄色，部分可由于核固缩扭曲破裂而失去正常形态，并可见凋亡小体。 对照组铺片和切片中见极少量凋亡细胞，4 d、7 d和 14 d凋亡细胞数分别为 0＊ 个／mm＼ 0．30个／mm年 0．45个／mm乙 损伤组4d、7d、14d凋亡细胞数分别为N．5个／m‘、22．78个／mm厅 5．3 6个／。乙 损伤组 4 d时出现大量凋亡细胞，7 d后达到高峰，14 d时凋亡细胞明显减少。 治疗组 4 d、7 d和 14 d凋亡细胞数分别为 11．44个／mm’、17．84个／mm’和 1．8 8个／mm乙各时间点对照组、损伤组和治疗组两两比较，差异有显着性中＜0刀5人治疗组视神经挤压伤后＊＊C的凋亡显着减少，大剂量MP早期应用能够减少视神经挤压伤后RGC的凋亡。 2．hcf2和 bax基因表达检测：视网膜切片中见阳性细胞仅位于视网膜节细胞层。典型的阳性细胞着色，呈棕黄色颗粒状，也可见于核膜和胞膜。 对照组 bCI－2丫水平表达，4 d、7 d和 14 d阳性细胞数分别为 6．37个／mm’、6．63个／mm‘和 5．77个／mm’。损伤组 4 d、7 d和14 d阳性细胞数分别为 17．38个／mm‘、ZI．54个／。’和 27．64个／＊＊’。治疗组 4 d、7 d和 14 d卜性细胞数分别为 20．88个／mm’、25．70个／mm汗 32．5个／mm＼各时间点对照组、损伤组和治疗组 －3－ 郑州大学2002年研究生论文 大剂量甲基强的松龙对大鼠视神经挤压伤后视网膜神经节细胞凋亡的影响 两两比较，差异有显着性中功刀5人大剂量MP早期应用能明 显提高抗凋亡基因bclZ的表达。 对照组中 bax＊ 水平表达，4 d、7 d和 14 d＊性细胞数分别 为 5．00个／mm‘、5．87个／mm’和 5．67个／mm‘。损伤组 4 d、7 d和 14 dBax卜性细胞数分别为 ZI．44个／mm’，33．50个／mm‘和 32．96 个／mm’。治疗组 4 d、7 d和 14 d阳性细胞数分别为 17．6个am’。 27．66个／mm‘和 26．84个加m’。各时间点对照组、损伤组和治疗 组两两比较，差异有显着性中刃．0引 表明大剂量MP能明显 降低促凋亡基因bax的表达。 结 论 1．大鼠视神经挤压伤后，伤后4大出现视网膜神经节细胞 大量凋亡
林琳[2]2014年在《视神经损伤后的病理溃变及手术及药物干预的实验研究》文中认为目的：视神经损伤是颅脑、面部和眼眶外伤严重的并发症,受伤后视力损害严重,经常遗留永久性视力障碍。长期以来,关于视神经损伤的治疗一直存在着争议。现有研究认为,使用糖皮质激素为主的药物治疗法和手术治疗法是最常用的治疗手段,视神经管减压术已成为目前主要的手术治疗方法,视神经减压术是解除直接压迫,缓解神经肿胀及血管痉挛,对于视神经损伤有一定的疗效；地塞米松对于视神经损伤有着皮质激素可通过其抗氧化作用减轻自由基对细胞膜结构的损伤而使水肿减轻,同时阻断外伤性炎症介质及血管活性物质的产生,从而减轻血管痉挛,降低视神经挫伤性坏死的严重性以及微循环血管痉挛程度的作用。以往实验偏向于动物模型制作,对临床指导作用缺乏。本实验以视神经减压术、地塞米松药物治疗及视神经减压术联合地塞米松药物治疗为影响因素,以视神经Nogo受体,视网膜Nogo受体、Caspase-3为切入点,对兔视神经损伤模型的视网膜及视神经受体进行光镜及电镜下病理生理观察。初步明确视神经减压术、地塞米松药物治疗及视神经减压术联合地塞米松药物治疗对于视神经模型的影响。为临床视神经治疗提供理论基础。通过假伤组与对照组验证本实验设计合理性。通过临时动脉瘤夹闭视神经制造可用于视神经损伤手术或药物治疗的观察研究稳定的的动物模型。方法：(1)实验动物分组：成年健康白兔96只,种属为新西兰白兔,体重2-2.5kg,由新疆医科大学医学动物中心提供。适应性喂养3d后检查双侧眼,发现屈光间质清,瞳孔等大、等圆,对光反射灵敏,眼底无异常;其中6只为空白对照组,18只为假伤组,以排除手术因素对视神经及视网膜的影响,对剩余72只白兔左眼进行视神经损伤模型制作,随机分为模型组、单纯视神经损伤组,地塞米松药物治疗影响组、视神经减压术影响组、视神经减压术联合地塞米松药物治疗共同影响组四个大组,每个大组分为叁个亚组,分别为术后1天组、7天组、21天组,每个亚组6只。(2)动物模型的制作3%戊巴比妥1ml/kg耳缘静脉注射麻醉白兔后,俯卧位固定于手术台；在双目显微镜下,上睑外侧置一牵引缝线,固定以牵开上睑；剪开球结膜,在上直肌及上斜肌肌止端处作牵引缝线；将眼球向眶前外下方向拉,显微镜下锐性分离球后软组织,以暴露视神经,向深部分离视神经约8mm,于球后3mm处用动脉瘤夹(蛇牌临时动脉瘤夹FT250T,咬合长度9mm,最大开口7mm,闭合力0.88N,重量：9克。)夹闭20s(假伤组不夹闭视神经)。将眼球复位、缝合球结膜。生理盐水冲洗眼眶,滴加左氧氟沙星滴眼液。动物模型建立标准：视神经损伤动物模型建立术后,待苏醒后放回笼内,检查手术切口愈合良好,无化脓积脓,无渗血渗液,观察伤眼瞳孔散大,直接对光反应消失,术眼角膜透明、无外伤性白内障发生、玻璃体腔无积血、视网膜血液供应正常无出血和视网膜脱离发生、术眼玻璃体无炎性反应、视网膜血管无出血及梗塞,无眼球突出及眼睑闭合,不全者纳入实验。经以上各项评价指标检测反映该模型建立成功与否。经上述标准检查,96只新西兰白兔的视神经动物模型随机分批纳入实验。动物饲养过程中,对于出现并发症者排出实验,并及时补足实验动物数目。(3)视神经减压术按照实验分组,对于需要实行视神经减压术的实验动物,按上述模型制作方法制作模型,动脉瘤夹夹闭20s后,采用1ml注射器针头显微镜下分离视神经外包膜组织至球后视神经8mm处,达到视神经减压目的。(4)地塞米松给药方法所有地塞米松影响实验动物,于术后当日开始,按每日每只1mg/kg剂量,进行肌肉注射,直至达到各处死节点。(5)视神经及视网膜神经节细胞层标本采集及其形态学研究：采用3%戊巴比妥钠麻醉过量麻醉,开胸经左心室插管至主动脉,上腔静脉开口排出灌注液,依次灌注生理盐水500ml,2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液250ml,至兔子出现四肢抽搐强直后,立即摘除眼球取视神经视网膜标本置于固定液中,并标记,光镜标本用4%多聚甲醛固定72h、脱水、石蜡包埋,通过视神经乳头,沿眼球的垂直经线行前后方向视网膜全层进行切片,行HE染色。使用切片机制备切片。RGC计数方法：用光学显微镜(40物镜)观察,每个标本随机抽取3张切片,距离视神经乳头上方和下方300um分别3个区域(每个区域25um*25um),统计存活的视网膜神经节细胞数目的总和。计算视网膜神经节细胞数总和然后取平均数并记录实验数据,最后利用统计学软件分析各组不同时间点视网膜神经节存活的细胞数,其凋亡规律以及各组是否存在统计学差异。电镜标本：将视神经标本用4%戊二醛电镜固定液固定。冰箱恒温保存,于电镜室4%戊二醛和1%四氧化锇双重固定,丙酮梯度脱水,Epon812环氧树脂包埋,LKB2188超薄切片机切片,铅铀电子染色,JEOL1230透射电子显微镜观察。(6)观测指标及时间点观察指标：夹闭后1天、一周、3周观察：1)夹闭后局部视网膜及视神经组织形态学光镜观察,及视神经超微结构的电镜观察；2)视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)计数(细胞原位凋亡技术检测)；3)视网膜上Caspase-3的免疫组化检测；4)视神经、视网膜Nogo受体的免疫组化检测,病理免疫组化结果进行相关性分析视神经减压术及地塞米松对于视神经模型的影响。(7)统计学分析：统计资料为多组定量资料,若分组或时间符合正态、方差齐性,进行方差分析,若不符合,使用Kruskal-wallis (KW)秩和检验。同时进行不同分组及不同时间的两两比较各组数据用sas jmp pro计算机统计软件进行统计学分析。各组的计量资料以均数±标准差表示,以P<0.05为差异有统计学意义。表中*为不符合方差齐性,使用Wilcoxon秩和检验结果：(1)组织形态学光镜观察,采用HE染色法视神经损伤后,光镜下观察,早期视网膜出现肿胀,各层厚度较正常略增厚,细胞排列疏松而紊乱,仅见视网膜毛细血管扩张,视网膜神经节细胞少量减少。视网膜HE染色组织形态学观察对照组视网膜层次清晰,R G C呈单层排列,整齐密集,胞核清楚,核膜光滑完整,各时间点损伤病理改变明显,病变随时间推移进行性加重。损伤一天组视网膜形态改变,细胞轻度水肿,厚度稍变厚,神经节细胞层内外层排列稍紊乱,细胞间隙增大,有少量核固缩,染色加深,大量节细胞空泡变性,细胞数量稍微减少。损伤一周组视网膜形态改变,较前一组加重,细胞水肿严重,神经节细胞核染色质深染加重,可见大量空泡变性的细胞,外层和内层结构紊乱,界限模糊不清,视网膜全层明显变薄。损伤叁周组,视网膜细胞水肿改变较之前有所减轻,核质染色深染,各层结构紊乱,视网膜全层变薄。(2)视神经超微结构的电镜观察1天(图3-1)神经纤维轻微变形,髓鞘板层结构轻度分离,局部可见泡状结构,可见球状突向轴浆,髓鞘板层结构分离,轴浆神经原纤维排列松散,以粗纤维为主,血管内皮细胞肿胀,管腔不全阻塞,神经纤维破碎,髓鞘塌陷等急性创伤改变排列不齐少量线粒体轻微肿胀。7天(图3-2)髓鞘松解,髓鞘普遍变性,洋葱样小体形成,胶质明显增生,仍残留有水肿软化小区厚度增加,板层结构分离层多层,个别表现为脱髓鞘。胶质细胞轻微肿胀,线粒体空泡变,部分神经轴浆空泡变。21天(图3-3)神经变性,神经纤维结构不规则,髓鞘结构紊乱明显,可见鞘膜泡状解离,部分纤维轴浆空泡变,水肿软化灶消失,由胶质代替.各治疗组无明显差别。(3)视神经细胞、视网膜神经节细胞在急性视神经损伤模型建立后视神经减压术治疗在(1d)有差异(P<0.05),且有统计学意义。地塞米松、视神经管减压术,两者有差异(P<0.05)具有统计学意义。视神经减压术、地塞米松及减压地塞米松叁种治疗组与单纯损伤组在7天、21天个时间点均无差异(P>0.05),且无统计学意义。(4)视网膜上Caspase-3的免疫组化的检测视神经减压术、地塞米松及减压地塞米松叁种治疗与单纯损伤组在1天时间点有差异(P<0.05),且具统计学意义。与单纯损伤组在7天、21天个时间点均无差异(P>0.05),且无统计学意义。(5)视神经视网膜Nogo受体的免疫组化检测Nogo-A在正常成年大鼠视神经和视网膜中广泛分布。急性视神经损伤可以促使Nogo-A表达上调。视神经减压术、地塞米松及减压地塞米松叁种治疗与单纯损伤组在1天时间点有差异(P<0.05),且具统计学意义。与单纯损伤组在7天、21天个时间点均无差异(P>0.05),且无统计学意义。结论：(1)本研究通过临时动脉瘤夹闭视神经,可制造稳定的、可重复,易操作的用于视神经损伤手术或药物治疗观察研究的动物模型,通过假伤组视神经及视网膜神经节细胞及特殊分子生物学表达的统计学分析,假伤组与对照组验证本实验设计合理,可较好的运用视神经损伤实验动物造模；据细胞数目变化时间点得出视神经细胞凋亡时间可能迟于视网膜神经节细胞凋亡时间。(2)本研究结果显示：急性视神经损伤后RGC凋亡是一个随时间进行而发生的持续细胞凋亡过程。本实验视网膜神经节细胞计数表中单纯减压组细胞数低于单纯夹闭组,可能因视神经为大脑中枢神经的延续,与周围神经有本质的区别,神经鞘膜切开可能对视神经造成新的损伤；提示对于临床上外伤患者及时减压神经鞘外(骨性管、血肿)压迫结构,可能是较好的治疗手段。是否能通过测定不同程度损伤后视神经鞘内组织压,观察病理微环境改变来证实此假说。(3)急性视神经损伤可以促使Caspase-3阳性表达上调,表明Caspase-3可能在视神经损伤的神经再生过程中发挥着重要作用。Nogo-A在正常成年大鼠视神经和视网膜中广泛分布,急性视神经损伤可以促使Nogo-A表达上调,表明Nogo-A可能在视神经损伤的神经再生过程中发挥着重要作用。视神经免疫组化表达早于细胞形态变化表达,如何运用新的手段通过临床上超早期运用Caspase-3、Nogo-A抑制剂或其他治疗手段对阻止细胞凋亡死亡具有重要意义,下调Caspase-3阳性表达、Nogo-A阳性表达的手段可能就是临床疗效良好的手段。(4)在急性视神经损伤模型建立后视神经减压术治疗、地塞米松及减压地塞米松治疗可能在早期(1d)防止急性视神经损伤后RGC细胞凋亡,对急性视神经损伤后视神经及视网膜21天作用无明显差异,P>0.05,且无统计学意义,叁种治疗对急性视神经损伤后RGC细胞保护作用不确定。地塞米松的治疗应在一周,一周以上可能无效或可能产生相反作用机制。视神经特殊生理解剖特性,在一定损伤后病理溃变在目前治疗手段下具有不可逆转的趋势。原发视神经损伤程度决定预后。(5)本研究结果显示：叁种治疗方法不能有效减少视神经损伤后视神经视网膜神经节细胞的凋亡数目,但其确切机制需要进一步的研究。这一实验结果尚需进一步的分析。但叁者最终结果差异小,可能目前临床治疗手段不佳,手术减压需尽早去除鞘外压迫组织,治疗方向需要调整,仍需大量多方向多角度进一步研究。目前视神经损伤治疗应朝抗细胞凋亡方向发展。
参考文献：
[1]. 大剂量甲基强的松龙对大鼠视神经挤压伤后视网膜神经节细胞凋亡的影响[D]. 盛艳娟. 郑州大学. 2002
[2]. 视神经损伤后的病理溃变及手术及药物干预的实验研究[D]. 林琳. 新疆医科大学. 2014
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