赵巧辉[1]2008年在《家兔骨形态发生蛋白-7（BMP-7）cDNA的克隆与表达》文中提出本研究主要目的是对家兔BMP-7基因的结构特征进行分析,为研究BMP-7基因在胚胎的发生和发育以及其它生殖生理过程的作用提供参考。主要得到以下一些结论:1)结合数据库已有的兔BMF-7基因部分编码序列,采用RT-PCR与RACE技术,从家兔肾脏组织中克隆到一条长1654bp包含了家兔BMP-7基因大部分cDNA的序列(GenBank:EU004072;EF583950;EU599645),该基因序列含有信号肽段除外的其它区段(缺少第1位氨基酸的前肽和成熟蛋白):446 bp长的3'非翻译序列(3'UTR)。其中,417bp,编码139个氨基酸残基的成熟肽CDS,其编码蛋白的理论分子量为15.6 kDa,理论等电点(PI)为8.04。该序列将已有的序列向5'和3'端分别延伸了395 bp和640 bp。2)序列对比表明,克隆的家兔BMP-7基因CDS部分(1205 bp)人、小鼠的对应序列的相似性分别为91.89%、89.32%,预测的氨基酸序列相似性分别为96.51%、96.01%。家兔BMP-7 3'UTR长446 bp,具有2个转录终止信号(AAUAAA)位点和poly(A)_(11),与人、小鼠、牛、猪BMP-7 mRNA 3'UTR的相似性分别50.30%、41.45%、47.84%和57.91%。推测的家兔BMP-7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。因此,我们成功地克隆了BMP-7的大部分cDNA序列。另外,家兔BMP-7 3'UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。3)对家兔BMP-7基因的体内表达情况进行了分析,发现BMP-7基因在2月龄家兔体内许多组织中都表达。其中,BMP-7基因在心、脾组织以低丰度表达,在肺、脊髓、十二指肠以中等丰度表达,在肝、肾、脑中以高丰度表达。4)将家兔BMV7基因的成熟肽段克隆入pET32a原核表达载体后,成功构建了家兔BMp-7基因的原核表达系统pET32a-BMP-7/BL21(DE3)和pET32a-BMP-7/BL21(DE3)PlysS。表达的融合蛋白质大小约为33.2 kDa,包括了15.6 kDa的家兔BMP-7目的蛋白和17.6kDa的pET32a表达载体蛋白。根据目的蛋白的表达量,优化了IPTG诱导pET32a-BMP-7/BL21(DE3)表达的适宜条件。低温(20℃～30℃)条件下,IPTG诱导pET32a-BMP-7/BL21(DE3)表达时,IPTG浓度不可过低,而为减少包涵体的形成,以26℃～30℃,0.1 mM IPTG,5 h诱导其表达;20℃～25℃,0.2 mM IPTG,8 h诱导其表达较合适。
梁晖[2]2004年在《人骨形态发生蛋白-7（BMP-7）成熟肽编码序列的克隆与表达》文中进行了进一步梳理骨形态发生蛋白-7(BMP-7)又称为成骨蛋白-1(OP-1)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族。BMP-7是由431个氨基酸组成的糖蛋白，其信号肽和前结构域分别有29个和263个氨基酸，在Arg-292与Ser-293之间断裂后，释放出由139个氨基酸组成的成熟肽，体内以同二聚体的方式来完成其生物学功能。在组织水平，BMP-7成熟肽与Ⅰ型胶原蛋白缓释体移入骨干缺损部位后，能够促进新骨生成，显示出应用于骨、关节及软骨缺陷修复的良好前景。在细胞水平，BMP-7成熟肽可以促进成骨细胞与软骨细胞分化。除此之外，BMP-7在胚胎发育、器官发生与功能形成过程中起到了重要的调节作用。因此，利用基因工程的方法生产BMP-7成熟肽不仅可以服务于基础研究，而且具有很好的临床应用价值。 扩增出BMP-7成熟肽编码序列片段(877bp-1293bp)，此片段经BamHⅠ、PstⅠ酶切处理后定向克隆入表达载体pQE30。重组表达载体pQE30／BMP-7转化入大肠杆菌M15[pREP4]中进行诱导表达。6xHis-BMP-7融合蛋白分子量为16.78kD,主要以包涵体形式存在，可被人BMP-7多克隆抗体识别。经表达条件优化后，该融合蛋白占菌体总蛋白的41.95％。在变性条件下，通过Ni-NTA金属螯合亲合层析柱对表达产物进行初步纯化，再经梯度透析进行复性，得到该融合蛋白的纯品，产量约为58.8mg／L培养基。该融合蛋白能够使人成骨肉瘤细胞系MG63细胞中的碱性磷酸酶活性升高，且呈剂量依赖性关系。证实该重组融合蛋白在体外具有BMP-7生物学活性。
刘蕾[3]2007年在《人骨形态发生蛋白-7成熟肽的表达及其生物学活性的初步研究》文中认为骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)是一种多功能蛋白，是转化生长因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族成员之一，为目前发现的一类具有异位成骨能力的细胞因子，它能刺激间充质细胞向成骨细胞分化。人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)又称为成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1，OP-1)，由于其具有较强的骨诱导能力而受到人们广泛关注。它与Ⅰ型胶原蛋白的缓释体移入骨干缺损部位，会导致有功能的新骨形成，显示出应用于骨与关节及软骨缺损修复的前景。而且同时对神经系统、造血系统的分化发育也有调控作用。hBMP-7基因编码431个氨基酸，由N端的信号肽、中间区域的前肽和C端的成熟肽叁部分组成，翻译后的前体需要进一步的加工修饰，包括切掉信号肽和前肽，其成骨活性主要表现在C端的成熟肽区。hBMP-7成熟肽含有139个氨基酸，单体分子量约15.7kD，带有3个糖基化位点及7个半胱氨酸残基。天然hBMP-7存在同源或异源二聚体形式，二聚体的hBMP-7是其生物学活性的主要形式。制备hBMP-7成熟肽主要的研究工作包括以下叁个方面：1．采用pMAL-p2x表达载体，在原核系统中获得了hBMP7-MBP融合蛋白的可溶性高效表达，并通过亲和纯化得到纯度约为80％的融合蛋白，利用Factor Xa蛋白酶对融合蛋白酶切后，得到目的蛋白hBMP-7成熟肽，以单体形式存在。2．鉴于毕氏酵母(Pichia pastoris)表达系统能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折迭和修饰，糖基化形式更接近于高等真核生物，因此选用此表达系统，将hBMP-7成熟肽基因克隆入表达载体pPIC9K，用SalⅠ酶将重组质粒线性化，电转化入Pichia pastoris SMD1168细胞，G418抗性筛选出阳性整合子，确定Mut~+表型进行甲醇快速诱导，并对其培养和诱导条件进行一定的探索和优化。经过整合子的筛选和表达条件的优化，最终筛选到目的蛋白表达量占上清蛋白8％的分泌表达株，表达量为0.6mg／L，酶联免疫检测及蛋白印迹结果表明，表达的重组蛋白与抗hBMP-7抗体具有特异结合活性，提示重组表达蛋白具有天然蛋白的分子构象。3．为了提高目的蛋白的表达量，依据毕氏酵母的密码子偏好性，对hBMP-7成熟肽基因进行基因修饰，最终确定以含叁个精氨酸突变位点的酵母菌作为表达株进行扩大培养，经Ni-NTA柱纯化得到纯度为80％的蛋白样品，基因修饰后的hBMP-7成熟肽在毕氏酵母中的表达水平提高了约4倍，产量为2.5mg／L。所得hBMP-7成熟肽在还原状态下以分子量约18kD的单体形式存在，在非还原状态下以二聚体形式存在，分子量约为36kD左右，重组蛋白经PNGase F糖苷酶酶切分析证明其在毕氏酵母中发生了N糖基化。细胞学实验证实制备的hBMP-7成熟肽具有一定的生物学活性，能够促进成纤维细胞向成骨细胞转化。综上所述，本研究利用毕氏酵母系统成功分泌表达了hBMP-7成熟肽，并能形成有生物学活性的二聚体形式，为今后hBMP-7的功能研究奠定了基础。
梁晖, 王宝利, 梁东春, 郭刚, 张镜宇[4]2004年在《人骨形态发生蛋白-7成熟肽毕赤酵母表达重组子的构建》文中指出目的 :构建人骨形态发生蛋白 -7(bonemorphgeneticprotein -7,BMP -7)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达重组子。方法 :以本室保存的重组质粒 pBV220/BMP -7为模板,经PCR扩增出人BMP -7成熟肽编码序列 ,先以A -T连接方式克隆入pGEM -Teasy载体,再将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9中,重组质粒线性化后PEG法转化入毕赤酵母菌株GS115,用PCR方法筛选转化子。结果 :DNA序列分析和PCR鉴定表明成功构建了人骨形成蛋白 -7(BMP -7)毕赤酵母表达重组子。结论 :为今后基因工程大量生产BMP -7打下基础。
薛俊英[5]2017年在《利用U2-OS细胞表达rhBMP-7的研究》文中提出人骨形态发生蛋白-7(Human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7),又名成骨蛋白-1(Osteogenic Protein,OP-1),属于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族。hBMP-7能够诱导动物或人间充质干细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织,在临床骨科领域中具有广阔的应用前景,可用于促进脊柱融合和治疗骨折、骨缺损、骨不连、股骨头缺血性坏死等。但是,在基因工程表达该蛋白的过程中遇到了一些难以克服的难题:原核表达系统由于缺乏翻译后加工、修饰机制,使表达的蛋白复性困难;毕赤酵母的糖基化形式与人类存在差异亦不利于该蛋白的表达;CHO细胞表达的重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)虽有活性,但是表达量很低,尚不具备产业化条件,因此,国内外生产此蛋白的公司极少,价格昂贵。所以,能否克服如上困难是rhBMP-7能否真正实现产业化的关键。目的:人源癌细胞具有完整的翻译后加工机制、可无限增殖和体外易培养的特点,能否让其“弃恶从善”用于表达具有临床应用价值、结构复杂的蛋白质是一个具有挑战性的课题。本研究拟利用人源癌细胞U2-OS进行rhBMP-7蛋白的表达,以探讨人骨肉瘤U2-OS细胞作为表达系统表达rhBMP-7的可行性,本研究有可能为复杂结构蛋白质的高效表达提供一种新的解决方案。方法:(1)rhBMP-7在U2-OS细胞中的表达:构建真核表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7,利用Lipofectamine2000将真核表达质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR法检测rhBMP-7基因在mRNA水平上的表达;Western Blot法检测rhBMP-7的表达。(2)分泌性rhBMP-7的表达:分析叁种信号肽(hBMP-7自身信号肽B7、人基质金属蛋白酶-9信号肽M9、人纤溶酶原信号肽SP)对U2-OS细胞分泌表达rhBMP-7的影响。构建真核表达质粒pcDNA3.1-rhB7-h BMP7、pcDNA3.1-rhSP-hBMP7、pcDNA3.1-rhM9-hBMP7。利用Lipofectamine2000将真核表达质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR法检测rhBMP-7基因在mRNA水平上的表达,Western Blot法检测U2-OS细胞内与其培养基中分泌表达的rhBMP-7。在Western Blot检测分泌表达的rhBMP-7的基础上进一步利用ELISA检测U2-OS细胞内与细胞外分泌表达的rhBMP-7。(3)rhBMP-7的纯化与分析:选用亲和层析法纯化细胞分泌表达的rhBMP-7蛋白;通过糖苷内切酶酶切样品rhBMP-7,对其进行糖基化分析;纯化的rhBMP-7作用于NIH3T3细胞,通过检测NIH3T3细胞的ALP活性,分析rhBMP-7的生物活性。结果:(1)Western Blot结果显示rhBMP-7蛋白分子量为65-75KDa,实验组细胞中rhBMP-7表达量高于阴性对照组。结果表明rhBMP-7可在U2-OS细胞中表达。(2)研究分泌性rhBMP-7的表达中,通过Western Blot与ELISA检测U2-OS细胞内与细胞外分泌表达的rhBMP-7,结果表明U2-OS细胞内与细胞外均有表达rhBMP-7。ELISA结果显示细胞外表达的rh BMP-7蛋白量高于细胞内表达的rhBMP-7,说明rhBMP-7实现了分泌表达,而且hBMP-7自身信号肽引导的U2-OS细胞分泌表达的rhBMP-7蛋白量较高。(3)经镍柱纯化得到rhBMP-7蛋白,通过BCA法测得rhBMP-7蛋白浓度为28.3mg/L,在缓冲液中可完全溶解。rhBMP-7经SDS-PAGE电泳显示条带单一,纯度较好。(4)通过糖苷内切酶(Endo H)酶切rhBMP-7对其进行糖基化分析。未经Endo H酶切的rhBMP-7单体rhBMP-7蛋白分子量为34-40KDa,二聚体rhBMP-7蛋白分子量为65-75KDa。经Endo H酶切的rhBMP-7单体蛋白分子量为17-20KDa,二聚体rh BMP-7蛋白分子量为34-40KDa。根据Endo H酶切rhBMP-7的结果得出:U2-OS细胞对表达rhBMP-7蛋白进行了糖基化修饰。(5)rhBMP-7对NIH3T3细胞碱性磷酸酶(ALP)的影响结果显示:含rhBMP-7培养基使NIH3T3细胞的ALP活性明显增强,而且呈现出明显的量、效关系,表明U2-OS细胞表达的rhBMP-7具有生物活性。结论:(1)本实验结果表明,可以利用U2-OS细胞表达rhBMP-7,而且信号肽会影响细胞对表达蛋白的分泌效率;hBMP-7自身信号肽引导U2-OS细胞分泌表达rhBMP-7的蛋白量较高。(2)U2-OS细胞对表达rhBMP-7蛋白进行了糖基化修饰,蛋白可溶。生物活性检测结果表明U2-OS细胞表达的rhBMP-7具有生物活性。(3)本实验的结果表明:U2-OS细胞可作为表达系统进行复杂结构蛋白质的制备,此为今后大规模表达和制备结构复杂的细胞因子、人源抗体、疫苗等奠定了实验基础。
黄义德[6]2008年在《外源蛋白在毕赤酵母中表达策略—人骨形态发生蛋白4和7的表达研究》文中研究表明作为单细胞真核生物的毕赤酵母(Pichia pastoris),自开发成外源蛋白表达系统后,倍受研究者们的关注。但Pichia pastoris表达系统还存在一此不够完善的地方,主要表现在以下几个方面:①Pichia pastoris糖基化方式与高等真核生物如哺乳动物存在差别。②外源蛋白在Pichia pastoris中的表达还不稳定。有些能达到克级每升,甚至十几克,而更多的只能达到微克.毫克级的水平。③对于具有前导肽的外源蛋白,目前还很少有报道在Pichia pastoris中表达。Pichia pastoris表达外源蛋白的糖基人源化改造,已有好几个研究团队在进行,且成绩显着。因此,本研究拟在后两个问题上开展研究工作,以期提供一些解决方案。人骨形态发生蛋白(human Bone Morphogenetic Protein hBMP)4、7是TGF-β超家族BMPs亚族的成员,该亚族成员以前体蛋白的形式被翻译,前体蛋白由信号肽、前导肽和成熟肽组成。前体蛋白被分泌后,经加工,切除信号肽和前导肽序列,最后释放出由两个成熟肽单体通过一个二硫键桥组成的二聚体糖蛋白。本研究以hBMP4、7做为报告蛋白,考查稀有密码子、低频密码子和多拷贝表达盒对其表达量的影响;并且探索hBMP4和7全序列在Pichia pastoris中的表达方案。hBMP4、7成熟肽序列亚克隆到Pichiapastoris表达载体pPIC9K中,构建重组质粒并转化P.pastoris宿主菌。摇床发酵表明,含单拷贝的hBMP4没有检测到信号,hBMP7的表达较低,表达量只有5.55mg/L。对hBMP4、7成熟肽序列分析发现,hBMP4中有两个精氨酸密码子使用频率为零,hBMP7中有叁个精氨酸密码子使用频率为零。是否是因为hBMP4、7成熟肽中稀有密码子影响了其在P.pastoris中的表达?为了探讨这个问题,本研究利用OE-PCR技术构建了hBMP4、7成熟肽突变序列,将密码子使用频率为零的精氨酸密码子突变成高频密码AGA。突变序列亚克隆到P.pastoris表达载体pPIC9K中进行表达研究。结果表明,突变后的hBMP4成熟肽序列能得到较好表达,表达量达到12mg/L;突变后的hBMP7成熟肽序列表达量也从原来的5.55mg/L增加到了23.59mg/L,表达量提高了近5倍。本研究结果说明了稀有密码子严重影响外源蛋白在P.pastoris中的表达。在hBMP4的成熟肽序列中,除了存在稀有密码子外,还有12个密码子使用频率在0.02-0.05之间的低频密码子,这些低频密码子对hBMP4表达量影响有多大?为了解决这个问题,本研究根据P.pastoris高表达蛋白密码子使用特点结合遗传算法设计了一套序列优化软件,该软件能实现在控制一定比例的AT%组成同时尽可能的使用高频密码子。利用该软件,设计了一条hBMP4成熟肽优化序列,并考查优化序列对hBMP4表达量的影响。结果表明,优化序列能使hBMP4更好的表达,表达量可达到48mg/L,与点突变序列相比表达量提高了3倍。除了密码子会对表达量的影响外,转录水平也会影响外源蛋白的表达。本研究为了考查外源基因的拷贝数对其表达量的影响,利用pAO815表达载体在体外构建了含hBMP7 1、3、5、7、9个拷贝的重组载体,并进行表达研究。研究表明,hBMP7的表达量与其拷贝数之间虽不成线性的关系,但总体上随着拷贝数的增加,表达量也随着增加,9拷贝的表达量约是单拷贝的6倍多。为了研究培养条件对hBMP4表达量和糖基化的影响,在摇瓶培养情况下,对细胞生长影响较大的几个参数如菌体浓度、起始pH值、甲醇浓度、诱导周期、温度和装量被研究。对于hBMP4表达水平来说,较适合的菌体浓度、起始pH值、甲醇浓度和诱导周期分别是OD600=10、pH6.0、1.5%和4-5次(每24h诱导一次)。用发酵罐高密度发酵培养时,hBMP4表达量是摇瓶培养的5倍多。培养条件的变化对hBMP4糖基化没有重大影响。在表达hBMP4、7时发现,hBMP4、7成熟肽在P.pastoris中表达只能得到单聚体,不能形成二聚体的天然构象,表达的hBMP4、7出现过糖基化和糖链不匀地现象,hBMP4还发现N端加工不完全现象。为了考查P.pastoris表达hBMP4、7是否具有生理活性,我们利用色谱层析技术对rhBMP4、7发酵液进行初步纯化,rhBMP4和7的纯度可分别达到83%和90%。纯化后的rhBMP4、7进行生理活性的检测,结果表明,P.pastoris表达的rhBMP4、7能诱导软骨细胞的产生,rhBMP4还能诱导成纤维细胞表达碱性磷酸酶,说明rhBMP4、7虽为单体结构,但具有一定的生理活性。hBMP4和hBMP7前体蛋白由信号肽、前导肽和成熟肽组成,因此是一个很好的研究含前导肽的外源蛋白全序列在P.pastoris中表达的模型。通过构建不同的表达载体进行研究,结果表明,将前导肽与成熟肽之间FURIN蛋白酶切位点R-X-X-R突变成P.pastoris分泌通过中的蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位点K-R-E-A能有效将前导肽从成熟肽中切离;只有Kex2酶切位点K-R还不能有效的将外源蛋白前导肽从成熟肽中完全切离。hBMP4的前导肽对其成熟肽的正确折迭有帮助。
秦楠, 洪雪莹, 陈其新, 李明, 路鹏[7]2011年在《家兔BMP7基因的原核表达及其适宜表达条件探索》文中指出为实现家兔BMP7基因原核表达及探索适宜的表达条件,采用PCR技术从pMD18-T-BMP7重组质粒中扩增获得BMP7基因成熟肽片段(mBMP7),构建原核表达工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS,并比较温度、IPTG浓度、诱导时间等因素对目的蛋白表达的影响。结果表明,mBMP7原核表达载体构建正确;工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS经IPTG诱导均可表达含有家兔BMP7成熟肽的34KDa的融合蛋白,表达产物约占菌体总蛋白的30%。在37℃、0.75 mM IPTG以及诱导150 min时,能取得较高的目的蛋白表达量;在20℃低温条件下,IPTG浓度和诱导表达时间应分别以0.20 mM和7 h为宜;另外,目的蛋白表达对工程菌生长无明显的不利影响。因此,成功地构建了家兔BMP7基因工程菌,并确定了适宜的表达条件,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。
米东[8]2010年在《PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究》文中提出第一部分：PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究乳腺癌是一种常发性恶性肿瘤,是导致全世界女性死亡的主要因素。研究表明,在世界范围内,每年约有50万人死于乳腺癌。乳腺癌的一个突出的生物学特征是易发生转移。乳腺癌在发生初期,往往表现出过度增殖和凋亡减少,导致肿瘤细胞快速增殖。在晚期阶段,乳腺癌的转移成为导致病人死亡的一个重要因素,最常见的转移器官为骨,死于乳腺癌的患者中有80%都发生了骨转移。乳腺癌的发生和转移是一个多因素参与并通过多步骤完成的复杂过程。涉及正常乳腺上皮细胞转变成为多潜能分化的间充质细胞,并失控增殖生成原位癌；原位癌细胞的脱离和外侵；乳腺癌细胞的定向转移；乳腺癌细胞在靶器官的黏附和增殖。但其生物学过程和分子机制尚未明确,这严重影响了乳腺癌的治疗。PTHrP是从高钙血症相关的恶性肿瘤组织中分离出的一种蛋白质分子,由于其基因序列和结构与甲状旁腺激素(PTH)相类似而得名。PTHrP常常在骨转移肿瘤中检测到,PTHrP的过表达与肿瘤骨转移和预后有关。骨形态发生蛋白-6(Bone morphogenetic protein-6, BMP-6)是转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成员,其作用方式主要是通过与细胞膜上的BMP I型和Ⅱ型受体结合,并依靠Smad通路传递信号来调节细胞的生长和分化。除了在诱导成骨方面发挥重要作用外,BMP-6还是调控骨生长和器官发育的重要功能因子。近年来越来越多的研究表明BMP-6的异常表达与肿瘤的发生和转移密切相关。在乳腺癌细胞系和乳腺癌患者肿瘤标本中均发现BMP-6基因的异常表达。本研究通过定量PCR检测了35个乳腺癌标本中的PTHrP和BMP-6 mRNA的表达水平,结果发现在17个高表达PTHrP的标本中有12个低表达BMP-6,在18个低表达PTHrP的标本中有17个高表达BMP-6,表明PTHrP和BMP-6 mRNA的表达呈现负相关,这就提示我们PTHrP和BMP-6之间可能存在负调控关系。为阐明PTHrP抑制乳腺癌中BMP-6基因表达的分子机制,本文构建了人全长PTHrP cDNA表达载体,用不同浓度的PTHrP质粒转染MCF-7细胞,通过半定量和定量PCR检测发现PTHrP可剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6 mRNA的表达,通过Western-blot检测发现PTHrP可剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6的蛋白水平。用定量PCR检测发现外源转染的PTHrP可时间依赖性地抑制MCF-7中BMP-6 mRNA的表达。鉴于PTHrP在生物体内以多种多肽形式存在,为了进一步探讨PTHrP抑制BMP-6基因表达的分子机制,我们用氨基端多肽PTHrP (1-40)和羧基端多肽PTHrP (107-139)处理MCF-7细胞,结果发现仅PTHrP (1-40)剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6的mRNA和蛋白表达水平,而PTHrP (107-139)没有任何作用。接着,我们构建了长度为1.2kb的BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶表达质粒,通过荧光素酶活性分析该启动子对PTHrP(1-40)或PTHrP (107-139)刺激的应答活性,发现在剂量为10nM的PTHrP (1-40)的刺激下,BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶活性下调40%,剂量为100nM时活性下调73%,而PTHrP(107-139)对BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶活性没有作用。为了研究PTHrP (1-40)调控BMP-6基因表达的信号途径,我们采用了PKA、PKC、p38MAPK和MEK途径抑制剂,结果发现仅PKA信号途径抑制剂可以消除PTHrP (1-40)对BMP-6基因表达的抑制作用,此外发现PKA信号途径激活剂发挥与PTHrP (1-40)相似的抑制BMP-6基因启动子活性效果。此外,我们通过BMP-6基因沉默和过表达证实,PTHrP (1-40)通过下调BMP-6基因的表达抑制乳腺癌的增殖和细胞周期进程。综上所述,本部分实验证实PTHrP是BMP-6的上游分子,通过PKA信号途径抑制BMP-6基因的表达,进而通过下调BMP-6基因的表达抑制乳腺癌细胞的增殖。第二部分：人骨形态发生蛋白6在毕赤酵母中的分泌表达毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来快速发展起来的一种真核表达体系,和其它表达系统相比,有着无法比拟的优势,它既操作简单,易于扩大培养,适于工业化生产,又具有真核细胞翻译后修饰加工的特点。毕赤酵母表达系统已被越来越广泛地应用于外源重组蛋白的表达,到2005年为止,超过500种外源重组蛋白已经在毕赤酵母表达系统中成功表达。骨形态发生蛋白属于转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGF-β)超基因家族,是一种多功能的细胞调节因子,它不仅能够促进新骨的形成,还在细胞生长、分化、迁移、凋亡以及胚胎和器官发生中发挥重要作用。人骨形态发生蛋白6(BMP-6)参与调控机体泌尿和神经等系统的发育,影响细胞的增殖和凋亡,是细胞正常生长和发育的重要调节因子。BMP-6在体内先以前体蛋白(包括信号肽、前肽和成熟肽)合成,然后再经过翻译后修饰加工形成同源或异源二聚体来发挥其生物学功能。目前国内外重组骨形态发生蛋白的生产多见于真核哺乳动物和昆虫细胞,虽然活性较高,但是产量少而且成本高。而原核表达系统虽也能表达出有活性的骨形态发生蛋白,但由于缺乏蛋白质翻译后修饰加工机制,通常活性较低。本实验旨在利用毕赤酵母表达系统分泌表达hBMP-6蛋白。本实验首先以重组质粒pcDNA6A-BMP-6为模板通过PCR扩增hBMP-6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达载体pPIC9K中。重组质粒pPIC9K-hBMP-6经Sac I酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115, PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果表明获得的hBMP-6成熟肽以分子量约为34 kD和18kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性。
马敬[9]2011年在《利用油体蛋白表达系统表达人成骨蛋白的研究》文中研究表明人成骨蛋白-1(Human Osteogenic Protein 1, hOP-1),或称骨形成发生蛋白7(Bone Morphogenetic Protein 7, BMP7),是TGF-β超家族中的一员,具有诱导IOPC(inducible osteogenic precursor cells)类细胞向成骨细胞方向转化的蛋白质,具有广阔的临床应用前景。由于人骨源有限,直接从人骨中提取人成骨蛋白受到了限制,影响了临床应用。随着基因工程技术的发展,异源表达成骨蛋白成为可能。植物生物反应器已广泛应用于外源高经济附加值的药用蛋白、脂类及一些次生代谢产物等生物制剂的生产,其成本低,不仅能满足人们生产和生活的需要,而且可以拓宽植物的应用范围。利用植物油体表达系统表达人成骨蛋白有非常广泛的前景。植物种子中油体蛋白(oleosin)是一类镶嵌在油体表面的小分子碱性蛋白,在种子中高水平表达并大量积累,由于其脂溶性的特点,很容易将油体蛋白与种子中其他蛋白分开。而且当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的N端或C端后,不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位及表达,而且外源蛋白本身也能高水平表达。在油料作物种子中利用油体蛋白做载体生产药用蛋白及其它有用物质,具有独特的优越性。花生作为我国最重要的油料作物之一,既可以榨油和深加工,又可以生食,更为重要的是油体蛋白在花生种子中高水平表达并大量积累。所以,在花生种子中利用油体蛋白表达人成骨蛋白将具有广阔的前景。本研究初步建立了花生油体蛋白表达体系表达人成骨蛋白的植物生物反应器体系,并且在转基因烟草种子中进行了表达,为在花生中转化及利用该体系大规模生产人成骨蛋白和其它外源蛋白奠定了基础。研究内容和结果如下:人成骨蛋白-1基因密码子的优化:根据植物中密码子表达的偏好性,将本实验室已经克隆得到的人成骨蛋白-1基因的cDNA序列通过软件分析进行优化后重新合成序列,为在植物中高效表达人成骨蛋白奠定了基础。人成骨蛋白-1的原核表达:首先将人成骨蛋白-1基因的全长cDNA序列(420 bp),连接到原核表达载体PET28a上,在大肠杆菌中进行原核表达,实验结果显示人成骨蛋白-1能够正确表达,融合蛋白分子量约为15.7 KD,与预期大小基本一致。原核表达的蛋白可用于抗体制备及后期成骨蛋白检测研究。花生油体蛋白基因和启动子的克隆:根据NCBI中花生油体蛋白的基因序列,设计引物,克隆得到了花生油体蛋白的全长基因及其启动子。植物表达载体的构建和优化:将人成骨蛋白基因连接到花生油体蛋白基因的3’端,在油体蛋白基因和成骨蛋白基因间插入肠肽酶基因序列,便于后期重组蛋白从油体蛋白上的分离。构建由花生油体蛋白基因启动子驱动的“花生油体蛋白-肠肽酶-成骨蛋白”的融合植物表达载体。本研究还将pCAMBIA1301、pCAMBIA1302两个载体进行改造优化,将两个载体中的潮霉素(Hyg)抗性改为卡那(Kan)抗性,以降低研究及开发成本。遗传转化和表达验证:利用叶盘转化法转化烟草,通过RT-PCR的方法检测了人成骨蛋白基因在转基因烟草中的表达情况。结果表明在叶、花中没有检测到融合蛋白基因的表达,在种子中高水平表达。为了进一步验证结果,可以对pCAMBIA1301-oleosin-BMP-7-GUS和pCAMBIA1302-oleosin-BMP-7-GFP侵染后得到的转基因阳性植株进行GUS染色显示和GFP亚细胞定位来反映融合蛋白的表达情况。
参考文献：
[1]. 家兔骨形态发生蛋白-7（BMP-7）cDNA的克隆与表达[D]. 赵巧辉. 甘肃农业大学. 2008
[2]. 人骨形态发生蛋白-7（BMP-7）成熟肽编码序列的克隆与表达[D]. 梁晖. 天津医科大学. 2004
[3]. 人骨形态发生蛋白-7成熟肽的表达及其生物学活性的初步研究[D]. 刘蕾. 中国人民解放军军医进修学院. 2007
[4]. 人骨形态发生蛋白-7成熟肽毕赤酵母表达重组子的构建[J]. 梁晖, 王宝利, 梁东春, 郭刚, 张镜宇. 天津医科大学学报. 2004
[5]. 利用U2-OS细胞表达rhBMP-7的研究[D]. 薛俊英. 济南大学. 2017
[6]. 外源蛋白在毕赤酵母中表达策略—人骨形态发生蛋白4和7的表达研究[D]. 黄义德. 福建农林大学. 2008
[7]. 家兔BMP7基因的原核表达及其适宜表达条件探索[J]. 秦楠, 洪雪莹, 陈其新, 李明, 路鹏. 中国草食动物. 2011
[8]. PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究[D]. 米东. 南开大学. 2010
[9]. 利用油体蛋白表达系统表达人成骨蛋白的研究[D]. 马敬. 山东师范大学. 2011
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