【摘要】目的：探讨他克莫司对糖尿病肾病大鼠肾脏CTGF和FN表达的影响。方法：选取雄性SD大鼠28只，随机分为对照组、糖尿病肾病组、他克莫司组和贝那普利组，应用免疫组化的方法测定各组CTGF和FN的蛋白表达，应用RT-PCR的方法测定肾组织CTGF和FN mRNA的表达。结果：与对照组相比，糖尿病肾病组CTGF、FN、mRNA的表达明显增强（P<0.05），而他克莫司组的CTGF、FN、mRNA的表达明显下降（P<0.05）。结论：该疗法对糖尿病肾病有一定防治作用。
【关键词】糖尿病肾病；他克莫司；结缔组织生长因子；纤维连接蛋白
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）30-0030-03
【Abstract】Objective To investigate the effect of tacrolimus on the expression of CTGF and FN in kidney of diabetic nephropathy rats. Methods 28 male SD rats were randomly divided into control group, diabetic nephropathy group, tacrolimus group and Benner Pury group, immunohistochemistry was used to detected CTGF and FN protein expression method the determination of RT-PCR CTGF and FN mRNA in renal tissue. Results Compared with control group, diabetic nephropathy group CTGF, FN, mRNA expression was significantly increased (P<0.05), and the tacrolimus group CTGF, FN, mRN The expression of A was significantly decreased (P<0.05). Conclusion The treatment of diabetic nephropathy has a certain preventive effect
【Key words】Diabetic nephropathy; Tacrolimus; Connective tissue growth factor; Fibronectin
糖尿病肾病（DN）是糖尿病最主要微血管并发症，是导致终末期肾病（ESRD）最常见的原因[1]，近年来糖尿病肾病发病率不断上升，目前尚无有效的预防和干预手段。本研究通过建立糖尿病肾病大鼠模型，以贝那普利为阳性对照药物，探讨他克莫司对糖尿病肾病大鼠的肾脏保护作用及其机制。
1.材料与方法
1.1 动物模型的建立与实验分组
随机选取雄性SD大鼠28只，每只大鼠的体质量平均在220～280g之间，适应性喂养7天后，从中随机选取22只大鼠建立糖尿病模型，其余的6只大鼠设为正常对照组（N组），造模方法：每只大鼠均禁食12h后，单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ）60mg/kg（STZ溶于新配制的0.1M枸橼酸盐缓冲液），3日后尾静脉取血测血糖，当空腹检测血糖结果维持在13.9mmol/l或随机检测血糖结果在16.7mmol/l以上则为造模成功，本次实验中有4只大鼠未造模成功，给予剔除，其余造模成功的18只大鼠随机分为糖尿病肾病模型组（M组，n=6）、他克莫司干预组（F组，n=6）和贝那普利（洛汀新）干预组（L组，n=6）。F组在造模成功后予以他克莫司1mg/（kg·d）的剂量灌胃，L组在造模成功后予以洛汀新0.9mg/（kg·d）的剂量灌胃，M组和N组分别给予等量的蒸馏水灌胃。
1.2 标本采集
灌胃12周末处死大鼠。留取大鼠右肾组织置于10% 福尔马林固定液里进行病理、免疫组化检查，留取大鼠左肾组织速冻于液氮中封存以用于RT-PCR检测。
1.3 主要试剂
他克莫司（安斯泰来公司提供）；STZ（美国 Sigma）；贝那普利（洛汀新，诺华公司）；兔抗大鼠结缔组织生长因子（CTGF）多克隆抗体、兔抗大鼠纤维连接蛋白（FN）多克隆抗体（福建迈新）；Trizol（美国 invitrogen）；RT-PCR试剂盒（上海申能）；免疫组化试剂盒（福建迈新）。
1.4 肾组织病理
肾脏活检组织的取材、固定，石蜡包埋，制作石蜡切片，切片厚约3um，采取伊红染色（HE染色）。
1.5 免疫组化
借助于细胞单阳性（SP）来对大鼠肾组织中CTGF与FN的表达进行检测，并将 PBS缓冲液作为阴性对照。将细胞内有棕黄色颗粒作为阳性结果。对每张切片都在400倍视野下进行10个肾小管间质视野的随机选取，通过计算机病理图像分析系统来对其免疫组化结果进行半定量分析，然后运用积分吸光度（IOD）直接表示该阳性物质的含量值。
1.6 RT-PCR半定量测定
按照Trizol说明书来进行大鼠肾皮质总RNA的提取工作，然后取总RNA2ul逆转录合成cDNA，在该模板的基础上应用CTGF、PCR方法进行cDNA的扩增处理，其CTGF引物序如下：上游5′-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3′，下游5′-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3′，这一状态下退火温度42℃，产物184bp；此外FN引物序列表现如下：上游5’TAGCCCTGTCCAGGAGTAAT3’，下游5’CTGCAAGCCTTCGAGTACGA3’，退火温度为56℃，产物为163bp；GAPDH引物序列为：上游5’GTG GACATCCGCAAAGAC 3’，下游5’GGGTGTAACGCAACTAAG 3’，退火温度55℃，产物446bp；进行PCR产物的溴乙锭染色处理，然后就其吸光度值和内参GAPDH吸光度值两者的对比结果进行计算，其所得到的比值也就是该目的基因mRNA的相对值。
1.7 统计学方法
选SPSS 11.0软件作统计学分析研究，结果用均数±标准差表示，计量资料多组间比较采用方差分析，两组间比较采用 LSD检验。以P<0.05表示有统计学意义。
2.结果
2.1 各组肾组织形态学变化
N组（正常对照组）肾小球毛细血管开放良好，没有阶段硬化这一情况，此外N组肾小管上面的细胞呈整齐排列，在细胞间质中仅有少量炎细胞。M组（糖尿病肾病模型组）的肾小球体积明显增加，其系膜区增宽，并且存在有明显的系膜细胞与系膜基质增生情况，此外M组中有部分肾小球出现了节段性硬化情况。其病变区域的近曲小管有明显的细胞变形肿胀情况，在部分小管腔内可见蛋白管型。L（贝那普利干预组）和F组（他克莫司干预组）存在有肾小球轻度肿胀以及系膜区轻度增宽的情况，这两组的系膜细胞及系膜基质增生较模型组减轻，病变肾小球周围少数近曲小管上皮细胞变性，间质纤维增生和炎细胞浸润较M组（糖尿病肾病模型组）减轻。
2.2 肾组织中CTGF和FN免疫组化表达的变化
与N组（正常对照组）相比，M组（糖尿病肾病模型组）CTGF和FN在肾脏的表达明显增强（P<0.05），L组（贝那普利干预组）和F组（他克莫司干预组）与M组（糖尿病肾病模型组）相比CTGF和FN表达量明显下降（P<0.05），L组（贝那普利干预组）和F组（他克莫司干预组）相比差异无统计学意义（P>0.05）见表1。
3.讨论
他克莫司（FK506）是一种强力的新型免疫抑制剂，该抑制剂是从链霉菌属中分离出的发酵产物，可通过阻抑IL-2、IFN- g 等基因的转录、全面的抑制T淋巴细胞的增殖，这样就能够取得良好的淋巴细胞聚集抑制效果，并能够防止已经聚集了的淋巴细胞朝着炎性细胞进行发展。近年来他克莫司也在肝脏与肾脏抑制过程中得到了较为广泛的应用，并有着作为免疫抑制剂防止肾移植排斥反应以及进行慢性移植肾病的治疗等疗效。
糖尿病肾病是糖尿病患者最严重的合并症之一，在临床上表现为高血糖症、进行性的肾功能损毁以及血脂代谢紊乱等。近年来，我国的糖尿病肾病发病率呈增长趋势，截止目前已经成为造成终末期肾脏病的第二项原因，仅次于各类的肾小球肾炎。由于糖尿病肾病存在较为庞杂的血脂代谢紊乱，如果发展到终末期，会对机体造成不可逆的后果，因此，及时的预防与治疗糖尿病肾病的意义极其重要。糖尿病肾病的病理组织学特征，在光学显微镜下观察可见其生理改变是以肾小球肥大肾小球基底膜增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质（ECM）积聚，形成弥漫性或结节性肾小球硬化，临床早期出现蛋白尿，随着病情进展演变为终末期肾功能衰竭。ECM 主要由胶原糖蛋白和蛋白多糖等大分子物质构成，正常情况下，和胶原合成和降解处于一种动态平衡，一旦这种平衡被打破，将导致肾小球组织结构的破坏，长期高血糖刺激促使蛋白和胶原合成增加，降解减少，肾小球基底膜胶原堆积，致使肾小球基底膜增厚硬化。目前认为，二者合成和降解代谢的失衡是造成肾脏组织纤维化肾小球硬化糖尿病肾病形成的重要因素[2]。
结缔组织生长因子（CTGF）是一种广泛存活于体内的分泌性多肽，可以促进细胞肥大、促进细胞外基质合成与聚积，结缔组织生长因子（CTGF）在糖尿病肾病发生以及发展过程中起主要作用。而纤维连接蛋白（FN）广泛存在于动物组织和组织液当中，是一种大分子糖蛋白，具有多样的生物活性，纤维连接蛋白（FN）与许多疾病的病发以及病情发展有着密切的联系。因此，本文选择以肾组织中结缔组织生长因子（CTGF）和纤维连接蛋白（FN）的蛋白表达作为检测指标。
本研究结果显示，在正常对照组大鼠中CTGF和FN仅有少量表达，在糖尿病肾病大鼠肾组织中CTGF和FN表达明显增加，而他克莫司（FK506）能够下调CTGF和FN在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达，提示他克莫司（FK506）能够抑制病理状态下CTGF的过度表达，从而减少ECM合成，减轻肾脏纤维化，对糖尿病肾病大鼠有一定肾脏保护作用。
【参考文献】
[1] Mason RM,Wahab NA.Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy[J]．J Am Soc Nephrol.2003,(14):1358.
[2]于倩,张沫,刘德敏.TGF-β1、CTGF基因的过表达与早期糖尿病肾病关系的研究.天津医药,2012,20(4):262-265.
[3]闫萌,史丽萍.结缔组织生长因子与糖尿病肾病的研究进展, 河北联合大学学报( 医学版),2012,14(1):43-45.
论文作者:李聃丹,吴欣(通讯作者)
论文发表刊物:《医药前沿》2017年10月第30期
论文发表时间:2017/10/31
标签：肾小球论文; 糖尿病肾病论文; 大鼠论文; 肾脏论文; 细胞论文; 蛋白论文; 组织论文; 《医药前沿》2017年10月第30期论文;