高静[1]2003年在《疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus超氧化物歧化酶的分离纯化及性质研究》文中进行了进一步梳理超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称SOD）（EC.1.15.1.1）系一类金属酶，广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子（O2.-）发生歧化反应，从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中，发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同，超氧化物歧化酶主要可分为Cu-Zn-SOD（存在于真核生物），Mn-SOD（存在于原核生物和真核生物），Fe-SOD（存在于原核生物和高等植物的叶绿体中）等类型。Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸组成相似，可能起源于同一祖先。疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus是一种分布广泛的腐生真菌，它的生境多以植物秸秆、畜禽排泄物等的堆积发酵为主，能够在45℃~50℃的高温下很好的繁殖生长。而绝大多数的真核生物若长期暴露于40℃以上将无法存活。在嗜热菌领域，对超氧化物歧化酶的研究还不多，特别是在疏棉状嗜热丝孢菌chaetomium thermophile等嗜热真菌上，相关研究还未见报道。本文对疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus产生的超氧化物歧化酶进行了分离纯化及性质研究。粗酶液依次进行50%和65%硫酸铵分级分离沉淀，DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，Phenyl-Sepharose疏水柱层析以及Sephacryl S-100分子筛层析后，获得了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）谱带单一的超氧化物歧化酶。在本研究的整个分离纯化过程中，酶的比活力由最初的65.3U/mg升高到最终的1769.2U/mg，纯化倍数为27.09。分别用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法和Sephacryl S-100凝胶过滤层析的方法，测定出本研究所获得的超氧化物歧化酶的分子量分别为22.4kDa和89.1kDa。证明在本研究中所得到的超氧化物歧化酶是一种由相同的4个亚基所构成的蛋白质。本研究所得到的超氧化物歧化酶的反应最适温度为55℃，酶的反应最适pH值为8.0。同时，该超氧化物歧化酶也具有较好的热稳定性和pH值稳定性。在pH值为8.0的条件下，该酶在50℃和60℃时是基本稳定的，在60℃时保温1h，酶的活<WP=9>性损失仅为10％；70℃时保温1h后，仍保留有49％的酶活性；在80℃时，酶的半衰期约为28min；甚至在90℃时保温20min后，仍有19%的相对酶活性。50℃时，在相应缓冲液中保温1h的条件下，在pH值7.0～8.0的范围内，酶的相对活性仍保有94％以上，在pH值6.5～9.0的范围内，该超氧化物歧化酶仍保留有50％以上的相对活性。不同的金属离子，对酶活性的影响差异十分显着。其中Mn2+、Na+和Ca2+均对酶表现出明显的激活作用； K+、Mg2+、Zn2+、 Fe2+、 Ba2+、Cu2+和NH4+对该酶表现出抑制作用；Ag+、Hg2+、Al3+的存在则强烈抑制酶活性。对所纯化的酶中含有的金属辅基的类型进行了测定。结果发现，该超氧化物歧化酶对KCN和H2O2均不敏感，因而可以断定，本研究所纯化的超氧化物歧化酶为一种含金属锰的酶分子（Mn-SOD）。
庞飒[2]2001年在《超氧化物岐化酶的分离纯化与性质研究》文中认为不同类型的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)在许多理化性质上存在差异，如分子量、等电点、对热的稳定性以及对某些化学试剂的敏感程度。同时，不同种类的SOD在不同提取材料中的含量及分布部位也不尽相同。因此，针对不同来源、不同种类的SOD，采用的分离方法也有所区别。从猪血、螺旋藻、柑橘叶、猪肝中提取不同种类的SOD也就遵照了以上思路。 猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇-氯仿混合液除去血红蛋白，然后用K_2HPO_4 3H_2O萃取、丙酮沉淀、55-65℃热变性得到粗酶液。粗酶液上阴离子DEAE-Cellulose 52交换层析柱、分子筛Sephadex G-75柱，最终获得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶(Copper-and zinc-containing superoxide dismutase,Cu／Zn-SOD)。 螺旋藻经超声波破碎、50℃热变性、硫酸铵分级盐析、透析后得到粗酶液，然后上阴离子DEAE-Sepharose Fast Flow交换层析柱、阳离子CM-Sepharose FastFlow交换层析柱、分子筛Sephadex G-100柱，最终获得纯化的铁超氧化物歧化酶(Iron-containing superoxide dismutase,Fe-SOD)。 柑橘叶Fe-SOD、猪肝锰超氧化物歧化酶(Manganese-containing superoxidedismutase,Mn-SOD)分离纯化的过程与螺旋藻Fe-SOD大致相同，主要区别在前两者是剪碎，后者是超声波破碎；此外，硫酸铵分级盐析的梯度也不相同。 不同来源的纯化超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测基本上为单一条带，证明为纯化单一蛋白。紫外分光光度计、原子吸收分光光度计分别测定了不同来源的纯化SOD的吸收光谱及金属元素含量，证明它们分别是猪血Cu／Zn-SOD、螺旋藻Fe-SOD、柑橘叶Fe-SOD、猪肝Mn-SOD。 Sephadex G-75凝胶柱层析测定了猪血Cu／Zn-SOD、螺旋藻Fe-SOD、柑橘 W。A4＿＿。。＿＿WU 歹’刁XirkAIMWgr 叶Fe－SOD、猪肝Mn－SOD的分子量，依次为30，000、35000、453000、44，000， 数据基本上与文献吻合。十二烷基硫酸钠－聚丙烯酞胺凝胶电泳旧DS－PAGE） 测定了以上 SOD亚基的分子量，依次为 15，000、17，500、22，500、22，000，证 明猪血Cu／Zn－SOD、螺旋藻Fe－SOD、柑橘叶Fe－SOD、猪肝Mn－SOD均是由两 个亚基组成。 此外，不同来源的纯化SOD分子稳定性实验发现，ho－SOD、Fe－SOD对；热稳定性非常高，CobSOD稍差。另外，猪血C毗小SOD对兀刀，和KCN十 分敏感，但不受氯仿－乙醇混合液的影响；螺旋藻与柑橘叶FeSOD对H。Oy 氯 仿－乙醇混合液敏感，而KCN无明显抑制作用；H。O。和KCN对猪肝NlilSOD 活性无明显抑制作用，但氯仿－乙醇混合液对它的活性有较大影响。
韩文清[3]2006年在《鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻SOD的分离纯化与性质研究》文中指出超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一种广泛存在于好氧生物细胞内、能专一清除生物体代谢过程中产生的超氧阴离子自由基的金属酶,它可以将超氧阴离子自由基(O_2~(.-))歧化为H_2O_2和O_2。目前已从细菌、藻类、高等植物、动物等多种生物体内分离得到,并通过多种方法应用到实际中,如化妆品、医药、食品、人及动植物许多疾病的检测方面。1996年内蒙古农业大学乔辰教授等在鄂尔多斯高原碱湖发现了4种螺旋藻,其中之一是产业化应用的藻种—钝顶螺旋藻。经初步研究该藻是一个纯天然耐低温、广温型藻种,可作为我国北方地区发展螺旋藻产业的重要螺旋藻种质资源。本文以鄂尔多斯高原碱湖的钝顶螺旋藻S_1为材料,分离纯化了其SOD,并对其性质进行了研究,并与以非洲Chad湖的钝顶螺旋藻S_2和墨西哥Sosa Texcoco湖的极大螺旋藻S_3分离提取的SOD进行了比较。一方面为了解不同螺旋藻品系中SOD的差异,另一方面为鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻SOD的开发和应用奠定理论基础。研究内容和结果如下:1 SOD的分离与纯化分别以鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻S_1、非洲Chad湖的钝顶螺旋藻S_2和墨西哥Sosa Texcoco湖的极大螺旋藻S_3为材料,采用超声波破碎、硫酸铵分级盐析、DEAE-FF离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析的纯化方法,制备3个螺旋藻样品的SOD。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、考马斯亮蓝R-250染色鉴定为一条带,确定从样品
李前勇[4]2010年在《猪铜蓝蛋白的纯化、性质、功能及其基因克隆与表达研究》文中研究说明铜蓝蛋白(Ceruloplasmin, EC1.16.3.,缩写为CP)是一种含铜的α2糖蛋白,广泛存在于人和动物体内,是人和动物生命活动中的一种重要金属蛋白酶,在动物体内铜的转运、细胞铁的代谢、胚胎及神经系统的发育、新生毛细血管的形成、自由基的清除等过程中发挥重要作用。铜蓝蛋白可以向机体各种组织细胞快速提供高效可利用的铜,满足各器官组织对铜营养的需要,经母乳在初生动物的早期阶段发挥了重要的营养作用,这些科学结论为将铜蓝蛋白作为畜禽的一种新型生物铜源进行开发利用提供了重要线索。猪是我国畜牧业中饲养最多、分布最广的一种重要家畜,铜不仅是其机体必需的微营养素,而且在一定的范围内高剂量的铜还作为一种重要促生长剂广泛使用,甚至滥用,无机铜的超量使用或滥用已经导致了猪发生铜中毒病、猪肉品质下降、养殖环境土壤板结、水体自洁力下降、铜资源严重浪费及影响人类健康等负面效应。因此,开发安全高效、经济适用、环境友好的畜禽生物铜源有着广阔的应用前景。本研究以我国着名叁大优良地方猪种——荣昌猪为试验材料,通过对猪血清铜蓝蛋白的分离纯化、生化特性、抑制动力学、部分功能以及对该蛋白质原基因克隆、生物信息学分析、荧光定量PCR表达量分析等的研究,获得了以下结果：1.采用25%的正丁醇脱脂、35-50%的饱和硫酸铵盐析、截留分子量为10000D的滤膜超滤、DEAE-Sepharose层析、羟基磷灰石柱层析、Superdex-200凝胶柱层析等技术对猪铜蓝蛋白进行了分离纯化,并用邻联大茴香胺检测法监测各纯化步骤溶液中铜蓝蛋白的酶活性,获得了经SDS-PAGE电泳为单带的铜蓝蛋白纯化产物,其酶的比活力提高了217.65倍,回收率达到32%。该蛋白分子量为123.5KD,等电点为5.08,含糖量为7.8%,每分子猪铜蓝蛋白分子中含有铜原子个数为6个,经SDS-PAGE电泳分析,该猪CP为单亚基蛋白质。酶促反应研究得知,所得猪铜蓝蛋白(氧化酶)的最适pH为5.5,pH5-10为其稳定环境；最适温度为55℃。在50～60℃下其酶活力稳定性最好。经对猪铜蓝蛋白(氧化酶)酶促反应常数研究,得出其酶促反应的初速度为24.75gmol／(L·min),Km值为0.95mmol／L,最大反应速度Vmax为0.1124μmol／L。2.研究了效应物对猪铜蓝蛋白酶活力的影响,结果表明猪铜蓝蛋白对胰蛋白酶、胃蛋白酶均有明显的抵抗能力；铜离子、铁离子、锌离子、锰离子和镁离子对铜蓝蛋白的酶活力均有抑制作用,并呈现随着这些金属离子浓度的增加该蛋白质的酶活力逐渐减弱的趋势；氯离子、EDTA、双氧水及迭氮化钠对猪铜蓝蛋白的酶活力也明显的抑制作用,其中迭氮化钠的抑制作用最强,EDTA的抑制作用最弱；柠檬酸、草酸、抗坏血酸对猪铜蓝蛋白的酶活力有抑制作用,并呈现浓度依赖关系,其中抗坏血酸对铜蓝蛋白的酶活力抑制作用为非竞争抑制作用,柠檬酸对铜蓝蛋白的酶活力抑制作用为竞争抑制作用,而尿素对该蛋白质的酶活力基本无明显的抑制作用。3.研究了铜蓝蛋白对猪脑垂体细胞分泌生长激素及对脾细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和亚群(CD4、CD8)增殖的影响,结果表明铜蓝蛋白可以促进猪脑垂体细胞生长激素的分泌,其中以加入0.4mg／ml的铜蓝蛋白换液培养8h的效果最好；同时,铜蓝蛋白可显着促进脾细胞、T淋巴细胞及亚群(CD4、CD8)、B淋巴细胞的增殖,其中以1.0mg/mL(终浓度为0.5mg/mL)的效果最好。这一结果说明铜蓝蛋白在细胞水平不仅可以促进猪垂体细胞分泌生长激素,还具有有丝分裂原的作用,可以刺激仔猪脾细胞、T淋巴细胞及亚群(CD4、CD8)、B淋巴细胞的分裂、增殖,提高仔猪免疫能力。研究结果丰富了铜蓝蛋白生理功能的内容,同时也为铜蓝蛋白作为一种新型有机生物铜源的开发和应用奠定了基础。4.给试验小鼠补充不同浓度的猪铜蓝蛋白研究了铜蓝蛋白对小鼠机体抗氧化能力及Cu-ATPase的影响,结果显示铜蓝蛋白可明显提高小鼠机体总抗氧化能力、Cu-ZnSOD的活性,提高小鼠肝脏组织中一氧化氮含量,减少机体丙二醛的含量,其中以腹腔注射4mg/只的效果最优,但对小鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活力作用不显着：铜蓝蛋白可有效提高小鼠肝脏组织中铜--ATP酶的含量,其中以腹腔注射4mg／只的效果最优。这一研究结果对铜蓝蛋白功能提供了的有益补充。5.通过RT-PCR技术,克隆了荣昌猪铜蓝蛋白基因,序列已登录在GenBank上,登录号为EU714006,基因cDNA长度为3181bp。其最大开放阅读框长度为3180bp,编码1060个氨基酸残基。经与家猪基因组序列比对分析,预测出猪铜蓝蛋白基因位于第13号染色体上,横跨于该染色体基因的42.463Kb-95.199Kb之间,有20个外显子、19个内含子。其推导的氨基酸序列与21个物种CP氨基酸序列比对分析,结果克隆出的猪CP氨基酸序列人CP的同源性最高,达到89%,而与与紫色海胆相似于CP的蛋白的氨基酸的同源性最低,仅为19.2%。经生物信息学软件预测,该蛋白质在19aa--20aa处有较强的信号肽,但无跨膜结构。系统进化树分析表明该基因存在较大的种属差异,但与人、马的亲缘关系较近,反映了在-定程度上该基因受到了人工选择压力的影响。6.通过对铜蓝蛋白基因在荣昌猪脑、心、肺、肝、脾、胃、肠、肾、膀胱及肌肉10种内脏器官组织中的荧光定量PCR表达谱差异比较分析,结果表明在1、15、30、45及60日龄5个不同生长阶段中,铜蓝蛋白基因在同一个器官的表达有差异；而在同一个生长阶段,该蛋白质基因在上述10个器官组织中的表达也有差异。初步揭示了铜蓝蛋白基因在仔猪5个生长阶段中可能具有参与铜的吸收和转运、促进免疫、调节机体铜代谢等功能。本课题获得的猪铜蓝蛋白理化特点及酶学特性、在细胞水平促进垂体生长激素的分泌及免疫细胞的增殖、提高机体CuZn—SOD及Cu—ATP酶活力、该蛋白质的原基因序列及基因在5个生长阶段不同内脏器官中的表达特点等研究结果,为猪铜蓝蛋白作为畜禽的一种新型高效、经济安全、环境友好的生物铜源的开发和利用提供重要的理论依据。
刘堰, 李清漪[5]1994年在《赤子爱胜蚓超氧化物歧化酶的纯化和部分性质研究》文中研究说明采用硫酸铵分级沉淀和柱层析的方法，从赤子爱胜蚓整体细胞抽提液内分离得到纯的铜锌超氧化物岐化酶（Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ）。每１００ｇ蚯蚓得到的ＳＯＤ制品，总活力为１１１５０Ｕ，比活力为５１３８Ｕ／ｍｇ蛋白，回收率为２０％。铜锌超氧化物岐化酶呈淡蓝绿色，最大紫外吸收波长为２７０ｎｍ。测得该酶分子量为３３０００，亚基分子量为１６５００。该酶亚基由１５６个氨基酸残基组成，不含酪氨酸。
苏伟[6]2016年在《鸭肫抗氧化肽特性及作用机理研究》文中进行了进一步梳理生物活性肽可作为高效、安全的生物制品,具有重要的研究价值和应用前景。鸭肫属优质蛋白资源,高值化开发利用是产业发展的方向。本论文以鸭肫蛋白为原料,通过可控酶解技术制备抗氧化肽;利用超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对产物进行逐级分离纯化,采用质谱技术对目标肽段进行一级氨基酸序列的鉴定;建立分子结构模型并验证抗氧化肽的定量构效关系;通过作用于细胞,分析细胞生长抑制、凋亡、生长周期以及细胞内抗氧化酶活性及酶蛋白表达,从分子机制进一步阐明鸭肫肽的抗氧化机理。本文旨为鸭肫蛋白的深度开发和应用,提升其资源高值化利用提供理论依据和技术支撑。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)分析了木瓜蛋白酶酶解液中氨基酸含量,其总氨基酸含量高达33594.73 mg/100 g,主要抗氧化性氨基酸含量达9.54%。在单因素实验基础上,以水解度和DPPH清除率为响应值,确定鸭肫蛋白酶解的最佳工艺条件为:酶解时间4.0 h、加酶量3000 U/g、酶解温度55℃、料液比1:3。在此条件下其水解度为28.30%,DPPH清除率为75.22%。其水解度与DPPH自由基清除能力之间不存在明显的相关性。(2)探讨了鸭肫不同分子量段ZT1(<3 kDa)、ZT2(3-10 kDa)和ZT3(>10kDa)产物抗氧化活性。其自由基DPPH清除率和ORAC活性值与其分子量呈显着相关性,分子量小于3kD产物DPPH清除率77.59%,ORAC活性值885.25μmol TE/g。小于3kD鸭肫抗氧化肽清除超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢以及DNA损伤的保护作用具明显的量效关系,其IC50值分别为14.58、0.0163、19.80和1.93mg/mL,鸭肫抗氧化肽对过氧化氢自由基抑制作用最强,对羟自由基活性的抑制作用最弱。(3)分离及鉴定鸭肫抗氧化活性肽。采用中空纤维素膜超滤法对酶解液进行初步分离,将ORAC值活性最高的组分(小于3kDa)使用凝胶色谱和半制备RP-HPLC进一步分离,将纯化的ORAC值活性较高的组分进行氨基酸序列分析鉴定,确定了两个新型的鸭肫抗氧化活性肽,分别为Ser-Ser-Tyr-Glu-Gly-Ile-Glu-Leu-Ile-Ile-Lys和Asn-Lys-Phe-Ile-Leu-Lys。(4)采用ACD/Labs软件对部分已知抗氧化肽化学结构信息进行描述,利用多元线性回归(MLR)、偏最小二乘回归(PLS)和人工神经网络(BPNN)分析方法建模,对抗氧化肽进行活性预测。MLR的线性拟合值为0.9915,PLS的线性拟合值为0.8313,BPNN线性拟合值0.99239,表明构建的神经网络模型具有较高的准确性和重现性。对MLR所建的模型进行F检验,可判定此方程显着。利用MLR、PLS和BPNN所建的模型分别对分离鉴定两个鸭肫抗氧肽DKFILK和SSYEGIELIIK验证,与ORAC活性值和氨基酸结构分析结果一致,进一步证实了组分DKFILK抗氧化活性更高。鸭肫抗氧化肽DKFILK的活性与其氨基酸组成及结构具有一定的关联。(5)鸭肫抗活性肽对人体前列腺增生细胞(BPH1)的抗氧化能力及其机理。不同浓度的鸭肫活性肽在作用48 h后,能明显抑制BPH细胞的增殖,促进其凋亡并且阻滞其细胞周期;当鸭肫活性肽的质量浓度为200310-3 g/L时,细胞中超氧化物岐化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活力分别提高了26.16%、20.24%和69.41%;采用qRT-PCR检测得出,细胞中CAT和GSH-Px mRNA的表达水平升高,SOD mRNA表达不明显,与鸭肫活性肽浓度呈正相关。鸭肫活性肽通过上调细胞内CAT和GSH-Px mRNA表达水平来削弱细胞自身的氧化损伤作用,发挥其抗氧化作用。
宋小青[7]2007年在《玉米SOD的分离与纯化》文中提出超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内广泛存在的一种抗氧化酶,可以将有氧代谢产生的超氧阴离子(O2-)歧化为分子氧和过氧化氢,在清除体内自由基的过程中起着非常重要的作用。鉴于SOD的抗氧化功能,国内外已经较为广泛地将SOD应用于医学、食品和化妆品等方面。本实验以玉米种子为原材料,经过40-80%硫酸铵分级沉淀、金属螯合亲和层析和DEAE-纤维素阴离子交换层析3个步骤对玉米SOD进行了分离纯化,得到2个Cu/Zn-SOD单组分-SOD-A和SOD-B和1个Mn-SOD组分-SOD-C,它们均达到了电泳纯。实验结果表明：SOD-A、SOD-B和SOD-C的亚基分子量分别为20 kD、16.4kD、26.2 kD；pI分别为7.2、6.9、5.3；比活力分别为5.47×103U·mg-1,4.07×103U·mg-1,3.64×103 U·mg-1；且这3个SOD组分相对于粗酶液的活力回收率约为18.6%。与以往报道一致,本次实验也未发现在玉米种子中有Fe-SOD的存在。需要强调的是：本实验分离纯化得到2个Cu/Zn-SOD组分-SOD-A和SOD-B,其中SOD-B的亚基分子量与所报道的玉米Cu/Zn-SOD的亚基分子量(16.8 kD)基本一致,而亚基分子量为20 kD的玉米Cu/Zn-SOD(即本实验提纯的SOD-A)却未见报道：同时本研究首次报道了玉米Mn-SOD组分-SOD-C的亚基分子量,此值与从朱桔中提取出来的Mn-SOD的亚基分子量(26.6 kD)相近。另外,本实验还对SOD-A和SOD-C的热稳定性、酸碱稳定性以及对变性剂的稳定性进行了研究,研究结果表明：SOD-A和SOD-C对热、酸碱的稳定性较好；但对于变性剂的稳定性,SOD-C的稳定性不及SOD-A的稳定性较好。
王霞[8]2011年在《一种耐高温SOD基因的克隆表达及其产物纯化和性质研究》文中认为本实验从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)的新菌株中获得一个耐高温超氧化物歧化酶基因(Superoxide Dismutase),全长1236 bp,编码411个氨基酸残基,其编码的蛋白分子量预计为47.25 kD。在对其进行生物信息学的分析后,发现在366-373位氨基酸残基处有一个SOD蛋白保守序列,其他物种中SOD也含有DVWEHAYY。预测其叁级结构具有9个α螺旋结构,3个呈栅栏状B折迭结构。为研究耐高温SOD蛋白的功能,将该基因的ORF克隆到表达载体pET-28a(+1的相应酶切位点,成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-SOD,并转化感受态细胞E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后,收集菌体,对裂解菌体的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,上清样品电泳发现有一特异性条带,与预期蛋白分子量48.07 kD相符。裂解菌体高速离心后的上清经镍柱亲和层析纯化后,获得的目的蛋白纯度达90%。该重组蛋白在90℃条件下处N2h仍具有活性,通过不同温度条件处理重组蛋白,可除去大部分杂蛋白而不影响重组蛋白的活性,纯度可达70%左右。此外,将目的片段克隆到杆状病毒转座载体pFastBac HTB中,利用Bac to Bac系统,构建重组Bacmid-SOD。通过脂质体转染家蚕培养细胞BmN,获得重组病毒,经PCR鉴定结果表明重组病毒构建成功。将重组病毒感染BmN细胞,发病后经Western blot和WST一1法鉴定,结果表明耐高温SOD基因在BmN细胞中成功表达。比较这两种不同体系表达的耐高温SOD蛋白,最终确立了利用原核系统构建的工程菌来发酵生产耐高温SOD蛋白。此外,利用Cy5荧光素标记发酵生产的耐高温SOD蛋白,通过小动物活体成像系统观察外源SOD在BALB/c小鼠体内的生物学分布,结果发现该耐高温SOD蛋白主要富集在小鼠的肾脏,而在心脏、脾脏等其他器官未见明显富集,给药1 h后,肾脏仍有富集,其具体作用机制尚待进一步研究。
陈秀琴[9]2013年在《鲍鱼内脏酶解蛋白质制备抗氧化肽的研究》文中认为鲍鱼是中国传统的名贵食材,含有丰富的蛋白质、钙、铁、碘和维生素A等营养物质,其营养价值是澳大利亚核桃的7倍。鲍鱼内脏占鲍鱼体重的20-30%,同样含有丰富的蛋白质等营养物质。由于鲍鱼有很高的食用与药用价值,可以带来很高的经济效益,对其加工的研究也越来越多。而在加工中同样具有药用价值的鲍鱼内脏则成为下脚料被废弃。从鲍鱼内脏中提取抗氧化肽很好地解决了鲍鱼内脏下脚料利用的问题。提取的抗氧化肽,不但可以作为功能性营养物质,还能有效清除体内过剩的活性氧自由基,保护细胞和线粒体的正常结构和功能,在预防和治疗自由基诱发的疾病和抗衰老方面有广泛的应用前景,同时也可作为抗氧化剂应用到食品加工行业中。本研究以鲍鱼内脏粗蛋白为实验材料,运用酶解法和超滤透析去盐法提取鲍鱼内脏中具有抗氧化活性的多肽,并通过体外和体内抗氧化活性测定实验综合评价其抗氧化活性,为促进鲍鱼内脏的综合开发和利用提供理论基础和技术支持。本研究的结果如下：1.以水解度和酶解物的还原性为指标,从中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶与碱性蛋白酶中确定了碱性蛋白酶为最佳的水解酶,其优化的酶解工艺条件为：pH值10,酶解时间5h,酶解温度45℃,酶用量为4500 μ/g,底物浓度为13%。2.确定了酶解产物纯化的工艺：在上述条件下获得的鲍鱼内脏蛋白质酶解液→超滤分离→加酸中和→去盐→冷冻干燥→抗氧化肽成品,确定了多肽的得率为69.40%。3.从多肽的总抗氧化活性、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力叁个方面评价两种不同分子量的抗氧化肽的抗氧化活性。测定结果表明分子量为0-3K的抗氧化肽的抗氧化活性大于3K-10K的抗氧化肽；当多肽浓度为1.94mg/ml时,其抗氧化活性与40ug/ml Vc的总抗氧化能力相当；其羟自由基平均抑制能力略高于40ug/ml的Vc；其清除超氧阴离子的平均活力单位为186.18 μ/g。鲍鱼内脏蛋白质抗氧化肽提取物具有较好的体外抗氧化活性,这是由于小分子量的多肽暴露出更多的活性基团,增加了其抗氧化活性。4.采用D-半乳糖衰老模型小白鼠进行动物实验,以小鼠中肝脏和血清中的谷胱甘肽、丙二醛以及超氧化物歧化酶的含量为指标,探索抗氧化肽的体内抗氧化活性。其结果为：阳性对照组和高剂量组的血清和肝脏中SOD和GSH的含量显着高于衰老组(p<0.05),并且血清和肝脏中MDA的含量显着低于衰老组,中剂量组血清中SOD的含量显着高于衰老组,中剂量组和低剂量组的肝脏和血清GSH和MDA的含量与衰老组没有显着差异(p>0.05),中剂量组肝脏中SOD的含量与衰老组没有显着差异,表明维生素C和鲍鱼内脏蛋白质中抗氧化肽提取物能够提高由D-半乳糖诱导的衰老小白鼠的抗氧化活力,抗氧化肽提取物能够有效防止机体受到氧化性物质的侵害,提高机体的抗氧化活力,具有体内抗氧化性并且具有剂量依赖关系。
杨就锦, 陈冰, 李嘉亮, 苏玉天, 谢施文[10]2014年在《金边龙舌兰超氧化物岐化酶的提取与特性研究》文中进行了进一步梳理金边龙舌兰经匀浆、丙酮沉淀、葡聚糖凝胶过滤等步骤,纯化获得2个超氧化物歧化酶(SOD)I和Ⅱ。该SODI和Ⅱ适应pH范围分别在4~11和4~10,pH分别为7和8时活性最高;均在60℃以下稳定,60℃能够保持较高的活力;分别在272.5和274.5 nm处有最大紫外光吸收;敏感性抑制试验证明,其活性均被氰化钾和过氧化氢所抑制,但不受氯仿-乙醇影响,与Cu·Zn-SOD相似。
参考文献：
[1]. 疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus超氧化物歧化酶的分离纯化及性质研究[D]. 高静. 山东农业大学. 2003
[2]. 超氧化物岐化酶的分离纯化与性质研究[D]. 庞飒. 浙江大学. 2001
[3]. 鄂尔多斯高原碱湖钝顶螺旋藻SOD的分离纯化与性质研究[D]. 韩文清. 内蒙古师范大学. 2006
[4]. 猪铜蓝蛋白的纯化、性质、功能及其基因克隆与表达研究[D]. 李前勇. 西南大学. 2010
[5]. 赤子爱胜蚓超氧化物歧化酶的纯化和部分性质研究[J]. 刘堰, 李清漪. 生物化学杂志. 1994
[6]. 鸭肫抗氧化肽特性及作用机理研究[D]. 苏伟. 贵州大学. 2016
[7]. 玉米SOD的分离与纯化[D]. 宋小青. 河北大学. 2007
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[9]. 鲍鱼内脏酶解蛋白质制备抗氧化肽的研究[D]. 陈秀琴. 福建农林大学. 2013
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