猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究

猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究

何启盖[1]2000年在《猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究》文中提出伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid HepervirusⅠ,SHV-Ⅰ)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病病毒的天然宿主和贮存者,本病可引起严重的繁殖障碍,给养猪业造成较大的经济损失。及时准确地诊断,并采用安全有效的疫苗进行免疫预防,是控制该病的主要措施。为了给我国的养猪业提供安全有效的疫苗和快速、特异的可在现场进行诊断的方法,因此,开展本研究。本研究由三个互相关联的试验组成。 1.TK/gG~-疫苗的研究 测定并比较了伪狂犬病病毒鄂A亲本毒株、基因缺失突变株及Bartha株在BHK-21细胞上的增殖滴度和对Balb/C小白鼠的LD_(50),说明对TK和gG基因的人工改造并未影响其在细胞上的生长能力;所有的TK基因突变株(包括TK~-/gG~-)对Balb/C小白鼠的毒力低于亲本毒株和Bartha株;亲本毒株、TK~-/gG~-/LacZ~+、Bartha株对成年家兔的LD_(50)。的高低顺序依次为:鄂A野毒株、TK~-/gG~-/LacZ~+、Bartha株:TK~-/gG~-/LacZ~+突变株与国外目前广泛使用的NIA-783株和Begonia株的残余毒力相近。用不同滴度的TK~-/gG~-/LacZ~+突变株接种血清学阴性妊娠母猪和1日龄仔猪,母猪均能正常产仔,无流产和产死胎、木乃伊胎,1日龄仔猪接种前后体温变化不显著(P>0.05),也不影响增重,对猪是安全的。 将TK~-/gG~-突变株在PK-15细胞上连续传25代,每间隔5代次用PCR均能检测到已经缺失了205bp的TK基因(758bp)和插入gG基因中的LacZ基因,表明各代次毒株的遗传标志是稳定的,从分子水平证明该突变株毒力不会返强。 将不同剂量的TK~-/gG~-/LacZ~+突变株接种抗体阴性猪,免疫猪后1个月,根据中和抗体水平和抗体阳转率的差异,确定了以10~(5.0)TCID_(50),为最小免疫剂量。 应用鸡胚成纤维细胞,采用转瓶培养方式增殖而获得的疫苗病毒含量为10~(6.3)TCIDs_(50)/mL,为免疫剂量的13倍,将疫苗病毒与明胶保护剂混合经冻干后制成了弱毒活疫苗。疫苗的安全性测定表明,该疫苗对Balb/C小白鼠、妊娠母猪是安全的;疫苗接种15同龄仔猪,不能引起接种猪的体温升高,哨兵猪的体温没有升高,也没有抗体阳转,说明疫苗毒株的毒力已极大下降,而且缺失了TK基因后使疫苗毒株丧失了从免疫猪向非免疫猪水平传播的能力。 用该疫苗免疫抗体阴性仔猪、育肥猪和母猪,1周后可检出中和抗体;在育肥猪中抗体可持续5个月左右,抗体阴性的商品猪只需免疫1次即可。但是对于有母源抗体的仔猪,采用间隔4周加强免疫比提高免疫剂量、只免疫1次的方法可更有效地克服母源抗体的干扰。与弱毒疫苗相比,用灭活疫苗免疫的母猪可给哺乳期的仔猪提供更高水平的母源抗体,但两者的持续期均为50-70天。 免疫效力测定说明,研制的TK~-/gG~-疫苗可于接种后1周能使Balb/C小鼠耐受华中农业大学博士学位论文:猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究IOOLD50野毒的攻击;免疫后1个月,也使妊娠母猪能抵抗高达1护。TCIDS。的强毒攻击,并给仔猪提供坚强的被动免疫保护。几种不同遗传背景的疫苗给小白鼠提供的保护力高低顺序依次为Ea TK一/gG一、Begonia、NIA一783、Bartha株;刺激猪产生的抗体水平依次为N工A一783、Ea TK一/gG一、Begonia、Bartha。疫苗置一20℃、一4℃可分别保存12个月、6个月。 综上所述,以鄂A株为亲本毒株构建的TK一/gG一基因缺失疫苗具有安全性高,免疫效果优于某些国外同类产品,生产工艺成熟,完全可以进入中试阶段的研究。2.伪狂犬病毒抗体乳胶凝集试验的建立 用BHK一21细胞增殖猪伪狂犬病毒鄂A株,病毒培养上清液经硫酸钱沉淀,聚乙二醇浓缩。浓缩病毒与等量经胰酶处理的空白乳胶致敏制成凝集试验抗原。用此抗原与伪狂犬病毒标准阳性血清,免疫猪血清和临床发病猪血清以及新鲜血样样品,均呈明显的凝集反应;与标准阴性血清和临床未感染猪伪狂犬病毒猪的血清均不发生凝集反应;与猪瘟阳性血清、衣原体阳性血清、均呈阴性反应,证实本试验具有很高的特异性,抗原可在4℃条件下保存12个月;该方法比中和试验敏感、特异,整个检测过程可在1一3分钟内完成,可用于实验室和现场对伪狂犬病毒抗体的定性和定量检测。3.伪狂犬病病毒gE基因转移载体的构建 从含有伪狂犬病病毒鄂A株Sph工一A片段的重组质粒pBSA中通过酶切、克隆和亚克隆获得大小约为4.IKb含gE基因的目的片段,克隆到pBluescriPt HSK(+)载体,随后引入BamHI接头,将报告基因LacZ表达盒插入BamHI接头中获得重组子,PCR扩增和酶切鉴定证明己构建伪狂犬病病毒gE基因插入失活的转移载体,为开展TK一/gE一突变株的构建奠定基础。

彭峰[2]2009年在《规模化猪场伪狂犬病控制、净化方案研究及推广应用》文中进行了进一步梳理伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的包括多种家畜和野生动物发病的一种烈性传染病,已给全球养猪业造成了巨大的经济损火。欧美等西方国家通过使用优质的基因标记疫苗和相应的鉴别诊断方法,已很好的控制或净化了该病,但在多数发展中国家,该病仍频繁发生,制约了其养猪业的健康发展。目前该病在我国仍呈暴发流行趋势,给养猪业造成巨大的经济损失,严重制约着中国养猪业的健康发展。只有建立PRV gE阴性种猪场,才能彻底控制本病,促进养猪业的健康发展。因此,作者开展了本研究。1、野毒感染情况进行调查与分析采用美国IDEXX公司的PRV gE试剂盒对河南省5家种猪场(A、B、C、D、E)进行PRV gE抗体监测。其中A、B场种猪PRV gE抗体只有少数猪只存在PRV gE抗体阳性,阳性率分别为1.6%和1%。C、D、E场全群猪的阳性率均较高,阳性率分别高达19.6%、21.3%和20%,野毒感染严重。2、强化免疫根据调查结果,对PRV gE高阳性种猪场(C、D)在实施国外某公司的猪伪狂犬病基因缺失活疫苗强化免疫:全群紧急免疫猪伪狂犬病基因缺失活疫苗,免疫时间为第0,6,10,15月,大小猪均为1头份。免疫后全部种猪全群采血检测PRV gE抗体,观察、分析抗体变化情况,并确定最佳免疫程序。对阳性率高的E场仅使用猪伪狂犬病基因缺失活疫苗进行常规免疫,免疫后定期采集血样抽检PRV gE抗体。3、淘汰带毒种猪、培育健康种猪群对PRV gE低阳性种猪场(A、B)全部种猪全群采血检测PRV gE抗体,发现PRV gE抗体阳性猪立即淘汰。高阳性率猪场(C、D)猪群免疫后一个月测定血清抗体,在种猪群PRV gE抗体低于15%、生长猪PRV gE抗体阳性率低于20%时,开始淘汰阳性猪,只引入伪狂犬PRV gE抗体阴性后备猪,然后实施常规免疫。E场为对照场,仅采取常规免疫策略。常规免疫程序如下:怀孕母猪产前3~4周接种一次,每次1头份;后备猪配前2周接种一次,每次1头份,以后每胎产前3~4周免疫一次;免疫母猪所产仔猪8~12周龄免疫一次,每次1头份;种公猪每4个月免疫一次,每次1头份。4、净化措施的制定与实施根据PRV感染情况调查结果、确定的最佳免疫程序、严格淘汰阳性感染猪的措施和效果,对检测数据系统的统计、分析,总结各种猪场健康现状以及PRV净化和防制措施,结合饲养管理、卫生、消毒等综合防制技术,制定出完整的PRV净化方案和措施,同时包括完善猪场的生物安全措施、细化生产管理、结合卫生消毒、严格引种检疫、禁止养狗、猫和灭鼠措施等,对4个规模化种猪场实施猪伪狂犬病净化。通过3年的试验研究,成功净化4个种猪场的全部种猪:A场PRV gE野毒阳性率由1.6%降至0;B场野毒阳性率由1%降至0;C场野毒阳性率由19.6%降至0;D场由21.3%降至0。最终使生产种公母猪全部净化为阴性猪群,达到显著提升猪场的生产成绩和效益的结果。

郝飞, 汤德元, 曾智勇, 李春燕, 罗险峰[3]2013年在《猪伪狂犬病基因工程疫苗的研究进展》文中认为猪伪狂犬病(PR)是由疱疹病毒目伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物发病的一种急性传染病。猪感染后表现为仔猪神经症状、严重的呼吸道疾病以及母猪发生流产、死产和产仔数下降等症状。现阶段该病存在潜伏感染、高感染率和高发病率等特点,给其防治带来了巨大困难,同时给世界养猪业造成了巨大的损失。在该病的防治过程中,疫苗免疫接种起着至关重要的作用。本文对当今广泛应用的猪伪狂犬病基因工程疫苗的研究现状和进展进行综述,以期为猪伪狂犬病的预防、净化和根除提供参考。

梁祺英, 王世坤, 司红彬[4]2017年在《猪伪狂犬病的研究进展》文中研究说明猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起不同生长阶段猪发生的一种急性、高度接触性传染病。该病是危害养猪业健康发展的重大疫病之一,给养猪业造成了巨大的经济损失。近年来,国内外学者对猪伪狂犬病进行了广泛研究。从病原学和防控措施等方面对该病的研究进展进行了综述,以期为该病的有效防控提供有益参考。

牛晓芸, 赖月辉, 黄秋雪, 牛贝贝, 吴文福[5]2017年在《猪伪狂犬病疫苗的研究进展》文中研究说明伪狂犬病是影响养猪业的重要传染病,一旦发病很难根除,给养猪业造成严重的经济损失。本病目前尚无有效药物治疗,免疫接种是预防和控制本病的主要措施。本文综述了目前防治伪狂犬病主要使用的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因疫苗3类疫苗,并展望了未来伪狂犬病疫苗的发展方向。

张姗姗, 冷雪, 时坤, 李健明, 宫庆龙[6]2018年在《猪伪狂犬病流行状况和疫苗应用的研究进展》文中研究说明近年来,猪伪狂犬病在国内许多Bartha-K61疫苗免疫的猪场暴发,传播迅速,严重危害我国养猪业的发展,引起了广泛关注和研究。相关研究表明,引起该病大规模暴发的病原为发生变异的猪伪狂犬病病毒(PRV),多数猪场的PRV野毒株感染普遍存在,因此,有必要对新型伪狂犬病病毒变异株的抗原性、致病性和分子特征及其疫苗的研制等方面进行研究。针对我国猪伪狂犬病的流行和疫苗应用的研究进展进行阐述,以便为研制新型疫苗及猪伪狂犬病的防控提供参考。

李国新, 童武, 郑浩, 童光志[7]2016年在《猪伪狂犬病毒变异毒株的特性及其疫苗的研究现状》文中研究说明猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病在我国发生较为严重,是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国于20世纪70年代从匈牙利引进了伪狂犬疫苗Bartha-k61株,自20世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该基因缺失疫苗,使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是,自2011年以来,一种由伪狂犬病毒变异毒株引

许利琴[8]2014年在《浦东新区猪伪狂犬病血清学调查》文中进行了进一步梳理猪伪狂犬病(Pseudorabies)又称奇痒症、猪疱疹病毒1型等,是一种急性传染病,由疱疹病毒科、猪疱疹病毒属的伪狂犬病毒(Pseudorabies v irus,PRV)高度接触感染引起的,主要特征表现为咳嗽、运动失调、瘙痒、高热和脑脊髓炎等,可感染马、羊、牛、犬及多种野生动物等,猪的感染最为普遍,主要引起母猪流产、木乃伊胎、死胎等繁殖障碍。新生仔猪感染后出现大量死亡,死亡率可达100%;种公猪感染会出现不育症,使精液质量下降甚至失去育种价值;育肥猪多呈隐性感染表现为生长缓慢,该病在养猪业中普遍存在,造成巨大经济损失。世界动卫组织(O IE)将猪伪狂犬病列入B类动物疫病,我国也将其归入二类动物疫病。随着浦东新区养猪业的发展,频繁的引种及调运、集约化程度不断提高、未较好地实行根除计划,猪伪狂犬病感染呈现复杂趋势。近年来,为了根除该病,浦东新区各猪场对猪伪狂犬病的预防控制主要是使用g E基因缺失苗进行免疫,因此使用配套的猪伪狂犬病病毒gE试剂盒可以快速地检测出血清中猪伪狂犬野毒抗体,能及时监测和了解猪群中猪伪狂犬病毒的感染情况。为了解浦东地区猪场中猪伪狂犬病毒的感染情况,本研究对浦东新区15家规模猪场2011年1月-2013年7月送检的猪血清采用PRVgE-ELISA抗体检测试剂盒检测了PRV-gE抗体,同时采用其它相关试剂盒检测了PRV-gB抗体。检测为制定合理的免疫方案、有效防控浦东新区猪伪狂犬病提供科学依据。血清学调查结果显示,2011年1月-2013年7月,检测了浦东新区15个规模化猪场猪血清样本4414份,其中PRV-gE抗体和PRV-gB抗体阳性数分别为1573份、4240份,阳性率分别为35.5%、96.6%,各猪场PRV-gB抗体阳性率均在90%以上,而PRV野毒感染抗体PRV-gE阳性率在14%-58%之间,说明浦东地区规模化养殖场PRV野毒感染状况仍较为严重;从不同年份浦东地区15个不同规模化猪场送检血清的PRV-gE野毒感染抗体阳性率情况看,2011年29.9%,2012年33.3%,2013年1月-7月49.6%,有逐年增加的趋势;2011年1月-2013年7月浦东地区10个规模化猪场,不同年龄阶段猪PRV野毒抗体PRV-gE抗体阳性率分别为哺乳仔猪25.3%、保育猪28.4%、生产母猪51.4%、后备种猪47.7%,阳性率呈哺乳仔猪<保育猪<后备种猪<生产母猪,其中生产母猪、后备种猪均在50%左右,说明隐性感染严重,种猪带毒严重。本次血清学调查为浦东新区开展猪伪狂犬病的疫情监测和防控,制订科学的免疫、根除方案提供了依据。

宋春莲[9]2016年在《PRV和PCV2混合感染仔猪致病特点及猪伪狂犬病防控技术研究》文中研究指明猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)都能使猪发病和产生免疫抑制,二者混合感染引起发病猪病情加重及猪场重大经济损失,但二者混合感染导致机体损伤及致病的机理还不清楚。深入研究猪圆环病毒2型胁迫下猪伪狂犬病防控机制,能为种猪场猪伪狂犬病净化提供理论支持。本试验通过人工单独和混合感染PRV和PCV2,通过分离病毒、荧光定量PCR以及血液生理生化指标和血清感染抗体的测定,研究PRV和PCV2混合感染的致病机制;并对云南省72家规模猪场进行了猪伪狂犬病净化综合防控技术的研究。1.PRV和PCV2混合感染仔猪的临床病理学研究PRV和PCV2都是猪的重要传染病。PRV可以引起猪的繁殖障碍及呼吸道疾病;PCV2引起猪的断奶后多系统消耗综合征、繁殖障碍、皮炎与肾病综合征及呼吸道病综合征等多种疾病。本实验通过人工单独感染PRV、单独感染PCV2、混合感染PRV和PCV2,对感染仔猪后出现的临床症状、病理变化进行观察。结果表明:混合感染PRV和PCV2的仔猪出现的病理症状比单独感染病毒产生的症状严重。PRV单独感染仔猪表现为特有的“发热-神经症状-奇痒-呕吐(腹泻)”症状;PCV2单独感染仔猪表现为“发热-呼吸困难-消瘦-贫血”等多系统功能衰竭综合症;而PRV和PCV2混合感染仔猪表现为“发热-消瘦-神经衰竭-呕吐-死亡”等特征性临床症状;单独感染PRV或PCV2组的仔猪没有出现死亡,而混合感染PRV和PCV2组的仔猪在感染后第14d全部死亡。显微观察可见,攻毒后第3d-35d,感染仔猪的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结和小脑均出现明显的显微病理变化。混合感染仔猪的组织病理变化要比单感染PRV或PCV2的病变严重,单感染PRV比单独感染PCV2仔猪的显微病理变化严重,对照组无病理变化。2.人工感染PRV和PCV2仔猪组织器官病毒载量消长规律研究通过实时荧光定量PCR方法,对单独感染PRV或PCV2组,混合感染PRV和PCV2组,在攻毒后第3、7、14、21、35d,随机取2头仔猪宰杀,取心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、小脑7个组织器官;采集感染仔猪的血液、肛门拭子,鼻拭子进行病毒载量测定,分析样品中的带毒情况及排毒变化规律。结果:7个组织器官混合感染组的组织病毒载量比单独感染PRV组或PCV2组高,PRV的载量比PCV2高;病毒载量由高到低依次为肺脏、腹股沟淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏、小脑、心脏。其中混合感染组PRV病毒载量在第14d最高,单独感染PRV组的病毒载量在第7天最高;单独感染PCV2组的病毒载量在第14天最高;结合感染猪的病理变化分析表明,病毒载量越高仔猪表现临床症状越明显,组织器官损伤越严重。混合感染组的病毒载量最高,发病最严重并出现仔猪死亡,组织器官严重损伤。对感染组仔猪的血液、肛门拭子、鼻拭子中的载毒量测定发现,混合感染组和PRV单独感染组的载毒量在感染后第7d-14d处于较高水平;而PRV单独感染组在感染中后期持续排毒;PCV2单独感染组的血液中病毒载量最高、出现病毒的时间最早,但是感染后期排毒水平较低,可见PCV2感染是在感染早中期对外排毒严重,感染后期对外排毒减少。3.PRV和PCV2混合感染对仔猪免疫抑制影响的研究采集感染病毒仔猪血液,应用ELISA方法检测血清中IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ四种细胞因子、补体C3、C4、IgG的含量和红细胞、血红蛋白、白细胞、淋巴细胞、中性细胞及血小板的数量。结果:与单独感染PRV或PCV2组比较,混合感染PRV和PCV2组的IL-4、IL-10和IFN-γ效价在感染后第3-14d呈上升趋势,并都高于2个单独感染组;IL-6在第0-3d快速下降,低于单独感染PRV组;表明在感染早期混合感染组仔猪的体液和细胞免疫都参与了抗病毒的反应。混合感染组的C3效价在第0-3d上升,第7,21d下降,并明显低于2个单独感染组; C4效价呈上升趋势,但明显低于2个单独感染组的C4效价。混合感染组的免疫球蛋白IgG含量在0-14d均低于2个单独感染组,说明混合感染组的仔猪在感染前期,其免疫系统就已受到抑制。混合感染组的红细胞、血红蛋白、中性粒细胞数量均高于单独感染PCV2组和PRV组;感染仔猪的血清抗体检测结果发现,混合感染PRV和PCV2组中,抗PRV的抗体显著低于单独感染PRV组,抗PCV2抗体与单独感染PCV2的抗PCV2抗体无差异性。以上结果表明,混合感染造成的免疫抑制比单独感染组的严重。4.PRV和PCV2混合感染猪伪狂犬病防控技术研究及示范近年来云南省猪伪狂犬病居高不下,为优化猪伪狂犬病的防控技术,本试验选择规模适中的3个PRV、PCV2感染阳性的种猪场,设计了三种净化方案,即A场:检测净化PRV、PCV2感染抗体阳性猪,免疫猪伪狂犬基因缺失疫苗;B场:检测净化猪伪狂犬感染抗体阳性猪,免疫PRV基因缺失疫苗;C场:检测净化PRV和PCV2感染抗体阳性猪,同时免疫PRV基因缺失和PCV2疫苗,并分析这三种防控方法的猪场净化绩效。结果表明,三种净化方法均能控制猪场猪伪狂犬病,C场净化2种病毒,同时接种2种疫苗情况下净化效果最好。在此基础上,研究制订了猪伪狂犬病净化技术规程,2012-2015年在云南省72家规模猪场和1个示范县进行示范,并用ELISA方法检测感染抗体7516份和免疫抗体8696份。结果显示:2012年、2013年、2014年、2015年猪伪狂犬病野毒感染率分别是24.42%、5.47%、2.78%、2.69%;其中种公猪感染率分别为18.25%、12.36%、8.33%、3.15%;种母猪的感染率分别为24.73%、4.80%、2.48%、2.65%;免疫抗体阳性率分别为69.03%、81.86%、85.99%、86.40%,有14户野毒感染率0%。结果表明,经过4年净化,猪场猪伪狂犬病毒的野毒感染率呈逐年降低趋势,免疫抗体阳性率逐年升高,说明猪伪狂犬病净化技术规程在云南省大部分地区具有实用性和操作性,可以推广应用。

唐勇[10]2004年在《猪伪狂犬病鉴别诊断研究与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列的测定》文中研究表明伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由α疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PrV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种烈性传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者。该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在欧美等发达国家,伪狂犬病的根除计划多采用gE或gG基因标记疫苗和相应的gE或gG鉴别诊断方法来进行。gG糖蛋白是PrV的一种分泌蛋白,gE糖蛋白在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用,但两者都不是PrV增殖所必需的蛋白,因此可作为缺失的候选基因。目前我国已研制成功gE和gG基因标记疫苗。为了建立适合我国国情的gE和gG鉴别诊断方法,开展了以下研究。 1.PrV gG基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 依据伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus PRV)Rice株序列,合成针对gG基因的特异性引物,从PRV鄂A株中扩增出gG基因,并将其克隆到pBluescriptⅡ SK+质粒中并测序,用SacⅠ和HindⅢ酶切,将gG基因融合到pET—28a质粒中T_7启动子下游,构建成原核表达质粒pET—28a-gG_1,结果并未获得表达。再用NotⅠ切除gG基因后小半部分片段,构建成原核表达质粒pET—28a-gG_2,使其在E.coli BL21(DE3)中以IPTG诱导表达,经SDS—PAGE分析,表达特异带为47kD,斑点杂交证实表达产物具有抗原性。表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液的上清之中,上清经饱和硫酸铵溶液沉淀,透析,PEG20000浓缩,ELISA分析表明,经初步纯化的表达产物可与抗PRV猪血清发生特异性免疫反应。 2.gG-LAT和gG-ELISA的建立 以PRV gG基因表达提纯产物为抗原分别致敏乳胶和包被酶标板,摸索最佳的致敏和包被条件,建立了gG-LAT和gG-ELISA。方阵滴定确定gG-LAT最佳致敏温度为37℃,最佳致敏时间为30分钟,抗原最佳致敏浓度为1.3mg/ml。以gG-LAT检测各类血清340份,结果表明gG-LAT的特异性及敏感性分别为100%(43/43)和91.4%(96/105),检测192份部分接种TK-/gG-/Laz+弱毒苗的猪血清,gG-LAT检出阳性率为36.5%(70/192)。 方阵滴定确定gG-ELISA的抗原最佳包被量为1.1μg/孔,血清1:40稀释时P/N值最大,为10.5(1.16/1.1)。故确定1.1μg/孔为抗原最佳包被量,1:40为最佳血清稀释浓度。以gG-ELISA分别检测两PRV清洁猪场gG基因缺失疫苗免疫的猪血清50份与PRV全病毒灭活苗免疫的猪血清50份,结果在gG缺失疫苗免疫猪血清中检出阳性2份,其它为阴性;在PRV全病毒灭活苗免疫猪血清中检出阳性49份,阴性1份。此结果显示,gG-ELISA诊断敏感性为98%(49/50),诊断特异性为96%(48/50)。以5块不同批次的包被抗原的酶标板检测5份血清,结果显示阳性血清猪伪狂犬病鉴别诊断研究与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列的测定的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。以gG一EuSA检测69份样本并与PRv病理诊断及PRV-PcR诊断结果比较。结果显示gG一EuSA与PRV病理诊断符合率为84.0%(58/69)。gG一ELISA与pRv-pCR诊断符合率为94.2%(65/69),以gG一EuSA检测842份血清,检出阳性242份,阳性率为28.74%。以上结果表明本研究建立的gG一LAT和gG一ELISA特异性强、敏感性高,可用于区分gG基因缺失疫苗活苗免疫猪与自然感染野毒的血清学阳性猪。3.PrVgE基因的主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达 将伪狂犬病病毒(PRv)Ea株gE基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体pET28b的”启动子下游,构建成原核表达质粒,经IpTG诱导,SDs一pAGE和westernblot印迹分析,证实gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达,表达产物具有抗原性,分子量为38kD,位于包涵体中。4.gE.1‘AT和gE一EUsA的建立 乒基因主要抗原表位区表达的包涵体蛋白经变性、复性处理后,复性产物致敏乳胶,并对抗原致敏浓度、致敏时间、致敏温度进行优化,建立了gE乳胶凝集试验 (薛.LAI,)。该方法不仅能显著区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清,而且具有简便、快速等优点。检测360份猪血清,阳性率为57.77%(208/360),比国外阻断gE一ELISA的58.05%(209/360)略低,阳性符合率为94.86%(203/214),总符合率为%.94%(349/360),两种检测方法结果差异不显著(P>0.05)。 将经纯化、变性、复性等处理后的gE蛋白作为抗原建立伪狂犬病的gE一EL工SA鉴别诊断方法。方阵滴定确定7.5 pg/孔为抗原最佳包被量,1:40为最佳血清稀释浓度。以该方法检测115份己知背景猪血清,结果表明,该方法诊断特异性为94.5%,诊断敏感性为%.7%。以5块不同批次包被抗原的酶标板检测5份血清,结果显示阳性血清的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。对比国外阻断gE一ELISA同时检测356份猪血清,两者阳性符合率为87.44%(195/223),总符合率为92.13% (328/356)。以上结果表明该gE一LAT和gE一ELISA特异、敏感且重复性好,可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。5.猪繁殖与呼吸综合征基因组序列的测定 猪繁殖与呼吸综合征是另一种危害我国养猪业的传染病,它主要以母猪发热、厌食、流产、早产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各年龄猪的呼吸道症状为主要特征,

参考文献:

[1]. 猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究[D]. 何启盖. 华中农业大学. 2000

[2]. 规模化猪场伪狂犬病控制、净化方案研究及推广应用[D]. 彭峰. 河南农业大学. 2009

[3]. 猪伪狂犬病基因工程疫苗的研究进展[J]. 郝飞, 汤德元, 曾智勇, 李春燕, 罗险峰. 猪业科学. 2013

[4]. 猪伪狂犬病的研究进展[J]. 梁祺英, 王世坤, 司红彬. 畜牧与饲料科学. 2017

[5]. 猪伪狂犬病疫苗的研究进展[J]. 牛晓芸, 赖月辉, 黄秋雪, 牛贝贝, 吴文福. 中国猪业. 2017

[6]. 猪伪狂犬病流行状况和疫苗应用的研究进展[J]. 张姗姗, 冷雪, 时坤, 李健明, 宫庆龙. 动物医学进展. 2018

[7]. 猪伪狂犬病毒变异毒株的特性及其疫苗的研究现状[J]. 李国新, 童武, 郑浩, 童光志. 猪业科学. 2016

[8]. 浦东新区猪伪狂犬病血清学调查[D]. 许利琴. 上海交通大学. 2014

[9]. PRV和PCV2混合感染仔猪致病特点及猪伪狂犬病防控技术研究[D]. 宋春莲. 扬州大学. 2016

[10]. 猪伪狂犬病鉴别诊断研究与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列的测定[D]. 唐勇. 华中农业大学. 2004

标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  

猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究
下载Doc文档

猜你喜欢