刘桂勇[1]2015年在《右美托嘧啶对肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中提出肾脏缺血再灌注后损伤是泌尿外科临床常见的病理生理过程,在重症感染、严重创伤、一些外科手术如保留肾单位肾部分切除术、肾移植术等中,常发生肾脏缺血再灌注损伤,因此,如何预防及减轻因缺血再灌注导致的损伤是临床医生的工作重点。近几年大量缺血再灌注损伤的动物实验证实,右美托嘧啶对多种器官的缺血再灌注损伤均具有保护作用。本研究分别在体内、体外水平探讨右美托嘧啶对肾脏及肾小管上皮细胞的缺血再灌注损伤的保护作用及其相关机制。第一部分 右美托嘧啶对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用目的：探讨右美托嘧啶预处理对于大鼠肾脏缺血再灌注损伤的氧化应激及凋亡等的影响。方法：将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和右美托嘧啶组(每组8只大鼠)。右美托嘧啶预处理组：缺血前30分钟腹腔注射右美托嘧啶100ug/kg,缺血再灌注组缺血前30分钟腹腔注射生理盐水100ug/kg.各组大鼠肾脏再灌注24h后,检测各组大鼠血肌酐、尿素氮水平,并用HE染色观察各组肾组织结构,SOD、MDA检测各组肾脏再灌注后的氧化应激水平,免疫组化染色检测促凋亡相关蛋白Caspase-3,western blot检测相关促凋亡因子BAX、AIF及抗凋亡因子Bcl-2。结果：研究结果显示缺血再灌注组肾功能指标(血肌酐、尿素氮)明显升高,SOD明显降低、MDA明显升高,与假手术组均有统计学差异(P<0.05),HE染色观察肾组织损害较假手术组明显,促凋亡蛋白(Caspase-3)及促凋亡因子(BAX、AIF)的表达均较假手术组显着升高,而抗凋亡因子Bcl-2减少。但是,通过右美托嘧啶预处理后,可以抑制因缺血再灌注导致的损伤：肾功能指标(血肌酐、尿素氮)明显改善,SOD升高及MDA降低,与缺血再灌注组均有统计学差异(P<0.05),HE染色观察肾组织损害程度较缺血再灌注组明显减轻,促凋亡蛋白(Caspase-3),促凋亡因子(BAX、AIF)表达情况较缺血再灌注组减轻。抗凋亡因子Bcl-2表达情况较缺血再灌注组升高。结论：右美托嘧啶预处理对于大鼠肾脏缺血再灌注后的氧化应激反应,抗凋亡过程,肾功能及组织结构均具有明显的保护作用。第二部分 右美托嘧啶对大鼠肾脏缺血再灌注后慢性炎症的保护作用目的：探讨右美托嘧啶预处理对于大鼠肾脏缺血再灌注损伤后慢性炎症的影响。方法：随机地将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和右美托嘧啶预处理组(每组8只大鼠)。右美托嘧啶预处理组：缺血前30分钟腹腔注射右美托嘧啶100ug/kg,缺血再灌注组缺血前30分钟腹腔注射生理盐水100ug/kg(与第一部分处理方法相同),再灌注8周后,检测各组大鼠血肌酐、尿素氮水平,并用HE染色观察肾组织结构,realtime PCR检测TNF-α、IL-1β及I CAM水平,westernblot检测HMGB1和TLR4表达情况。结果：研究结果显示再灌注8周后,虽然各组肾功能水平没有明显差异,但是组织病理学可见缺血再灌注组肾组织结构损伤明显,而右美托嘧啶预处理可以减轻损伤。在缺血再灌注组中TNF-α、IL-1β及ICAM都有很高程度的升高,与假手术组有统计学差异(P<0.05)；但是,经过右美托嘧啶预处理后可以明显降低这些炎症相关指标,与缺血再灌注组有统计学差异(P<0.05)。同时,HMGB1和TLR4在缺血再灌注组中高表达,而右美托嘧啶预处理组中其表达降低。结论：右美托嘧啶能明显减轻肾脏缺血再灌注损伤后的慢性炎症反应,其机制可能与降低HMGB1/TLR4的表达有关。第叁部分 右美托嘧啶对肾小管上皮细胞NRK-52E体外模拟缺血再灌注损伤的保护作用目的：大多数肾脏缺血再灌注研究主要基于动物模型。为了探讨右美托嘧啶对肾小管上皮细胞在细胞水平模拟缺血再灌注的作用,我们用大鼠肾近端小管细胞株NRK-52E建立模拟缺血再灌注损伤模型,并探讨不同浓度(0.01ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml)的右美托嘧啶对其影响。方法：实验细胞随机分叁组：对照组,缺血再灌注组,右美托嘧啶处理组。缺血组细胞用缺血培养液模拟缺血3h后,更换完全培养液模拟再灌注24h。右美托嘧啶预处理组细胞先分别用不同浓度(0.01ng/ml,0.1ng/ml,1ng/ml)的右美托嘧啶培养基培养1h,之后处理步骤同缺血组。流式细胞仪检测各组细胞凋亡SOD、MDA检测细胞氧化应激水平,Western检测PARP-1/AIF蛋白表达水平。结果：研究结果显示细胞模拟缺血再灌注24h后有明显凋亡,而应用不同浓度的右美托嘧啶处理后,细胞凋亡比例明显降低,细胞凋亡百分比分别为9.0%(对照组),55.0%(缺血再灌注组),49.1%(0.01ng/ml浓度的右美托嘧啶预处理组),28.6%(0.1ng/ml浓度的右美托嘧啶预处理组),22.1%(1ng/ml浓度的右美托嘧啶预处理组)。模拟缺血再灌注组SOD降低、MDA升高,PARP-1和AIF蛋白表达水平明显升高。而右美托嘧啶预处理后,可以抑制因模拟缺血损伤导致的相关改变。结论：右美托嘧啶对体外模拟缺血再灌注损伤具有保护作用,可以明显降低细胞凋亡和氧化应激水平,其机制可能与通过下调PARP-1/AIF的水平有关。
李荣山, 贾丽芳[2]2004年在《缺血预处理对肾缺血/再灌注损伤及P38信号通路的影响》文中研究表明目的研究大鼠肾脏缺血预处理(IP)对缺血/再灌注(I/R)损伤以及细胞信号传导通路中P38MAPK的影响。方法雄性SD大鼠随机分为两组,实验组:IP+I/R组,对照组:单纯I/R组。实验组用无创动脉夹夹闭双侧肾动脉,致
薛海燕[3]2015年在《pPolyHb在大鼠重度失血性休克复苏中应用及其对内皮细胞氧化应激及炎症反应影响研究》文中研究指明失血性休克是全世界范围内创伤患者死亡的主要原因,其治疗策略主要采取控制出血,扩张血容量,恢复组织灌注和氧供,维持血压及体温等对症措施。恢复组织灌注的复苏液可采用如生理盐水、乳酸林格液等晶体液,羟乙基淀粉、右旋糖酐等胶体液,或新鲜血浆、成分血以及几种液体按比例联合使用的方式。但采用生理盐水、乳酸林格液等小分子晶体液复苏时,不仅难以维持血容量,还会造成细胞水肿、氧化应激损伤和中性粒细胞的激活,进而激活炎症因子级联反应,导致系统性炎症反应综合征(SIRS),50%的患者会出现急性呼吸窘迫综合症(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS),严重者发展为多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome, MODs)。因此液体复苏时也应考虑抑制活性氧(ROS)产生和炎症因子激活。在重度失血休克复苏时除需扩张血容量维持灌注外,通常需要输血以改善组织缺氧状态,减轻系统性缺血再灌注损伤。由于潜在的感染风险、血液配型、保存方式和时间、老龄化社会的发展等因素,世界性的血液供给短缺还在不断加剧,寻求合适血液替代用品的需求日益迫切。基于血红蛋白分子修饰的血红蛋白氧载体HBOCs (Hemoglobin-based oxygen carriers)是一类具有携氧功能的聚合物,有望替代悬浮红细胞(packed RBCs)用于失血性休克复苏。课题组前期开发了HBOCs产品戊二醛聚合猪血红蛋白(Polymerized porcine hemoglobin, pPolyHb),发现大鼠静脉注射会发生免疫耐受,继而在100%换血实验中证实了其安全性和携氧能力。因此本研究探讨了pPolyHb在大鼠重度失血性休克复苏中生理药理应用效果及其对血管内皮细胞氧化应激损伤及炎症反应影响和细胞信号转导机制。首先,探讨pPolyHb在大鼠重度失血性休克复苏中对机体血压、血液酸碱平衡、氧化应激和炎症反应的影响以及不同液体复苏组织病理损伤情况。试验建立大鼠重度失血性休克模型,同时控制血压和血容量,控制血压在35±5 mmHg,放血量60±5%(总血量按7%动物体重计)。休克90 min后,立即通过左侧静脉以0.5 mL/min速率注射复苏液+2倍失血体积生理盐水复苏。受试动物随机分为5组进行复苏,①假手术组(Sham);②3倍失血体积生理盐水复苏组(NS组)；③2 g/kg pPolyHb复苏组；④0.6%HES复苏组(HES组)⑤自体血回输组(以2 g/kg Hb计,Blood组)。监控大鼠血压和动脉血气。监测基础、休克末、复苏1 h、复苏3 h及复苏6 h血清中TNF-α、IL-1β、 MPO、MDA含量。复苏6 h,处死动物检测心、肝、肺、肾组织中乳酸(Lac)、MPO、MDA及HMGB1含量,并通过HE染色和TUNEL法检测组织病理和细胞凋亡情况；检测血清胱抑素C (Cys C)、中性粒细胞明胶酶载脂蛋白(NGAL)及组织肾损伤分子-1(KIM-])含量,反映肾损伤情况。pPolyHb复苏对血压、血液酸碱平衡及血清中炎症因子含量和氧化应激水平的影响。pPolyHb组复苏过程血压维持在84±11 mmHg,比NS组(55±10mmHg)能更有效地维持血压；同时与NS组相比,复苏后pPolyHb组BE值(-6.3士5.7 vs-13.7土4.2)及代谢物Lac值(3.22±1.5 vs.6.0士2.2)得到较显着改善,有效地纠正了组织酸中毒状态,与Blood组复苏效果相似。pPolyHb复苏后血清中炎症因子TNF-a与IL-1β含量显著低于NS组(P<0.05),也低于HES组(P<0.05)；复苏6 h血清HMGB1,除NS与Sham相比,有显着升高,其余各组与Sham组无显着差异。以上表明,pPolyHb复苏能显着抑制休克复苏过程中血清炎症因子释放。血清MPO反映复苏液对循环中性粒细胞聚集的影响,NS组复苏过程中表现出持续上升趋势,pPolyHb组复苏6h, MPO水平显着低于NS组(P<0.05),与HES组及Blood组无显着差异(JP>0.05)。各复苏组血清中氧化应激产物MDA含量随时间延长不断增加,复苏6h时,各组间无显着差异。血清MPO和MDA含量表明,pPolyHb复苏对休克复苏引起的氧化应激有一定抑制作用。pPolyHb复苏重度失血性休克对不同组织炎症、氧化应激和病理损伤的影响。失血性休克复苏时,脏器如肾、肠、肺等易受到缺血／再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)损伤。在肝、肾组织中,pPolyHb复苏组Lac含量与NS相比显着降低(P<0.05),表明灌注效果较好。复苏后,各组肺组织中MPO含量显着升高(与Sham相比,P<0.01),NS组升高最显着,pPolyHb与Blood组MPO含量无显着区别(P>0.05)；在心、肝和肾组织中,pPolyHb组MPO水平高于Blood组,但无显着差异(P>0.05)。复苏后各组织中脂质过氧化物MDA水平,NS组显着升高,pPolyHb组与NS组及Blood组均无显着差异,与血清结果一致。组织中炎症介质HMGB1表明,NS组显着升高,pPolyHb复苏与Blood相似,对肺组织晚期炎症有显着的抑制作用。从组织病理角度可见,NS复苏时心、肝、肺组织损伤较明显,pPolyHb与Blood复苏时损伤均能得到减轻。pPolyHb复苏重度失血性休克对肾脏损伤的影响。肾脏属于远端器官,在失血性休克复苏时I/R损伤比较严重。各复苏组肾组织中HMGB1含量升高,但各组间无显着差异。肾损伤生物标志物CysC及NGAL显示pPolyHb复苏损伤程度与NS组及Blood组相似,均显着低于HES组；四种复苏方式KIM-1均显着升高(P<0.05)。HE染色病理分析发现Blood组损伤较轻,pPolyHb与NS组损伤相似。HES组TUNEL凋亡率最高,NS组与pPolyHb组水平一致,而Blood组细胞凋亡率最小,组织损伤与细胞凋亡相关。由以上结果可知,NS复苏后血清和组织中炎症因子和氧化应激水平明显增加,且复苏6h后组织仍处于缺氧状态,从病理角度看,肺组织炎症浸润严重,肾组织水化变性。而pPolyHb复苏显着抑制了血清和组织中炎症因子和中性粒细胞的浸润,肺脏损伤显着减轻,作为具有携氧功能的“氧治疗”剂对大鼠重度失血性休克复苏的益处大于不良反应。其次,研究了pPolyHb预处理对内皮细胞氧化应激影响及血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路的作用。pPolyHb在携氧的同时有一定抑制氧化应激和炎症反应作用,在预处理抑制I/R损伤中显示广阔的前景。有研究报道HO-1在HBOCs抑制氧化应激损伤发生中起作用,而内皮系统损伤是I/R损伤发生的关键部位,H202又是细胞内ROS的主要存在形式。因此,试验建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的H202损伤模型,MTT法检测细胞存活率,Westernblot检测细胞凋亡相关蛋白及HO-1的表达,对pPolyHb预处理产生的保护效应和信号通路进行探讨。研究发现,pPolyHb预处理增加了内皮细胞存活率,同时减弱细胞凋亡蛋白Bax的表达,增加细胞存活蛋白Bcl2的表达,降低两者比率,并减少CytC及Cleave-Caspase 3的释放,从而抑制线粒体途径引起的HUVECs细胞凋亡。进一步对细胞信号途径研究表明,H202损伤HUVECs激活JNK/p38 MAPK磷酸化增加,特异性抑制剂SB 203580及SP 600125能增加细胞存活率。pPolyHb预处理诱导了HO-1的表达,并随时间和浓度的增加而增加,同时抑制了H202损伤所引起的JNK/p38 MAPK磷酸化增加。HO-1抑制剂SnPP能够减弱pPolyHb对细胞存活的保护效应,同时部分抵消对JNK/p38 MAPK磷酸化的抑制效果。预处理还减弱了H202诱导的内皮细胞ROS水平。因此pPolyHb对内皮细胞的氧化应激损伤保护作用,可能是通过诱导HO-1表达,而抑制JNK/p38 MAPK磷酸化和细胞内ROS产生来发挥。最后,探讨了pPolyHb预处理对TNF-a诱导内皮细胞炎症因子表达影响以及HO-1对炎症信号通路影响。微血管中性粒细胞的过度浸润是相应器官发生MODs的标志,而内皮细胞对中性粒细胞粘附和激活是损伤发展的第一步,大量研究表明HO-1对炎症的发生也有抑制作用。为此采用10ng/mL TNF-α刺激内皮细胞制作炎症模型,不同浓度pPolyHb进行预处理,ELISA检测培养上清中MCP-1、sICAM-1及VCAM-1等炎症相关分子的释放,荧光实时定量PCR检测MCP-1、ICAM-1及HO-1mRNA相对表达量,Westemblot检测蛋白和信号分子表达,免疫荧光检测细胞内ICAM-1和HO-1含量,考察了pPolyHb预处理对炎症因子TNF-α刺激下相关炎症分子表达和释放的影响及其分子机制。研究表明,TNF-α刺激下HUVECs培养上清中MCP-1、sICAM-1及VCAM-1的含量增加,细胞中MCP-1、ICAM-1和MMP-9的表达增加,而pPolyHb预处理可抑制这些相关炎症因子的释放和表达。HO-1抑制剂SnPP减弱了pPolyHb预处理对炎症相关因子的抑制作用,说明预处理的保护效应与诱导HO-1产生相关。pPolyHb预处理时,细胞内GSH含量显着降低,pPolyHb Fe2+向pPolyHb Fe3+转化,因此HO-1的诱导表达可能与转化过程中ROS产生相关。进一步研究表明,pPolyHb预处理激活了p38MAPK/Nrf2信号途径促使Nrf2进入核内,进而诱导了HO-1的转录表达。研究还发现pPolyHb预处理能抑制主要的内皮细胞粘附分子表达途径NF-κB通路,且HO-1在一定程度上能抑制NF-κB核转位,两者之间存在交互作用。以上结果证实,pPolyHb预处理对内皮细胞炎症抑制作用可能是通过产生一定量ROS后,激活p38 MAPK/Nrf2途径诱导HO-1的表达,以及抑制NF-κB途径激活发挥作用的。引入抗氧化基团后的pPolyHb有显着的抑制中性粒细胞浸润和炎症因子释放作用,显着减弱肺脏损伤,可用于RBC替代治疗。而pPolyHb预处理可能通过p38 MAPK/Nrf2途径激活诱导HO-1,抑制内皮细胞氧化应激损伤和炎症反应。在移植器官保存、择期手术预处理、贫血及血管相关疾病治疗等方面有良好的应用前景。
贾丽芳[4]2004年在《缺血预处理对肾缺血/再灌注损伤及P38信号通路的影响》文中认为目的 研究肾脏缺血预处理(IP)对缺血／再灌注(I／R)损伤以及细胞信号传导通路中P38MAPK的影响及意义。 方法 雄性SD大鼠分为两组，实验组：IP+I／R组，对照组：单纯I／R组。手术后动态观察不同时间点两组动物在肾功能、形态学、细胞凋亡情况以及P38MAPK的变化。利用苦味酸法和二乙酰一肟法测定血肌酐和尿素氮值；用HE染色光镜下观察肾组织损伤形态学改变；用原位凋亡检测法观察TUNEL阳性细胞数，检测细胞凋亡情况；用western blot测定P38MAPK活化程度及表达量。 结果 缺血45min后血肌酐和尿素氮明显升高，与正常对照有显着差异(P＜0.05)，再灌注3h后再次增高，组内对比有显着差异。HE染色光镜下观察肾组织细胞以近端小管变性为主，坏死不明显。在缺血及再灌注的各个时间点可以观察到细胞凋亡现象。用P38MAPK抗体检测到所有样本中有一定的表达，缺血20、45min均可以激活其的表达，再灌注30min达高峰，2h后回到基础水平。实验组和对照组在肾功能、形态学、细胞凋亡等指标方面比较无统计学差异，缺血预处理后可以检测到P38MAPK的表达，在8天后行缺血／再灌注，也可测到P38MAPK的表达，但在实验组与对照组之间，二者差别不显着。 结论 本实验采用的缺血预处理方式对后继的缺血／再灌注损伤没有保护作用。该过程中P38MAPK活性的变化不明显。
田毅[5]2010年在《异氟醚、卡托普利联合预处理对兔心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究》文中认为目的建立缺血再灌注模型,观察异氟醚、卡托普利联合预处理对兔缺血再灌注的心肌保护作用。方法健康新西兰大白兔,采用结扎冠状动脉左前降支法制备心肌缺血再灌注模型。随机分成6组：假手术组(S组)：仅开胸并分离冠状动脉左前降支,但不阻断血流；缺血再灌注组(I/R组)：缺血30min,再灌注120 mim缺血预处理组(IPC组)：缺血5 min,再灌注5 min,重复3次后同I/R处理；异氟醚预处理组(I组)：给予1.1%异氟醚持续吸入30min,洗脱15min,之后处理同I/R组；卡托普利预处理组(C组)：给予喂饲卡托普利片25 mg-kg-1,24h后处理同I/R组；异氟醚、卡托普利联合预处理组(I+C组)：给予喂饲卡托普利片25 mg·kg-1,24h后处理同I组。记录缺血再灌注前后不同时间点血流动力学指标：阻断前(T0),阻断30min(T1),再灌注30min(T2),再灌注60min(T3),再灌注120min(T4)；记录心律失常发生率；取动脉血检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cTnI)浓度；再灌注结束后检测血清丙二醛(MDA)浓度及超氧化物歧化酶(SOD)活性；观察各组心肌细胞超微结构变化。结果1.T0-T2 I组与I+C组HR相对高于其它各组,T0-T4 I组、C组与I+C组MAP与RPP相对较低并依次递减(P<0.05,或P<0.01),IPC组、I组、C组再灌注期间心律失常发生率(37.5%、50%、50%)低于I/R组(62.5%),但高于I+C组(25%,P<0.05)。2.心肌酶变化：与S组比,各组心肌酶学指标从T1至T4均较T0有所升高(P<0.05或P<0.01),但IPC组、I组、C组和I+C组增高程度低于I/R(P<0.05),IPC组和I+C组又较I组和C组低(P<0.05)。3.生化指标变化：与S组比,各组MDA均增高,SOD降低(P<0.01),但与I/R组比,各处理组MDA降低,SOD较高(P<0.01)。IPC组和I+C组MDA和SOD分别较I组和C组降低和升高(P<0.05)。4.心肌超微结构变化：预处理组心肌细胞损伤轻于I/R组。结论异氟醚、卡托普利联合预处理对缺血再灌注兔心肌有保护作用,较单独应用异氟醚、卡托普利预处理的保护作用增强,其效果与缺血预处理相似。目的建立缺血再灌注模型,观察异氟醚、卡托普利联合预处理对兔心肌细胞凋亡的影响。方法健康新西兰大白兔,采用结扎冠状动脉左前降支法制备心肌缺血再灌注模型。随机分成6组：假手术组(S组)：仅开胸并分离冠状动脉左前降支,但不阻断血流；缺血再灌注组(I/R组)：缺血30min,再灌注120 min；缺血预处理组(IPC组)：缺血5 min,再灌注5 min,重复3次后处理同I/R组；异氟醚预处理组(I组)：给予1.1%异氟醚持续吸入30min,洗脱15min,之后处理同I/R组；卡托普利预处理组(C组)：给予喂饲卡托普利片25 mg·kg-1,24h后处理同I/R组；异氟醚、卡托普利联合预处理组(I+C组)：给予喂饲卡托普利片25 mg·kg-1,24h后处理同I组。再灌注结束后采用伊文思蓝和TTC染色法检测心肌梗死面积,流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果1.心肌梗死面积：IPC组、I组、C组和I+C组心肌梗死面积(33.6±3.8%、39.8±5.7%、39.6±3.4%、33.9±5.9%)均小于I/R组(60.7±6.0)(P<0.01),IPC、I+C组心肌梗死面积均小于I组、C组(P<0.05)。2.细胞凋亡：与S组比较各组凋亡指数明显增高(P＜0.01)；与I/R组相比各预处理组细胞凋亡指数均有所降低(P<0.01)；I组和C组较IPC组和I+C组细胞凋亡指数有所增加(P<0.05)。但IPC组和I+C组之间,差异无统计学意义(P＜0.05)。结论1.异氟醚、卡托普利联合预处理可明显减少心肌缺血再灌注的梗死面积以及降低细胞凋亡,较单独药物预处理组作用增强,与缺血预处理的作用相似。2.异氟醚、卡托普利联合预处理对心肌缺血再灌注损伤产生了协同的抗细胞凋亡保护作用。目的建立缺血再灌注模型,初步探讨异氟醚、卡托普利联合预处理对凋亡相关基因的影响,以及对凋亡通路的作用机制。方法健康新西兰大白兔,采用结扎冠状动脉左前降支法制备心肌缺血再灌注模型。随机分成6组：假手术组(S组)：仅开胸并分离冠状动脉左前降支,但不阻断血流；缺血再灌注组(I/R组)：缺血30min,再灌注120 mim缺血预处理组(IPC组)：缺血5 min,再灌注5 min,重复3次后处理同I/R组；异氟醚预处理组(I组)：给予1.1%异氟醚持续吸入30min,洗脱15min,之后处理同I/R组；卡托普利预处理组(C组)：给予喂饲卡托普利片25mg·kg-1,24h后处理同I/R组；异氟醚、卡托普利联合预处理组(I+C组)：给予喂饲卡托普利片25mg·kg-1,24h后处理同I组。再灌注结束后采用免疫印迹法(Western-Blot)检测各组心肌凋亡相关基因Bcl-2、Bax和凋亡通路蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果1.各组心肌Bcl-2、Bax蛋白表达的变化：与I/R组比较,各预处理组Bcl-2表达明显增加,Bax表达降低,Bcl-2/Bax比值明显增加,差异有显着统计学意义(P<0.01)；与I组和C组相比,IPC组和I+C组Bcl-2/Bax比值明显增高(P<0.01),IPC组和I+C组之间比值没有差异(P>0.05)。2.各组心肌凋亡通路蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达的变化：与I/R组比较各预处理组Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白表达明显降低,差异有显着统计学意义(P<0.01)；与I组和C组相比,IPC组Caspase-3蛋白表达较低(P<0.01),但与I+C组相比差别无统计学意义(P>0.05)；各药物预处理组Caspase-8蛋白表达与IPC组相比均较低(P<0.05或P<0.01)；I+C组Caspase-8蛋白的表达量也低于I组和C组(P<0.01)；与各药物预处理组相比,IPC组的Caspase-9蛋白表达较低(P<0.01)；I+C组与I组和C组相比,Caspase-9蛋白的表达量也有差异(P<0.05)。3.细胞凋亡：与I/R组相比,各预处理组细胞凋亡指数均有所降低(P<0.01),I+C组凋亡指数低于I组和C组(P<0.05),但与IPC组无差异(P>0.05)结论1.异氟醚、卡托普利联合预处理组通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,增加Bcl-2/Bax比值,对缺血再灌注兔心肌产生保护作用。2.异氟醚、卡托普利联合预处理组降低心肌缺血再灌注后Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的蛋白表达,抑制凋亡通路信号转导,减少心肌细胞的凋亡。3.异氟醚、卡托普利联合预处理对凋亡的死亡受体通路和线粒体通路具有抑制作用,但主要是通过死亡受体通路发挥抗凋亡作用。
樊梦莹[6]2016年在《肢体缺血预处理对脊髓缺血再灌注损伤后ERK通路的影响》文中认为【目的】研究肢体缺血预处理(Limb Ischemic Preconditioning,LIP)对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后ERK通路的影响,研究LIP脊髓保护效应的机制,为临床中脊髓缺血再灌注损害的防治提供思路。【方法】随机将90只重250-300g的雄性SD大鼠分为五个大组,分别n=18:(1)空白对照组(Sham组)(2)SCII(Spinal Cord Ischemia/reperfusion Injury,SCII)组(3)LIP+SCII组(LIP组)(4)LIP+SCII+PD98059组(PD组)(5)LIP+SCII+DMSO组(DMSO组)。根据取材时间点(2h、6h、12h)再分别随机分3个亚组,每组n=6只。其中,对照组开腹暴露腹主动脉25min后缝合,SCII组采用Zavin法(左肾动脉下方夹闭腹主动脉25分钟后开放)建立脊髓缺血/再灌注模型(SCII),LIP组在行肢体缺血预处理(橡皮筋环扎大鼠右后肢根部,阻断血流5min,开放再灌注5min,共循环3次)24h后建立SCII模型。PD组和DMSO组分别于大鼠尾静脉注射PD98059(0.2mg/kg)和DMSO溶剂(2mg/kg),20min后处理如LIP组。再灌注以后6h、8h、10h、12h分别对大鼠进行神经功能评分,采用最新改良的BBB评分法。按时间点(2h、6h、12h)的不同分别取L3-L5段脊髓。HE染色观察每组脊髓前角神经元的形态学改变;TUNEL法检测神经元的凋亡情况;免疫组化法检测脊髓中磷酸化ERK阳性细胞数表达的不同;Western Blot技术检测p-erk蛋白和总erk蛋白表达量的变化。用统计软件进行数据处理,比较各组间的差异性。【结果】1)和SCII组和PD组相比,LIP组和DMSO组每个时间点神经功能评分明显升高(p<0.001);p-erk蛋白的表达量明显增加(p<0.05)。2)HE染色结果显示,Sham组脊髓前角细胞形态学每个时间点均没有明显改变;SCII组神经元变性坏死,细胞核固缩,空泡形成;LIP组和DMSO组病理改变较SCII组和PD组较轻。3)TUNEL凋亡检测结果显示,SCII组凋亡指数最高;LIP组、PD组DMSO组与SCII组相比明显降低(p<0.05);而PD组与LIP组相比凋亡指数明显升高(p<0.05)。4)五个大组各亚组之间p-erk的表达相比较有明显差异(p<0.05),其中p-erk蛋白在2h开始表达,6h表达达到高峰,12h表达量减少。5)对p-erk的表达量与神经功能评分做相关性分析,结果证实两者具有显着正相关性(r=0.657,p<0.05)。【结论】1)远端肢体缺血预处理可以减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤以后神经元的变性和坏死,改善再灌注后神经功能评分。2)LIP可以通过上调ERK通路的表达而提高脊髓再灌注损伤的耐受。
邓旭[7]2014年在《MiR-21介导丝裂原活化蛋白激酶激酶3低调白介素-6/肿瘤坏死因子-α保护肾脏》文中提出第一部分MicroRNA-21-5p靶向调控丝裂原活化蛋白激酶激酶3目的验证MicroRNA-21-5p（miR-21-5p）与丝裂原活化蛋白激酶激酶3（MKK3）3’非编码区（3’UTR）结合，证实miR-21-5p与MKK3的靶向调控关系。方法1、分别构建MKK33’UTR报告载体（MKK3-3U）及MKK33’UTR突变报告载体（MKK3-3U-M）；化学合成miR-21-5p模拟物（mimics）、miR-21-5p抑制剂（inhibitor）及无意义miR (NC)。2、分别用NC（NC1组）、mimics（mimic1组）、inhibitor（inhibitor1组）与MKK3-3U共转染人胚肾（HEK293）细胞，双荧光素酶检测仪检测细胞荧光比值。3、分别用空载质粒（pYr-MirTarge）（对照组）、MKK3-3U（Wt组）、MKK3-3U-M（Mut组）与mimics共转染HEK293，双荧光素酶检测仪检测细胞荧光比值。4、NC（NC2组）、mimics（mimic2组）、inhibitor（inhibitor2组）分别干预人肾小管上皮（HK-2）细胞；采用反转录PCR、Western blot方法检测各组HK-2细胞中MKK3的mRNA及蛋白表达水平。结果1、NC1组、mimic1组、inhibitor1组荧光比值分别为100%、67.99%、133.17%。mimic1组与NC1组比较，差异有显着性（P<0.01）。证实了miR-21-5p能与MKK33’UTR靶向结合。2、对照组、Wt组、Mut组荧光比值分别为100%、65.3%、98.48%，Wt组与对照组比较，差异有显着性（P<0.01），而Mut组、对照组间荧光比值差异无显着性（P>0.05）。证实了miR-21-5p不能与突变的MKK33’UTR结合。3、NC2组、mimic2组、inhibitor2组，MKK3mRNA相对表达量为1.36±0.02、1.01±0.04、1.43±0.06（P<0.01）；蛋白质相对表达量为0.97±0.05,0.62±0.06、1.36±0.32（P<0.01）；mimic2组、NC2组间MKK3的mRNA和蛋白质表达水平均明显降低（P<0.05）。证实miR-21-5p在mRNA及蛋白水平低调MKK3。结论MKK3是miR-21-5p的靶基因，miR-21-5p在mRNA和蛋白质水平调控MKK3表达，提示miR-21-5p可能是调控p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路的重要分子。第二部分缺血再灌注肾损伤模型小鼠肾脏miR-21/丝裂原活化蛋白激酶激酶3/白介素-6及肿瘤坏死因子-α的表达及意义目的探讨缺血再灌注肾损伤模型小鼠肾脏miR-21、MKK3及下游白介素-6（IL-6）/肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达及意义。方法1、实验分组：将雄性57BL/6J小鼠随机分为3大组：对照组（C组）、假手术组（S组）、缺血再灌注组（IR组），除C组外，其余两组根据再灌注时间点分别分为9个亚组，即再灌注后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d；2、动物模型：采用夹闭双侧肾蒂30min后再灌注的方法，建立缺血再灌注肾损伤模型；假手术组只暴露双侧肾蒂，不进行夹闭。3、实验方法：全自动生化检测仪检测各组小鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平；HE染色观察肾脏病理损害，肾小管间质病理损害评分法计量小鼠肾脏病理损害程度；实时定量RT-PCR法检测肾组织miR-21表达水平；RT-PCR、免疫组织化学染色方法检测肾组织MKK3、IL-6、TNF-α表达。结果1、肾功能变化及肾脏病理评分：IR组缺血再灌注后Scr、BUN、肾脏病理损害及肾小管间质病理评分逐渐加重，24h达到最高峰，之后逐渐下降，各个时间点亚组差异具有显着性（P<0.01）。2、肾脏miR-21的表达变化：IR组再灌注后肾脏miR-21表达水平逐渐上升，12h至24h上升最快，24h达峰值，为基线值的286.0倍，并稳定维持在此高水平。3、MKK3表达变化：IR组小鼠肾组织MKK3mRNA和蛋白质表达水平在再灌注后逐渐上升，24h达到最高值，之后逐渐下降。4、肾脏IL-6、TNF-α表达变化：IR组小鼠肾脏IL-6mRNA和蛋白质表达水平在缺血再灌注后急剧上升，再灌注6h达到高峰，然后逐渐下降。IR组小鼠肾脏缺血再灌注后TNF-α mRNA表达水平逐渐上升，于再灌注后24h达峰值；与mRNA的表达趋势不同的是：IR组缺血再灌注后TNF-α蛋白表达逐渐上升，再灌注48h达到高峰，48h至72h保持高值，之后逐渐下降。结论MiR-21及丝裂原活化蛋白通路及下游炎症因子—白介素-6/肿瘤坏死因子-α与缺血再灌注肾损伤密切相关，miR-21及MKK3及下游因子—IL-6/TNF-α在缺血再灌注肾脏损伤过程中起着重要作用。第三部分肾脏缺血预处理上调miR-21低调丝裂原活化蛋白激酶激酶3及下游白介素-6/肿瘤坏死因子-α保护肾脏目的探讨miR-21介导丝裂原活化蛋白激酶激酶3低调白介素6/肿瘤坏死因子-α对肾脏的保护作用。方法1、实验分组：将雄性C57BL/6J小鼠随机分为3大组：缺血再灌注组（IR组）、缺血预处理再灌注组（IPC+IR组）、假缺血预处理再灌注组（S+IR组），各组根据再灌注时间点分别分为9个亚组，即再灌注后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d；2、动物模型：（1）缺血再灌注肾损伤模型：采用夹闭双侧肾蒂30min后再灌注方法，建立缺血再灌注肾损伤模型；（2）缺血预处理模型：首先行双侧肾蒂夹闭15min钟再灌注，4d后采取夹闭双侧肾蒂30min后再灌注建立模型；（3）假缺血预处理模型：首先行游离双侧肾蒂但不夹闭，4d后采取夹闭双侧肾蒂30min后再灌注建立模型；3、实验方法：全自动生化分析仪检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；HE染色观察肾脏病理损害情况，肾小管间质病理评分计量肾脏病理损害程度；实时定量RT-PCR方法检测肾组织miR-21表达水平；RT-PCR、免疫组织化学染色方法检测肾组织MKK3、IL-6、TNF-α表达。结果1、肾功能的变化及肾脏病理评分：（1）肾功能：IR组再灌注后Scr、BUN逐渐加重，于24h达最高峰，之后逐渐下降；IPC+IR组再灌注后Scr、BUN、肾脏病理损伤的变化趋势与IR组一致，但损伤程度较IR组明显减轻；（2）肾脏病理评分：IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的肾小管间质病理评分（分）分别为：1.00±0.12v0.30±0.11、1.50±0.15v1.50±0.15、2.00±0.15v1.30±0.16、2.60±0.23v1.5±0.16、3.80±0.22v1.70±0.12、3.10±0.24v1.30±0.13、2.50±0.12v1.30±0.11、2.30±0.24v1.00±0.11、1.60±0.11v0.50±0.07，在每一个时间点两组间的肾小管间质病理损害评分均有显着差异（P<0.01）。2、肾脏miR-21的表达变化：IR组再灌注24h，肾脏miR-21达峰值，为基线值的286.0倍，之后维持高值；而IPC+IR组再灌注0h，肾脏miR-21即达峰值，为基线值的286.0倍，并一直维持在此高峰值。3、MKK3的表达变化：IR组MKK3mRNA和蛋白质表达在再灌注后逐渐上升，24h达到最高值，之后逐渐下降；IPC+IR组MKK3mRNA和蛋白质的变化趋势与IR组一致，但表达水平明显低于IR组。IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的MKK3mRNA的水平分别为：0.89±0.10v0.51±0.06；1.45±0.13v0.52±0.07；1.65±0.18v0.54±0.09；2.15±0.22v0.61±0.11；3.19±0.31v0.81±0.09；2.66±0.28v0.76±0.10；1.87±0.22v0.68±0.08；1.68±0.15v0.66±0.07；1.62±0.17v0.63±0.08；MKK3蛋白质的水平(OD/10000）分别为：15.51±1.56v14.36±1.51；34.24±2.82v21.14±1.67；71.54±5.43v31.52±2.01；145.16±8.29v45.39±2.03；159.50±7.32v60.34±3.67；209.74±8.13v95.12±4.02；95.58±5.47v62.13±2.31；87.32±5.12v42.51±2.57；45.13±3.25v33.18±1.99。IR组与IPC+IR组相比较，两组在再灌注3h~7d各个相同时间点亚组MKK3mRNA及蛋白质表达差异均具有显着性（P<0.05）。4、IL-6和TNF-α表达变化：（1）IR组IL-6mRNA和蛋白质表达在缺血再灌注后急剧上升，再灌注6h达到高峰，然后逐渐下降，而IPC+IR组IL-6mRNA和蛋白质一直保持较低水平表达。IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的IL-6mRNA水平分别为：0.65±0.11v0.30±0.07；1.53±0.14v0.39±0.05；2.82±0.24v0.43±0.07；2.21±0.26v0.41±0.09；1.73±0.21v0.44±0.09；1.55±0.18v0.46±0.07；1.38±0.14v0.43±0.06；1.16±0.08v0.41±0.06；0.89±0.06v0.40±0.05；IL-6蛋白质的水平(OD/10000）分别为：45.22±1.58v35.16±2.53；68.13±2.72v42.73±1.99；135.28±8.42v58.33±2.23；108.99±5.49v50.11±2.41；91.18±6.32v47.29±4.12；72.63±5.15v46.63±3.87；66.57±4.47v43.18±2.67；58.74±5.82v40.12±2.85；46.33±2.27v36.47±1.82。IR组与IPC+IR组相比较，两组在再灌注3h~5d各个相同时间点亚组IL-6mRNA表达差异均具有显着性（P<0.05）；IL-6蛋白质表达在0h~7d各个相同时间点亚组差异均具有显着性（P<0.01）。（2）IR组缺血再灌注后TNF-α mRNA表达逐渐上升，于再灌注后24h达峰值，之后逐渐下降；缺血预处理后，小鼠肾脏TNF-α mRNA的变化趋势与IR组一致，但其各个时间点的表达水平一直较IR组低；与mRNA的表达趋势不同的是：IR组缺血再灌注后TNF-α蛋白表达逐渐上升，再灌注后48h达到高值，48h至72h保持高值，之后逐渐下降；缺血预处理后，小鼠肾脏TNF-α蛋白质的变化趋势与IR组一致，但在各个时间点的表达水平一直较IR组低。IR组、IPC+IR组0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d的TNF-α mRNA水平分别为：0.80±0.20v0.50±0.07；1.66±0.21v0.51±0.11；2.02±0.26v0.50±0.09；2.63±0.31v0.54±0.09；3.57±0.42v0.54±0.12；2.82±0.47v0.55±0.15；2.19±0.32v0.52±0.16；1.73±0.22v0.52±0.14；1.12±0.17v0.50±0.09；TNF-α蛋白质的水平(OD/10000）分别为：63.67±3.56v62.31±4.22；82.36±5.82v66.47±4.41；97.23±6.43v70.39±4.57；106.67±6.29v77.12±4.63；124.37±7.32v81.36±4.74；167.53±7.23v91.16±5.01；158.36±5.43v81.82±4.45；98.42±5.22v70.11±4.87；82.31±3.17v65.35±4.39。IR组与IPC+IR组相比较，两组在再灌注3h~5d各个相同时间点亚组TNF-α mRNA表达差异均具有显着性（P<0.05）；TNF-α蛋白质表达在0h~7d各个相同时间点亚组差异均具有显着性（P<0.01）。结论缺血预处理对小鼠AKI肾脏具有保护作用，这种保护作用可能与肾脏IPC促进miR-21表达，进一步低调MKK3，抑制p38MAPK通路下游因子IL-6、TNF-α表达有关。
高翔[8]2017年在《甘氨酸—氮氧自由基缀合物对缺血再灌注损伤的保护作用及其内在机制的研究》文中研究指明缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion injury,I/R)是临床上缺血性外伤和疾病所面临的一个重要威胁。针对缺血再灌注损伤,开发出有效的预防和治疗药物具有实际意义。目前普遍的观点认为缺血再灌注损伤的机理主要与过量氧自由基的产生、中性粒细胞介导的炎症和钙超载等因素相关。目前针对这些不同的机制均研发出了一些行之有效的药物,但是在临床上的效果都不甚理想。本课题从综合的观点出发,将具有抗氧化作用的氮氧自由基和具有抗炎症作用的甘氨酸缀合起来形成甘氨酸-氮氧自由基缀合物(GNN缀合物),通过大鼠双后肢缺血再灌注模型和肾缺血再灌注模型观察其对原位缺血组织和远端器官的保护作用,并通过建立体外脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型来探讨起内在的分子机制。第一部分甘氨酸-氮氧自由基缀合物联合缺血后处理对大鼠双后肢缺血再灌注损伤的治疗作用目的:本部分实验通过对缺血组织后处理联合静脉注射GNN缀合物的方式来共同应对大鼠双后肢缺血再灌注损伤,进而在体内层面评估GNN缀合物联合缺血后处理在急性双后肢缺血再灌注损伤大鼠模型中对多器官损伤的治疗作用。方法:大鼠按随机原则分为五组:(1)假手术组(6只):该组进行常规的麻醉后,不予以缺血再灌注处理,7 h后同其他组一起处理动物;(2)缺血再灌注组(8只):缺血3 h后,恢复供血4 h后处理动物;(3)单纯缺血后处理组(8只):缺血3 h,于终止缺血前15 min静脉注射PBS,终止缺血后,以2 min间隔反复阻断并恢复供血四个循环,然后恢复血供,4 h后处理动物;(4)GNN干预组(8只):缺血3 h,于恢复灌注前15min以10mg/kg/min静脉注射GNN,然后恢复血供,4 h后处理动物;(5)GNN合并缺血后处理组(8只):缺血3 h,于恢复灌注前15 min静脉注射GNN,剂量同前,松解阻断后,以2 min间隔反复阻断并恢复供血四个循环,然后恢复血供,4 h后处理动物。缺血再灌注处理方式:术前大鼠进行常规禁食12 h,仅给予饮水自由。使用戊巴比妥钠(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉,电热毯维持体温于37℃,用止血带包扎大鼠双侧后肢根部,使后肢缺血3 h后,撤除止血带,实现再灌注4 h。各组恢复供血4 h后,分别股静脉取血,分离血清,进行丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性、血清丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),血尿素氮(BUN)及血肌酐(Cr)含量的测定;ELISA技术检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;处死动物,分别收集肌肉、肺、肝、肾组织,分别进行肌肉和肺组织的湿重/干重(W/D)比例的测定;流式细胞术检测肌肉、肝、肾组织的细胞凋亡情况;部分肺组织匀浆,检测MDA和MPO水平或活性。结果:1 GNN在体内后肢缺血再灌注模型中对各脏器细胞凋亡的保护作用:流式检测结果表明在大鼠后肢缺血再灌注模型的基础上,使用GNN干预后,肾脏和肌肉细胞的凋亡状况得到明显改善。2组织水肿程度:与假手术组相比(肌肉:4.02±0.26;肺:3.66±0.32),缺血再灌注发生后,肌肉和肺组织的W/D比值(肌肉:6.07±0.37;肺:5.73±0.38)均有所升高。单纯缺血后处理虽然可以一定程度上缓解肌肉和肺组织水肿(肌肉:5.42±0.41;肺:5.01±0.39),但是不具有统计学意义。而单一GNN治疗组(肌肉:4.86±0.38;肺:4.50±0.27)及GNN合并缺血后处理治疗组(肌肉:4.45±0.39;肺:4.02±0.34)均可以缓解水肿情况,且联合处理的效果更明显。3血清及肺组织匀浆MDA水平:缺血再灌注损伤过程中,血清(3.45±0.44 nmol/ml)及肺组织(84.50±3.70 nmol/g)中MDA的水平明显高于假手术组(血清:1.67±0.13 nmol/ml;肺组织:41.80±3.20 nmol/g)。但是单纯缺血后处理无法降低MDA水平(血清:2.96±0.57 nmol/ml;肺组织:70.40±4.20 nmol/g)。单纯GNN治疗(血清:2.28±0.38 nmol/ml;肺组织:60.30±3.50 nmol/g)与GNN联合缺血后处理组(血清:1.89±0.20nmol/ml;肺组织:52.70±4.90 nmol/g)均可明显抑制MDA产生,且GNN联合缺血后处理组的效果更加明显。4组织氧化应激损伤的指标—MPO活性检测结果:缺血再灌注组大鼠肺组织MPO水平(19.30±1.91 U/g)显着高于假手术组大鼠(8.02±0.62U/g)。单纯GNN治疗组大鼠(10.41±1.20 U/g)及GNN合并缺血后处理治疗组大鼠(9.33±1.31 U/g)较缺血再灌注损伤大鼠MPO活性明显降低,后者更加显着。5 TNF-α检测结果:缺血再灌注组大鼠血清中TNF-α表达水平(130.62±5.71 pg/ml)显着高于假手术组(51.22±6.90 pg/ml)。单纯GNN治疗组(85.81±9.12 pg/ml)及GNN合并缺血后处理治疗组(72.20±9.51pg/ml)较缺血再灌注组的炎性细胞因子水平均显着下降。GNN合并缺血后处理虽然比单纯GNN治疗组TNF-α的表达水平低,但是它们之间没有统计学差异。6 GNN联合缺血后处理能够改善大鼠的肝肾功能:缺血再灌注组大鼠血清AST及ALT(AST:63.60±13.41μM;ALT:110.41±43.92μM)水平显着高于假手术组大鼠(AST:147.31±21.30μM;ALT:302.32±54.30μM);单纯GNN干预组大鼠(AST:92.21±23.62μM;ALT:203.90±43.92μM)及GNN合并缺血后处理(AST:78.74±16.81μM;ALT:177.32±33.61μM)均可有效降低ALT及AST的水平,且联合处理组的效果显着优于单一的GNN干预组。缺血再灌注组(BUN:14.20±2.12 m M;Cr:62.31±2.43 m M)与假手术组(BUN:7.33±1.90 m M;Cr:34.92±2.51 m M)相比,血清BUN水平和Cr水平显着升高;单一GNN干预(BUN:9.91±2.52 m M;Cr:45.32±2.11 m M)及GNN合并缺血后处理治疗(BUN:8.73±1.60 m M;Cr:40.91±1.82 m M),均可显着降低血清BUN和Cr水平。第二部分甘氨酸-氮氧自由基缀合物干预对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用目的:本部分实验旨在利用大鼠肾缺血再灌注模型研究GNN缀合物干预对肾I/R损伤的保护作用,以确定GNN缀合物在I/R损伤干预治疗中的有效性。方法:选取健康洁净级Wistar大鼠16只(雄性,月龄4月,体重250~300g),随机分为叁组。(1)假手术组(4只):该组动物仅进行常规麻醉,不予以缺血再灌注处理;(2)肾缺血再灌注组(6只):动脉夹完全阻断肾脏血流1 h后恢复血供,3h后处理动物;(3)缺血再灌注+GNN治疗组(6只):动脉夹完全阻断肾脏血流1 h,在恢复血供前15 min以30 mg/kg的量腹腔注射GNN缀合物,恢复血供3 h后处理动物;收集血清,检测尿素氮水平;收集部分肾组织,分别检测MDA、GSH水平及MPO活性;部分肾组织制备冰冻切片,HE染色观察肾组织的形态变化。结果:1 GNN缀合物可减弱肾组织因缺血再灌注带来的脂质过氧化反应:大鼠肾缺血再灌注损伤过程中,肾组织中MDA的水平(72.11±4.11nmol/g)明显高于假手术组(31.42±2.80 nmol/g)。GNN干预(36.51±2.42nmol/g)后显着抑制MDA的产生。2 GNN可以有效地维持自由基清除剂GSH的水平:缺血再灌注导致肾组织内的GSH水平明显降低(Sham假手术组:1.50±0.30μmol/g,缺血再灌注组:0.81±0.20μmol/g),GNN干预可以恢复GSH的含量(1.41±0.11μmol/g)。3 GNN可有效降低缺血再灌注肾组织中MPO活性:肾缺血再灌注组大鼠肾组织MPO水平(15.21±0.82 U/g)显着高于假手术组大鼠(4.63±0.73 U/g),而GNN缀合物干预后MPO活性明显降低(5.71±0.52 U/g)。4 GNN可有效改善缺血再灌注大鼠肾功能和肾组织损伤:肾缺血再灌注损伤组大鼠血清BUN水平(50.91±4.21 mg/dl)显着高于假手术组大鼠(14.52±2.30 mg/dl),;GNN缀合物干预可有效降低BUN水平(17.51±3.51 mg/dl)。HE染色结果显示,缺血再灌注组的肾脏与假手术组相比较,发生严重的肾小管坏死和肾小球损伤。而缺血再灌注损伤+GNN治疗组的肾脏组织的损伤明显减轻。第叁部分甘氨酸-氮氧自由基缀合物对血管内皮细胞HUVEC缺氧复氧损伤的保护作用及内在机制的研究目的:为了系统性研究GNN缀合物对缺血再灌注损伤调节作用的内在细胞和分子机制,本部分通过体外实验检测该缀合物对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)缺氧复氧过程中细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬和线粒体形态与功能的调节作用,为后期分子信号通路的研究提供了实验基础。方法:1 HUVECs的分离与培养:取健康产妇正常足月分娩婴儿的脐带(15 cm),用I型胶原酶分离收集HUVECs,种于100μg/ml层黏连蛋白预包被的培养瓶中培养,VIII因子相关抗原鉴定为阳性。2构建体外的缺氧复氧模型:取3-6代的HUVEC细胞,分为正常对照组、缺氧复氧组(T8R4)、缺氧复氧联合GNN 2μg/ml处理组(T8R4+D2)和缺氧复氧联合GNN 5μg/ml处理组(T8R4+D5)。MTT、SRB实验检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的改变,激光共聚焦显微镜结合免疫荧光技术检测JC-1、细胞色素c(Cytochrome c)和自噬相关蛋白LC3在细胞内的分布,qPCR和Western blot方法检测细胞周期、凋亡和线粒体相关基因的变化,透射电镜观察细胞线粒体形态的变化。结果:1甘氨酸-氮氧自由基缀合物可以恢复缺氧复氧对HUVEC细胞增殖能力的抑制作用:缺氧复氧处理可以显着抑制HUVEC细胞的增殖水平,但当GNN缀合物干预缺氧复氧模型时,HUVEC细胞的增殖水平增加。2 GNN缀合物无法逆转缺氧复氧对HUVEC细胞周期的抑制:与对照组相比,缺氧复氧可以明显地抑制细胞周期的进程,即G1期的比例显着增高,而S期+G2/M期的比例显着减少。但是当在缺氧复氧的基础上,用不同浓度的GNN缀合物干预,细胞周期并没有得到明显的改善。同时,缺氧复氧处理后,CCNB1、CCND1、CCNE1受到明显抑制,而p53的表达没有变化;当在缺氧复氧的基础上,用不同浓度的GNN缀合物处理细胞后,CCNB1、CCND1、CCNE1在m RNA水平和蛋白水平的表达并没有改变。3 GNN缀合物显着缓解缺氧复氧对HUVEC细胞凋亡的促进作用,上调BCL2表达,降低Bax和BAD表达:与对照组相比,缺氧复氧可以明显地促进细胞凋亡的发生,包括细胞的早期凋亡和晚期凋亡。但是当在缺氧复氧的基础上,用不同浓度的GNN缀合物在复氧阶段前干预细胞,细胞凋亡率明显减少。 qPCR和Western blot结果显示,在缺氧复氧处理后,促凋亡基因Bax、BAD的表达明显升高,而抗凋亡基因BCL2的表达显着下调。GNN缀合物后,Bax和BAD升高明显受到抑制,而BCL2的表达出现回调(Fig.3C-3D)。而p53的表达水平无论是在m RNA水平还是在蛋白水平均未发生变化。4 GNN缀合物能够恢复缺氧复氧对HUVEC细胞线粒体形态与功能的损伤:1)与对照组相比,缺氧复氧可以明显地促进细胞线粒体膜电位的降低,JC-1绿色荧光的增多,但是缺氧复氧联合GNN缀合物处理后,JC-1绿色荧光明显减少。2)Confocal检测了不同处理组细胞中细胞色素c的分布情况,结果显示,在正常的HUVEC细胞中,Cytochrome c染色集中在线粒体,而在缺氧复氧处理后,Cytochrome c则呈弥散分布。但是缺氧复氧联合GNN缀合物处理后,部分Cytochrome c又出现线粒体聚集。3)qPCR结果显示,与正常对照相比,缺氧复氧处理后,DRP1的表达明显升高,而MFN1、MFN2和OPA1的表达明显降低,而联合GNN缀合物处理后,DRP1的升高受到明显抑制,而MFN1、MFN2和OPA1的表达得到恢复。4)透射电镜结果显示,缺氧复氧会造成线粒体的非正常断裂,而联合GNN缀合物处理可以明显改善线粒体的断裂情况。5 GNN缀合物明显抑制缺氧复氧造成HUVEC细胞自噬的发生:与正常对照组相比,缺氧复氧可以明显地促进细胞自噬的发生,LC3呈斑点状聚集,但是GNN缀合物干预后,LC-3呈弥散。结论:1在体内,分别利用了双后肢缺血再灌注和肾脏缺血再灌注两个模型证明了GNN的保护作用。一方面,GNN可以清除机体内过量的自由基,减轻脂质过氧化反应,另一方面,GNN可以有效地减轻炎症反应,缓解缺血再灌注造成的局部和远端脏器损伤。该结果不但证明了多种细胞行为参与了GNN缀合物的保护作用,还证明了GNN缀合物在各种器官缺血再灌注损伤中的普适性,同时能够保护缺血再灌注损伤引发的多器官损伤。2 GNN缀合物在体外具有显着的抗缺氧复氧所引起的HUVEC细胞的凋亡、线粒体功能丧失和自噬的发生。
袁贵秀[9]2008年在《肢体缺血预处理对兔肝脏延迟性保护作用及其机制的研究》文中研究说明研究目的(1)研究肢体缺血预处理是否对兔肝脏具有延迟保护作用;(2)用Western blot免疫印迹法研究丝裂原活化蛋白激酶家族P44/P42MAPK、SAPK/JNK、P38蛋白激酶途径是否参与肢体缺血预处的延迟性肝脏保护作用;(3)用蛋白质组学方法研究肢体缺血预处理24h后肝脏组织蛋白质表达谱的变化,寻找可能参与肢体缺血预处理延迟性肝脏保护作用的蛋白质。研究方法实验分叁部分:(1)分为3组:IR组、假预处理对照组(S组)、肢体缺血预处理组(LIP组)。IR组不给任何预处理;S组术前24h分离新西兰大白兔双后肢股动静脉但不阻断;LIP组,术前24h分离双后肢股动静脉,阻断5min后再开放10min,重复3次。24h后叁组新西兰白兔阻断肝十二指肠韧带25min,再灌注3h,观察血流动力学变化,抽动脉血测ALT及TNF-α变化,用光学显微镜和电子显微镜观察肝脏组织与细胞的结构变化,并测定再灌注3h肝脏组织MDA、SOD含量及肝脏组织干湿比重(Wet/Dry,W/D),以确定肢体缺血预处理是否对兔肝脏具有延迟性保护作用。(2)运用western-blot免疫印迹法测第一部分中S组、LIP组兔缺血再灌注后30min肝组织P44/P42MAPK、SAPK/JNK、P38蛋白激酶磷酸化水平变化并与正常C组兔肝组织对照以确定其与肢体缺血预处理对肝脏保护作用的关系,并观察P38阻断剂SB203580预处理对肝脏缺血再灌注损伤的作用。(3)用双向凝胶电泳法分离肢体缺血预处理(LIP组)、假预处理对照(S组)24h后兔肝脏组织蛋白质,图像分析后找出差异蛋白质,并用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定部分差异蛋白质。研究结果(1)LIP组血流动力学较IR组、S组显着稳定,LIP组兔血浆AST、TNF-a及肝组织MDA含量明显低于IR组、S组,而肝脏组织SOD含量、肝组织干湿比重明显高于IR组、S组,光镜与电镜观察结果显示LIP组肝组织损伤亦较其它两组明显减轻。(2)缺血再灌注30min各组兔肝组织磷酸化P44/P42MAPK、JNK、P38蛋白激酶假手术C组明显升高,LIP组JNK、P38蛋白激酶磷酸化水平明显低于对照S组。P38蛋白激酶的抑制剂SB203580能模拟LIP对缺血再灌注肝组织产生肝脏保护效应(3)双向凝胶电泳分析发现,S组的蛋白质点数平均为739±18%,LIP组的蛋白点数平均为748±23%。其中差异明显的点有37个,选取12个差异蛋白质进行质谱分析,初步鉴定出7个蛋白质,其中6个在LIP组上调,另有一个蛋白质即ADP-核糖基化因子15在LIP组新出现。这些蛋白质包括应激蛋白(热休克蛋白27、NADPH依赖性羰基还原酶)、信号转导蛋白(G蛋白β亚单位2、ADP-核糖基化因子15、钙结合蛋白)、代谢相关蛋白(丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶)。研究结论(1)肢体缺血预处理对兔肝脏具有延迟性保护作用。(2)MAPKs信号传导通路介导了肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用,其中JNK、P38蛋白激酶信号传导通路具有重要作用。(3)肢体缺血预处理24h后肝脏组织的蛋白表达谱发生改变;初步鉴定出的7个差异蛋白质,提示肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用可能与这些蛋白质清除代谢毒物、改善能量代谢,稳定细胞内钙离子浓度等有关。其中热休克蛋白27是目前已知与预处理延迟性保护作用有关的效应蛋白质之一,首次发现其与肢体缺血预处理延迟相有关,丙酮酸脱氢酶、NADPH依赖性羰基还原酶、G蛋白β亚单位2、ADP-核糖基化因子15、钙结合蛋白、丙酮酸脱氢酶、醛脱氢酶是首次发现可能与肢体缺血预处理作用有关。这为全面揭示肢体缺血预处理的延迟性肝脏保护作用的分子机制提供了重要信息。
钟鸣[10]2012年在《JNK/MAPK信号通路介导川芎嗪对海马神经元损伤的保护机制研究》文中研究说明脑血管疾病是临床常见病、多发病,并且脑血管病患者的存活病人中有50-70%遗留不同程度的残疾,这些后遗症严重影响了患者的生命健康与生存质量。此外,随着医学科学技术的迅猛发展,围术期患者发生缺血／再灌注性脑损伤的风险也随之增大,因此围术期脑缺血再灌注损伤也是临床麻醉与复苏近年来所关注的热点。脑缺血再灌注损伤后中枢神经系统功能的恢复较差,脑缺血／再灌注损伤均会造成不同程度神经功能障碍。近年来国内外研究证实,脑缺血再灌注损伤不仅仅是由于脑氧供中断细胞能量供应不足导致的脑细胞凋亡,而是一个多环节、多因素、多途径的酶促级联反应。但其分子机制至今尚未完全明确。中药川芎嗪(TMP)常用于缺血性脑血管疾病及其后遗症的治疗,但其作用机制尚不明确,特别是从JNK信号转导通路探讨TMP预处理对缺氧／复氧大鼠海马神经元保护机制国内尚无文献报道。本研究拟在体外原代培养大鼠海马神经元细胞的基础上,以海马神经元细胞为研究对象建立细胞缺氧／复氧模型,模拟神经细胞的能量代谢障碍。观察不同浓度TMP预处理与JNK通路阻断剂SP600125对缺氧／复氧后海马神经元细胞凋亡细胞比例的影响,检测JNK信号转导通路相关蛋白的表达。试图通过本研究,从分子水平上阐明TMP预处理对缺氧／复氧大鼠海马神经元JNK转导通路的干预机制,为脑缺血损伤的治疗提供新的理论依据。目的通过TMP预处理对缺氧／复氧大鼠海马神经元影响的研究：1.阐明JNK信号转导通路在缺血再灌注诱导体外培养的神经细胞凋亡中作用机制。2.阐明TMP对缺氧／复氧大鼠海马神经元JNK信号转导通路的干预机制。方法1.体外原代培养胎鼠海马神经元细胞,培养7天后造模。2.实验分组及缺氧／复氧模型的建立：以培养7天的胎鼠海马神经元为研究对象,随机分为6组：N组(正常组即未缺氧组),C组(空白对照组Oug/ml),S组(JNK抑制剂SP600125组10μmol/L), L组(TMP低浓度60ug/ml),M组(TMP中浓度组200ug/ml),H组(TMP高浓度组800ug/ml),实验组分别加入相应浓度的药物,药物作用1小时后持续通入90%N2+10%CO2(流速0.2L/min),诱导缺氧2小时,然后放入5％CO2培养箱中复氧。3.培养7天的胎鼠海马神经元缺氧／复氧损伤后,采用Annexin V-FITC测定不同处理组海马神经元的凋亡率。免疫荧光法检测c-jun、c-fos、P-JNK蛋白的表达,及叁者之间的关系。采用实时定量RT-PCR法(探针法)检测缺氧／复氧后MKK4mRNA、 MKK7mRNA的含量及与P-JNK的相关性。结果1.与正常组N组比较,模型组均不同程度增加了海马神经元细胞的凋亡率(P<0.05)。与单纯缺氧／复氧组比较,S组(SP600125抑制剂组)、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低海马神经细胞的凋亡率(P<0.01)。M组(200μg/ml)组较60μg/ml、800μg/ml组差异亦有显着性(P<0.01),与S组无显着性差异。2.与单纯缺氧／复氧组比较,S组(SP600125抑制剂组)、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低C-fos、c-jun、P-JNK蛋白的表达(P<0.01)。川芎嗪200μg/ml组较60μg/ml、800μg/ml组差异较为显着(P<0.01),抑制剂组与川芎嗪组比较无显着性差异。3.与正常组比较,模型组均不同程度的增加了MKK4mRNA、MKK7mRNA的表达含量。与单纯缺氧／复氧组比较,S组(SP600125抑制剂组)、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低MKK4mRNA、MKK7mRNA的含量。川芎嗪200μg/ml组较60μg/ml、800μg/ml组差异亦有显着性(P<0.01),抑制剂组与川芎嗪组比较无显着性差异。结论SP600125抑制剂、川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低缺氧／复氧诱导海马神经细胞的凋亡和坏死,同时抑制JNK通路相关蛋白C-fos、 c-jun、P-JNK的表达。降低JNK激酶MKK4mRNA、MKK7mRNA的含量。SP600125抑制剂与高、中、低叁种浓度的川芎嗪均有保护作用,200μg/ml浓度的川芎嗪保护作用最显着。川芎嗪的保护作用可能是通过JNK信号转导通路的相关蛋白与激酶协同作用实现的。
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