崔智慧[1]2009年在《抗IV型胶原酶单域抗体V_H导向的力达霉素基因工程菌株的构建及融合蛋白CagA-V_H的表达研究》文中指出力达霉素(lidamycin,LDM),原名C-1027,是一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素,由球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)产生。其抗肿瘤活性比临床常用的阿霉素强10,000倍,已经进入临床Ⅱ期试验。力达霉素由一个酸性辅基蛋白CagA(C-1027 apoprotein、C-1027AG,也写作LDP)和一个烯二炔结构的发色团(chromophore,也写作LDC)非共价结合组成,发色团为活性组分,辅基蛋白保护和运载发色团。由于力达霉素自身具有辅基蛋白,可以将其与抗肿瘤抗体偶联成为融合蛋白,改造为靶向特异肿瘤的载体,构建导向性力达霉素。Ⅳ型胶原酶降解细胞基底膜中的Ⅳ型胶原,破坏基底膜及细胞外基质的完整性,引起肿瘤细胞的侵袭与转移,Ⅳ型胶原酶已经成为抗肿瘤研究的靶标。抗Ⅳ型胶原酶抗体可以抑制Ⅳ型胶原酶的活性并可作为导向药物的载体。本工作根据已知的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因序列,设计合成了具有链霉菌偏好密码子的抗Ⅳ型胶原酶单域抗体V_H(抗Ⅳ型胶原酶抗体重链可变区)基因,构建了含有辅基蛋白与抗Ⅳ型胶原酶单域抗体融合蛋白基因cagA-V_H和用于筛选的阿普霉素抗性基因aac(3)Ⅳ的重组质粒pBSH,用接合转移的方法导入力达霉素产生菌S.globisporus C-1027,通过同源重组双交换,以cagA-V_H -aac(3)Ⅳ取代力达霉素生物合成基因簇中原有的辅基蛋白基因cagA,得到基因工程菌株S.globisporus C-1027 V_H,以获得Ⅳ型胶原酶靶向的力达霉素。对基因工程菌株进行发酵,以枯草杆菌(Bacillus subtilis)为检定菌,结果表明基因工程菌株发酵液具有一定的抑菌活性,但与原产生菌相比活性较低。经Western blot分析在胞内能检测到融合蛋白和降解的辅基蛋白,而胞外仅检测到降解的辅基蛋白条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。同时构建了含有融合蛋白基因cagA-V_H但不含抗性基因的重组质粒pBS03H,通过同源重组双交换,以cagA-V_H基因取代cagA基因,得到仅融合了抗Ⅳ型胶原酶单域抗体基因的基因工程菌株S.globisporus C-1027NV_H。同样进行了发酵、抑菌活性、SDS-PAGE和Western blot的检测,结果与S.globisporus C-1027 V_H基本相同。为了增加融合蛋白的表达量,获得高活性的导向性力达霉素,本工作进一步构建了辅基蛋白阻断株,并通过导入多拷贝的融合蛋白表达质粒的策略来提高融合蛋白的表达量。构建重组质粒pBSA,将质粒接合转移至S.globisporus C-1027中,采用同源重组双交换的方法将cagA基因阻断。通过抗性筛选、PCR和Southern blot验证,最终获得辅基蛋白阻断株,命名为S.globisporus AKO。用四种辅基蛋白表达质粒pKCTA900、pSETTA900、pLTA900和pLTA400分别导入在自身启动子和/或强启动子控制下的cagA基因对阻断突变株S.globisporus AKO进行互补,得到相应的互补菌株。对阻断株和互补菌株进行发酵,发酵液的抑菌活性和HPLC分析结果表明阻断株完全丧失了力达霉素的产生能力,而互补菌株能不同程度地恢复产生力达霉素,其中S.globisporus AKO/pKCTA900基本恢复到野生株的水平。将质粒pKCA900、pSETA900、pLA900和pLA400接合转移至野生株S.globisporusC-1027中构建了相应的辅基蛋白过表达菌株。抑菌活性和HPLC分析结果表明过量表达cagA基因可以提高力达霉素的产量。构建辅基蛋白-单域抗体的融合蛋白表达质粒pKCTH2600、pSETTH2600分别导入辅基蛋白阻断株中进行表达。重组菌株S.globisporus AKO/pKCTH2600发酵液的抑菌活性在发酵晚期与野生株相当,经Western blot分析在胞内、胞外均能检测到融合蛋白的特异条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。结果表明融合蛋白在辅基蛋白阻断株中以多拷贝质粒的形式获得表达且表达量较基因工程菌株S.globisporus C-1027 V_H和S.globisporus C-1027 NV_H明显提高。综上所述,本工作通过优化融合基因的表达策略,提高了融合蛋白的表达水平,为获得抗Ⅳ型胶原酶单域抗体V_H导向的力达霉素奠定了基础,为进一步构建高表达的导向力达霉素重组菌株提供了新的技术平台。
聂凌虎[2]1998年在《一组导向融合蛋白的基因工程研究》文中研究指明很多高免疫反应的疾病中都发现有白细胞介-2受体(IL-2R)阳性细胞的浸涧和聚集，如器官移植排斥、自身免疫性甲状腺病、Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎等。成人T淋巴细胞白血病细胞和爱滋病病毒HIV感染的细胞表面也含有丰富的IL-2受体。IL2受体阳性淋巴细胞在这些疾病的病理过程中起着关键性作用。因此可以通过IL-2与毒素蛋白的基因融合，表达出融合毒素用以对IL-2受体异常丰富的靶细胞进行特异杀伤，从而达到治疗疾病的目的。然而到目前为止，要将此类融合毒素导向药物推向实际临床应用却存在一个很大的障碍：大分子异源蛋白在体内的免疫原性问题。 本论文分为四个部分。第一部分：融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因构建与诱导表达。第二部分：5种融合蛋白的快速纯化、生物活性测定及融合毒素抗血清的制备。第三部分：融合蛋白IL-2-K-PEZNM的纯化制备及药理活性的初步研究。前三部分的研究对象是IL-2与绿脓毒素的融合，主要目的是利用基因工程和蛋白质工程的方法，对本室曾经构建的融合毒素IL-2(60)-PE40进行一系列的基因突变与改造，探讨融合毒素结构与功能的关系，通过对突变体的活性比较，找到最适的构建突变融合基因的方式。第四部分：新型融合蛋白IL-2-TNFαM的纯化与初步药理实验。目的是探索一条构建无免疫原性融合毒素的新路 在本文第一部分中，我们通过PCR反应、插入突变及缺失突变等方法，构建了5种融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因，绿脓毒素突变体PEZN是我们利用本实验室克隆到的PE40基因的特异性所得到的一种突变体形式以求创新，将经典的PE40删除其360-380位氨基酸而得到；突变体PEZNK是将PE40中360-380位氨基酸删除并以—段扩增于人IgG4基因的富含Lys编码的基因片段取代而得到；突变体PEZNM是在突变体PEZN的基础上删除其C末端最后一个Lys而得到。其中IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK的基因分别克隆于表达质粒pT7-7的T7启动子下游，与质粒pGP1-2共转化大肠杆菌K38，温控表达，表达水平分别为18.1％，18.5％；IL-2-PE38M，IL-2-PE38KM，IL-2-K-PE38M的基因分别克隆于本室所构建的高效表达质粒pLSD13的P_L启动子下游，转化大肠杆菌DH5α，温控表达，表达水平分别为19.6％，19.8％，
董天堂[3]2008年在《杂合抗菌肽CL23和LH28的分子设计与表达》文中研究说明抗生素不规范使用加剧了耐药性细菌的产生,给人类健康带来严重威胁,迫待寻求新的抗菌制剂。抗菌肽不仅能直接抗菌,而且参与生物体免疫调节,是极具潜力的感染治疗药物。本实验尝试基于抗菌肽结构与活性关系,使用生物信息学工具优化设计与筛选杂合抗菌肽。选择牛乳铁蛋白衍生肽LFB15-W4,10、天蚕素A(cecropin A)、幽门螺杆菌肽HP(2-20)作为母体肽,截取不同片段进行杂合,以求获得高抗菌活性低溶血性的杂合肽。使用生物信息学工具计算杂合肽的物化参数,预测二级结构,优化参数和结构,选择合成了两条最具潜力的杂合肽:CA(1-8)-LFB15W(4,10),简称CL23;LFB15(W4,10)-HP(4-16),简称LH28,并测定合成肽活性,验证设计的合理性。与母体肽相比,杂合肽抗菌谱更广,抗细菌活性增强,并且在有效抑菌浓度下无明显溶血性;对大肠杆菌抑菌活性均比母体肽LFB15-W4,10提高了4倍;实验结果表明抗菌肽两亲性是影响其抑菌活性的关键结构特征;疏水性过强,正电荷过高会增加抗菌肽的溶血性。本实验尝试建立杂合肽的大肠杆菌重组高效表达与纯化分离系统。比较研究了对杂合肽的高效表达和纯化的影响因素:单体和多聚体表达、不同融合蛋白标签的毒性屏蔽和表达促进作用、融合蛋白酶法和化学法裂解、不同宿主对表达产物的耐受力。首先,在E.coli BL21(DE3)中融合表达单体CL23与LH28。根据E.coli密码子偏爱性设计基因,在其5'端设计Xa因子的酶切位点编码序列和限制性内切酶EcoR I、Not I酶切位点,选择pET28a(+)、pET32a(+)和pET41a(+)作为表达载体,正确构建了六个重组表达载体。经IPTG诱导表达, pET28a重组载体在SDS-PAGE凝胶上没有目的蛋白条带,pET41a重组载体以包涵体形式表达融合蛋白;pET32a重组载体以可溶形式表达融合蛋白,利于后续酶切;选择pET32a重组表达载体进行表达纯化,镍离子亲和层析柱(Ni柱)纯化融合蛋白纯度约90%。但Xa因子切割的特异性不强,效率不高,增加了纯化的难度;体系放大后,酶用量增加,成本增加。在单体表达研究基础上,选择LH28进行多聚体表达,提高杂合肽在融合蛋白中的比例,提高得率。多聚体重组肽与载体蛋白及各单体间均设计甲酸和羟胺的切割位点,按照大肠杆菌密码子偏爱性,设计LH28单体基因,并在两端设计非对称性限制性内切酶BbsI酶切位点,用于单体间串联;利用基因两端的限制性内切酶KpnI和HindIII酶切位点,构建重组克隆载体pUC19-LH28;以pUC19-LH28为模板PCR获得LH28单体基因,并利用BbsI酶切获得线性载体pUC19和带有粘性末端的单体基因;正确构建了2-6聚体和8聚体的重组克隆载体pUC19(-LH28)2-6,8。利用限制性内切酶KpnI和HindIII酶切位点,将多聚体基因序列插入到pET32a(+),正确构建了重组表达载体pET32a-(LH28)_(2-6),8。诱导表达引起宿主大肠杆菌BL21(DE3) OD600nm明显下降,而宿主大肠杆菌C41(DE3)与C43(DE3),诱导过程OD600nm没有下降,其对外源蛋白表达的耐受力显著高于BL21(DE3)。在SDS-PAGE凝胶上除了2聚体融合蛋白外,3-6和8聚体融合蛋白均没有目的蛋白条带;在相同诱导条件下C43(DE3)的菌体生长量(OD600nm)最高,C43(DE3)中融合蛋白Trx-(LH28)2表达量最高,占菌体总蛋白的35%,经Ni柱纯化,Trx-(LH28)2纯度95%以上,1升发酵液可纯化得到63 mg;使用50%甲酸于50℃,切割36h,Trx-(LH28)2被有效切割,Ni柱纯化重组单体杂合肽(P-LH-D)纯度85%以上,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌活性与合成肽LH28大体一致。实验结果表明利用生物信息学工具辅助设计和筛选杂合抗菌肽的方法,对杂合抗菌肽的分子设计具有一定的指导作用,节约了新型抗菌肽设计与筛选的时间和成本,杂合肽CL23和LH28可做为改造设计新型抗菌肽的模板。本实验实现了杂合肽LH28二聚体融合蛋白Trx-(LH28)2在大肠杆菌C43(DE3)中的高效表达;其绝大部分以包涵体形式表达,利于分离纯化;甲酸对难溶于水的蛋白质良好的溶解性,使得包涵体纯化后,不必进行复性,并降低了酶法的高成本;初步建立了杂合抗菌肽原核高效表达和融合蛋白切割分离纯化体系,为抗菌肽制备和应用奠定了基础。
陈红霞[4]2005年在《表皮生长因子受体配体寡肽与力达霉素组成的基因工程强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性的研究》文中研究指明已知目前在导向药物研究中，单抗偶联毒素的大分子量成为其应用于实体瘤治疗的主要障碍。与表皮生长因子受体特异性结合的配体寡肽GE7具有与表达EGFR的肿瘤细胞特异结合的特性，因此能以其为基础构建肿瘤靶向药物。本研究分别构建了EGFR配体寡肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程强化融合蛋白SG-LDP-AE和力达霉素辅基蛋白rLDP，并分别对它们的活性进行了研究。此外，为了得到更小分子量的活性力达霉素，进一步对力达霉素辅基蛋白进行截短的尝试，构建了不同的截短的力达霉素辅基蛋白的重组融合表达质粒。 一、EGFR配体寡肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程融合蛋白SG-LDP的构建及其抗肿瘤活性的研究 表皮生长因子受体EGFR过表达是多种上皮来源人体肿瘤的重要特性，且与患者不良预后有密切关系，因此，EGFR可以作为肿瘤导向治疗的理想靶点。大分子肽类抗生素力达霉素(lidamycin，LDM，又称C-1027)具有细胞毒作用强，体内抗肿瘤活性高的特点，是导向药物的理想“弹头”。力达霉素由辅基蛋白(LDP)和活性烯二炔发色团(AE)组成。LDP和AE可拆分和重建，因此可通过基因工程方法将EGFR特异性结合配体寡肽SG和辅基蛋白重组起来，然后加入发色团进行分子重建产生靶向药物。 本研究首先通过PCR扩增得到EGFR特异性结合的16肽GE7与力达霉素辅基蛋白融合的基因，将其克隆入质粒pET-30a(+)中，构建重组表达载体pET30GLDP。经酶切鉴定和序列测定后，又通过PCR扩增在上述基因前引入信号肽pelB基因序列，同时引入特异性酶切位点NcoI，然后将其克隆入质粒pET-30a(+)中，构建重组表达载体pET30SGLDP。经酶切鉴定和序列测定后，将载体pET30SGLDP转化入大肠杆菌BL21(DE3)star~(TM)中，加入0.05mM IPTG进行诱导表达。通过SDS-PAGE和Western-blot分析外源蛋白的表达，表达产物主要以分泌表达的可溶形式存在于大肠杆菌发酵培养液上清中，表达含量占培养液上清的70％以上。利用羧基端的组氨酸六聚体尾以Ni-NTA His.Bind树脂进行目的蛋白的分离纯化，经透析后每升发酵液可得到约40mg活性蛋白，纯度达95％
苏醒[5]2008年在《抗黑色素瘤scFv-mTNF-α免疫细胞因子的构建及其抗肿瘤活性研究》文中研究指明目的:构建抗黑色素瘤免疫细胞因子ScFv-mTNF-α,在大肠杆菌中表达并纯化具有黑色素瘤特异性结合活性和杀伤活性的融合蛋白,为黑色素瘤的抗体导向治疗打下基础。方法:为了避免使用天然型TNF-α所造成的强烈的副作用,我们尝试用高生物学活性、低毒性的突变型TNF-α(mTNF-α)将天然型TNF-α替代,与抗黑色素瘤单链抗体构建新型、高效、低毒的抗黑色素瘤免疫细胞因子原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,待鉴定正确后,通过在大肠杆菌中诱导表达、纯化,用制备的融合蛋白在体外对L929细胞进行TNF活性的检测,对B16-F10黑色素瘤细胞进行体外杀伤实验,在体内对荷黑色素瘤Balb/c小鼠进行导向治疗研究,以期获得具有临床应用潜能的抗黑色素瘤免疫细胞因子。首先鉴定本室保存的两个质粒pGEX-4T-1/ScFv和pGEX-4T-1/mTNF-α,并对其进行测序,用获得的测序结果推导出对应的氨基酸序列,查阅文献获得linker序列,将模拟得到的理论融合蛋白片断通过Insight II软件,采用同源建模、分子力学和分子动力学等方法预测蛋白质三维结构。设计含有限制性内切酶和linker序列的引物并分别扩增ScFv基因和mTNF-α基因,用重叠延伸PCR方法把ScFv基因与mTNF-α基因进行融合,将所获得的免疫细胞因子基因克隆入带GST标签的质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,用限制性内切酶酶切分析、DNA序列测定、SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白原核表达载体构建和表达的情况。IPTG诱导表达之后的表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-mTNF-α的抗黑色素瘤的融合蛋白。采用MTT法,标准曲线法用小鼠成纤维细胞L929检测免疫细胞因子的TNF-α活性;MTT法检测免疫细胞因子对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞株的杀伤作用;免疫荧光测定ScFv对黑色素瘤细胞的特异结合活性;体内实验用Balb/c小鼠尾静脉注射小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10,实验分为PBS组、ScFv组、mTNF-α组、ScFv-mTNF-α四组,每组8只动物。接种一天后开始尾静脉注射给药,连续给药一个星期,每24h一次,给药量为60ug/只·天,一周后解剖各组小鼠进行比较,观察小鼠肺部黑色素瘤转移的情况。结果:质粒pGEX-4T-1/ScFv经过测序后ScFv基因长732bp,基因内无终止码,为开放读框,编码244个氨基酸,含六个CDR区,并含有维持抗体结构所必需的四个半胱氨酸。计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性,表明所克隆基因为功能性重排小鼠抗体可变区基因。mTNF-α基因与天然型TNF-α基因比较,缺少了7个N端氨基酸的同时Pro8Ser9Asp10改也变为ArgLysArg,C端第157位Leu由疏水性氨基酸Phe替代。根据文献确定linker序列为GTGGGS,将ScFv与mTNF-α基因融合后对获得的理论融合蛋白的序列进行三级结构预测,结果显示融合蛋白单体和形成三聚体后的ScFv与mTNF-α彼此功能结构域不会互相影响。PCR扩增出ScFv和mTNF-α基因片断,通过OE-PCR方法将两个片断进行融合,构建了原核表达质粒pGEX-4T-1/ScFv-mTNF-α,转化大肠杆菌TG1,经IPTG诱导在分子量为69KD处有一条明显的新生蛋白带,用抗GST单抗进行Western blot分析也证实了该新生蛋白带为GST-ScFv-mTNF-α融合蛋白。表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析→凝血酶切→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-TNF-α的抗黑色素瘤的免疫细胞因子。在ScFv-mTNF-α的MTT实验中,我们发现ScFv-mTNF-α对TNF敏感的小鼠成纤维细胞L929具有明显的杀伤作用,测得免疫细胞因子的mTNF-α活性为34382 u/mg,表明融合蛋白的mTNF-α端具有良好的生物学活性;免疫荧光实验结果表明scFv具有良好的与黑色素瘤细胞结合的特异性;对B16-F10细胞株的杀伤实验表明免疫细胞因子具有体外结合并杀伤黑色素瘤细胞的特性,杀伤效应存在浓度依赖关系,即融合蛋白浓度越大,对细胞的杀伤越强,浓度在100μg/ml时对B16-F10细胞的杀伤效果最佳。B16-F10接种的各组Balb/c小鼠在经过一周的治疗后肺表面均没有明显的黑色素瘤转移结节,PBS对照组也没有发现肺部肿瘤转移灶形成,可能的原因是B16-F10对Balb/c小鼠有较强的免疫原性。因此我们将实验进行了改进,改用C57/BL6小鼠,延长实验周期,即延长肿瘤转移后的生长时间,再对其采用融合蛋白进行治疗,观察融合蛋白在体内对黑色素瘤的杀伤效应。实验正在进行中。结论:成功构建了抗黑色素瘤免疫细胞因子pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α原核表达载体,用获得的融合蛋白进行体内外活性研究,实验结果表明免疫细胞因子ScFv-mTNFα具有较好的体外生物学活性。
张吉斌[6]2005年在《抗—牛朊蛋白单链抗体检测系统的构建、表征与应用》文中认为朊病毒(PrP~(sc))是一种新型蛋白质感染因子，能够引起人和动物的可转移性神经退化疾病，如牛海绵状脑病(BSE)(或称疯牛病)和人的新型克雅氏病(nvCJD)。BSE已在世界范围内对养牛业和世界经济造成了巨大损失，由于受污染的牛制品可将疯牛病传染给人类，给人类健康构成了巨大威胁，因此建立特异、灵敏的牛朊病毒检测方法十分重要。 免疫学检测是牛朊病毒主要的检测方法，目前，用于检测的抗体为单克隆抗体。本研究尝试建立单链抗体介导的夹心蛋白芯片用于牛朊蛋白的检测。要获得抗牛朊蛋白单链抗体，首先构建噬菌体抗体库。由于牛和小鼠的PrP基因同源性约90％，为了避免出现免疫耐受，采用牛朊蛋白融合蛋白免疫小鼠。通过PCR和DNA重组构建了牛朊蛋白基因的原核表达载体，在基因水平上构建了硫氧还蛋白(TrxA)基因和牛朊蛋白基因的融合基因，并在大肠杆菌中进行了IPTG诱导表达硫氧还蛋白-牛朊蛋白融合蛋白(TrxA-bPrP~c)。Western blot分析表明该融合蛋白具有结合牛朊蛋白单克隆抗体的活性。采用TrxA-bPrP~c融合蛋白免疫小鼠成功突破了小鼠免疫耐受，诱导了抗牛朊蛋白抗体。通过PCR从牛朊蛋白融合蛋白免疫的小鼠脾脏B细胞中扩增抗体可变区基因片段(V_H，V_L)，然后通过Overlap PCR扩增抗体可变区基因，将体外组装的scFv基因片段克隆入噬菌体展示载体pCANTAB 5E，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，从噬菌体抗体库中筛选出针对牛朊蛋白特异的单链抗体Z163、Z186和Z1030。在此基础上构建了四个单链抗体融合蛋白：Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z163-Fc和Z1030-Fc，采用Western Blot、SPR和Sandwich ELISA方法对其特性进行了研究。Western Blot结果表明Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z1030-Fc和Z163-Fc可特异识别重组牛朊蛋白核心区片段的线性表位；用夹心ELISA对4个单链抗体融合蛋白及抗牛朊蛋白单克隆抗体KG9进行配对实验，Z186-L-SBP／Z163-Fc和Z163-L-SBP／KG9配对显示明显的阳性结果；用SPR方法测定了Z163、Z163-L-SBP、Z163-Fc和Z186-L-SBP的亲和力，其平衡解离常数(KD)分别为8.82×10~(-8)M、4.11×10~(-8)M、8.10×10~(-9)M和3.24×10~(-8)M。单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP亲和力是单链抗体Z163的2.2倍，单链抗体融合蛋白Z163-Fc亲和力是单链抗体Z163的11倍，亲和力有明显的提
宋晓彤[7]2008年在《重组肠激酶包涵体的复性、纯化及其新型重组子的构建》文中认为肠激酶(enterokinase, EK)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,可沿胰蛋白酶原序列中(Asp)4-Lys的羧基端切下,从而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、轻胺等化学试剂,肠激酶具有非特异性切割少,反应条件宽泛,切割位点在全部识别序列之后,切出的目标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。近年来所做的尝试多是克隆与表达235个氨基酸的具有酶学活性的肠激酶轻链(EK_L)。本论文的第一部分是对本实验室已构建好的工程菌pET39b-EK_L/BL21(DE3)的蛋白表达、纯化进行研究。先确定了诱导条件:37℃下培养菌体,OD600为0.7时开始诱导,诱导6小时,IPTG终浓度为0.5mmol/L。随后对培养液上清中的目标蛋白进行亲和分离纯化,产量为每100毫升原发酵液中纯化后的目标蛋白肠激酶量为43.65μg,纯化收率8.34%。由于上清液中肠激酶收率不高,本文又对肠激酶包涵体进行变性复性、纯化研究。采用变性上柱、柱上复性方式进行镍离子亲和分离纯化,利用产物N段携带8个相连的组氨酸与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性,应用Ni-NTA金属螯和层析对样品包涵体进行纯化分离。实验结果表明,在变性条件下纯化的样品在柱上不经洗脱,直接用复性液洗涤,可以使肠激酶在得到提纯的同时实现复性。最后优化复性条件,提高收率。经测定包涵体复性后产量可达到470μg,纯化收率可达到20.3%。第二部分,本论文开创了另一种利用肠激酶蛋白的新思路——构建双质粒系统,让目的融合蛋白在体系中不需要再单独加入肠激酶蛋白就可进行融合蛋白的切割。并针对现在工业化生产中融合蛋白有以包涵体形式和可溶分泌表达形式两种情况,对双质粒系统进行了初步的构建。构建了一个复制子与大多商业化质粒不相同,拷贝数低,不影响目的蛋白大量表达的重组子——pSB3K3- EK_L。将EK_L基因插入到载体pSB3K3中,并就其表达出的肠激酶蛋白的活性影响条件进行了研究,确定了最佳缓冲液PH值为7.5;最佳反应温度为35℃;合理反应的反应时间为2h。
张小平[8]2006年在《新型肝癌免疫毒素的构建表达与活性鉴定》文中认为原发性肝癌在世界范围分布较广泛，是严重影响我国人民健康的疾病之一。随着现代医学影像技术的发展，肝癌的诊断率和准确性大幅度地提高了，但是包括基因工程技术在内的现代分子生物学技术的发展在肝癌临床治疗中的应用和对预后的提高上几乎是微乎其微，传统的肿瘤治疗方法在肝癌的治疗中仍占据绝对主导地位。随着肝脏外科技术的改进，肝癌的手术切除率和治疗效果也不断提高，手术死亡率随之降低，但手术治疗也有其特有的局限性，尤其在肝癌的中晚期病人中，往往已不能采取手术治疗的方法。另外常规的放射治疗和化学治疗等方法也存在种种不足和缺陷，如肿瘤的耐药性以及严重的副作用。因此研究肝癌的诊断与治疗新方法具有十分重要的理论与现实意义。 免疫毒素是近年来新兴的一种肿瘤导向治疗方法。它利用抗肿瘤单抗与肿瘤细胞的特异性结合，将生物毒素与抗体偶联，定向攻击肿瘤细胞，而对正常组织的杀伤较小，故被形象地称为“生物导弹”。免疫毒素的细胞毒作用主要源于各种生物毒素，它们的生物活性较高、毒性较大。我们采用的毒素是改造过的绿脓杆菌外毒素PE40KDEL，即去除原毒素中的细胞非特异性结合域并进行了氨基酸突变以增加其细胞毒性，使获得的毒素蛋白在丧失了非特异性细胞毒性的同时增加了对靶细胞的毒性，因而具有很高的应用价值。目前，免疫毒素已在乳腺癌、黑色素瘤、白血病治疗和体外骨髓移植等方面获得了一定的进展，有不少制剂也进入临床Ⅰ／Ⅱ期试验阶段。但由抗体介导的免疫毒素在体内的应用还没有人们预期的那么有效，其原因主要在于：一，鼠源性抗体进入人后会产生人抗鼠的抗体(HAMA)，引起人体过敏反应；二，抗体分子量大，在体内组织的穿透能力差；三，目前多数的小分子抗体自身的亲和力较低，特异性不高；四，肿瘤自身抗原表达的不均一性及抗原的调变，可以逃避偶联药物与之的结合，从而影响治疗效果。随着小分子多肽研究的进一步深入，尤其是随着噬菌体肽库技术的发展，小分子导向载体的发现和应用为导向治疗提供了新途径。 本课题拟从噬菌体展示肽库中筛选能与肝癌细胞发生特异性结合的噬菌体肽(称为肝癌特异性结合肽，liver cancer adhesion peptide，LAP)，并与改造过的绿脓杆菌外毒素PE40KDEL进行基因重组，旨在得到特异性高，杀伤力强的新
王彪[9]2007年在《提高人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在植物中表达的策略研究》文中研究表明外源基因在宿主体内的表达水平是决定生物反应器能否产业化的关键。制约植物生物反应器应用的主要问题是,外源蛋白在植物体内的累积水平低,生产成本高,产品没有市场竞争能力。若要实现工业生产,理论上外源蛋白的表达量应达到植物总可溶性蛋白的1%以上。目前,人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)在很多宿主细胞中都得到表达,但用植物生产人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子时,表达水平很低,远未达到工业生产要求。人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种能够刺激粒细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化的糖蛋白。它是一种造血生长因子,能提高机体的免疫能力,主要用于治疗在骨髓移植、癌症化疗等过程中引起的白细胞减少病症。hGM-CSF基因全长2.5 kb,含有4个外显子和3个内含子。人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子由144个氨基酸组成,其中前17个氨基酸为信号肽,成熟hGM-CSF由127个氨基酸组成,相对分子量约为16, 293。本研究选用在种子中特异表达的β-伴大豆球蛋白α'亚单位启动子,在启动子下游插入烟草花叶病毒的5′非转录区(Ω序列)。对翻译起始位点序列进行改造,使之符合植物Kozak序列的特征。本研究对hGM-CSF基因进行人工改造,包括:①对hGM-CSF基因的信号肽进行人工改造。用菜豆植物血球凝集素(PHA-E)的信号肽替换hGM-CSF的信号肽,PHA-E信号肽具有偏向植物氨基酸密码子的特点,有助于提高基因的翻译水平。②对hGM-CSF基因的末端进行人工改造。hGM-CSF末端分别连接了内质网驻留信号(KDEL)和贮藏囊泡靶向信号。KDEL四肽能够将目标蛋白导向内质网,避免蛋白受到蛋白酶的破坏,从而提高目标蛋白的积累水平。在hGM-CSF基因的末端加上菜豆7S球蛋白(phaseolin)贮藏囊泡靶向信号(AFVY),AFVY短肽能够将重组蛋白导向蛋白贮藏囊泡,提高种子中蛋白的积累。③对hGM-CSF基因的3'-非翻译区进行人工改造。在hGM-CSF基因的3'-非翻译区插入人的7SL RNAⅣ区的44个核苷酸,7SL RNAⅣ区能够形成具有三个环的二级结构,与信号识别颗粒(SRP)中的蛋白亚基SRP54结合,是一种“天然”的适配体(aptamer)。将改造后的启动子和hGM-CSF基因构建成表达载体pCAMBIA2300-CSF1、pCAMBIA2300-CSF-KDEL、pCAMBIA2300-CSF-AFVY、pCAMBIA2300-CSF-AP,转化拟南芥。本研究还探讨了利用反义干扰技术来提高外源基因的表达可行性。利用拟南芥at2S2基因本身的启动子和poly(A)信号,构建含反义at2S2基因的表达载体pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S和pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S,转化拟南芥。将构建的pCAMBIA2300-CSF1、pCAMBIA2300-CSF-KDEL、pCAMBIA2300-CSF-AFVY、pCAMBIA2300-CSF-AP、pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S和pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S表达载体转化拟南芥,在含卡那霉素的培养基上筛选。分别筛选出C(转化pCAMBIA2300-CSF1)、KD(转化pCAMBIA2300-CSF-KDEL)、AF(转化pCAMBIA2300-CSF-AFVY)、AP(转化pCAMBIA2300-CSF-AP)、KDS (转化pCAMBIA2300-CSF-KDEL-anti2S )、AFS (转化pCAMBIA2300-CSF-AFVY-anti2S)转基因株系50、32、28、6、7、9个。AP、KDS和AFS系列转基因植株出现部分植株种子败育的现象,但仍有一部分植株得到后代并且能够稳定遗传下去。采用PCR扩增初步验证转基因植株。Southern杂交表明,AP、KDS、AFS系列的转基因植株,虽然存在拷贝数的差异,但外源基因已经整合到基因组中。对于AF和KD系列的转基因单株,计算T2代分离比例,初步筛选出单拷贝的转化株,再根据Southern杂交的结果,筛选出单拷贝转基因植株。对单拷贝的转化株,用KD6转化株作为花粉供体,分别与其他单拷贝的KD、AF转化株进行杂交。取KD6转化株根、茎、叶和授粉6天的种子,提取RNA,经DNAaseⅠ处理后,用hGM-CSF基因特异引物进行RT-PCR。结果显示,β-伴大豆球蛋白α'亚单位启动子在根、茎、叶中都没有明显的表达,在种子中特异表达。取KD6转化株不同发育时期的种子,半定量RT-PCR表明,β-伴大豆球蛋白α'亚单位启动子在种子发育早期就开始表达,以后逐渐增强,到种子发育后期仍有很强的表达。ELISA分析结果显示,C系列转基因植株未成熟荚中重组hGM-CSF蛋白含量低于0.01%,在hGM-CSF基因3'-末端加上导向信号后重组蛋白含量显著提高。KD与AF系列转基因植株的rhGM-CSF表达水平没有显著的差异。表明AFVY和KDEL信号都能够显著提高重组蛋白在种子中的积累。KD×KD6和AF×KD6杂交当代种子ELISA结果表明,KD×KD6与AF×KD6杂交株当代种子中显示出基因加性效应,但AF×KD6杂交株基因加性效应比KD×KD6明显。取重组蛋白积累水平相近的KD1、AF18母本,分别与KD6杂交后,对杂交当代种子中hGM-CSF mRNA定量分析表明,hGM-CSF mRNA表达水平无显著差异,但重组蛋白的积累水平差异显著,表明AFVY和KDEL信号在重组蛋白筛选和运输途径中独立起作用。AP系列转化株的蛋白积累平均值比KD要高1倍以上,方差分析表明两组平均值之间存在极显著差异。对KD和AP系列的转基因植株进行hGM-CSF mRNA定量结果显示,mRNA水平越高,重组蛋白积累水平就越高,表明hGM-CSF基因3'-非翻译端插入7SL RNAⅣ区核苷酸对mRNA的稳定起作用。对KDS、AFS系列转基因植株at2S2基因mRNA定量分析显示,反义干扰显著抑制at2S2基因的表达。SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,拟南芥种子中2S、12S-A和12S-B各个组分之间相对量无明显变化。抑制at2S2基因表达并没有改变种子中主要沉降蛋白组分比。反义干扰的转基因植株重组蛋白表达水平与KD、AF之间有极显著的差异,表明抑制at2S2基因表达能够提高重组hGM-CSF蛋白的积累,但hGM-CSF和atS2基因的mRNA定量分析表明,at2S2基因抑制程度与hGM-CSF基因表达水平之间并不存在线性关系。Western杂交结果显示,KD、AF和AP表达的重组hGM-CSF蛋白分子量大约在21 kDa左右,与转基因烟草相似,比天然hGM-CSF分子量要大5 kDa左右。表明植物中表达的重组hGM-CSF蛋白糖基化水平较高。TF-1细胞增殖实验表明,植物中表达的重组hGM-CSF蛋白具有完全生物活性。
苗庆芳, 尚伯杨, 甄永苏[10]2004年在《单抗3G11的重链可变区单域抗体与力达霉素构建的基因 工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性研究》文中提出目的:为了研制更加小型化的单抗导向药物,以Ⅳ型胶原酶为靶点,以抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11和具强烈肿瘤细胞杀伤作用的抗生素力达霉素(LDM)为基础,制备单抗3G11的重链可变区单域抗体与LDM的强化融合蛋白,以期获得一种新型的具良好抗肿瘤活性的小型化单抗导向药物。方法:运用基因工程技术分别克隆得到单抗3G11的重链可变区VH基因片段和力达霉素辅基蛋白LDP基因片段,同时在VH基因C末端引入spacer序列,将它们先后克隆人pET-30a(+)载体中,构建重组表达质粒。pET—VH—LDP并转化大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE、Western—blot等方法检测融合蛋白VH—LDP的表达情况。IMAC纯化融合蛋白,分步透析法对其进行复性后超滤浓缩并定量。ELISA法、免疫组化法检测VH—LDP对Ⅳ型胶原酶和不同肿瘤细胞的免疫反应性,明胶酶谱法检测其对Ⅳ型胶原酶活性的影响。冷甲醇抽提法制备力达霉素活性发色团AE并与VH—LDP进行分子组装,经PD—10柱分离得到强化融合蛋白VH—LDP—AE。MTT法检测VH—LDP-AE对肿瘤细胞的杀伤作用,鸡胚尿囊膜法检测其对血管生成的影响,小鼠皮下移植性肝癌22肿瘤模型观察其动物体内抗肿瘤活性。结果:成功构建融合蛋白重组表达质粒pET-VH—LDP并在大肠杆菌中进行表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量占全菌蛋白的30%以上,经纯化和复性,获得纯度达95%以上的可溶活性蛋白。VH—LDP保留了完整单抗3G11对抗原Ⅳ型胶原酶的部分结合活性,亲和常数为5(106 M-1,其活性程度可与其相应单链抗体相比拟。VH—LDP对人肝癌7721、人口腔鳞癌KB、小鼠肝癌22等多种肿瘤细胞均呈较强的免疫学反应性,抗体相对亲和力小于1.5(10—6 M。VH—LDP对Ⅳ胶原酶活性有显著的抑制作用,能够使人结肠癌HT-29和人纤维肉瘤HT-1080细胞分泌的明胶酶的负染条带明显减弱,并且呈浓度依赖性。免疫组化结果显示,VH—LDP与人纤维肉瘤HT-1080细胞和小鼠移植性肝癌22实体瘤切片均呈阳性染色,而对小鼠正常肝组织切片免疫反应则呈阴性。制备强化融合蛋白VH—LDP—AE,结果表明其对体外培养的多种肿瘤细胞均有强烈的杀伤作用:对KB、HT-29、HT-1080和PG等细胞的IC50值分别为4.35(10—14 M、2.53(10—13 M、7.65(10—13 M和1.49(10—13 M。在0.5一0.05μg/egg剂量范围内,VH—LDP—AE可抑制bFGF刺激的鸡胚尿囊膜新生血管的生成,使之形成明显的无血管空斑,抑制率达100%。VH—LDP—AE显著抑制小鼠移植性肝癌22的生长,皮下接种肿瘤后1天iv给药1次,0.25 mg/kg和0.125 mg/kg剂量组的抑瘤率分别为95.9%(P<0.05 vs.LDM)和88.1%(P<0.01 vs.LDM),具有比游离LDM耐受剂量(79.6%)更强的肿瘤生长抑制作用,且生存时间显著延长;采用延迟方式即在接种肿瘤后3天给药,耐受剂量下抑瘤率分别为88.5%和81.3%,显著强于LDM耐受剂量组71.5%的抑瘤率。且在治疗期间,无死亡,动物体重有所增加,一般状况良好。结论:强化融合蛋白VH—LDP—AE具肿瘤细胞结合活性并在动物实验中显示出比LDM更好的抗肿瘤疗效。其分子量为26.2 kDa,是迄今报道的分子量最小的动物实验有显著疗效的抗体工程融合蛋白,可能成为新型的肿瘤靶向性抗体工程药物。
参考文献：
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[8]. 新型肝癌免疫毒素的构建表达与活性鉴定[D]. 张小平. 华东师范大学. 2006
[9]. 提高人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在植物中表达的策略研究[D]. 王彪. 上海交通大学. 2007
[10]. 单抗3G11的重链可变区单域抗体与力达霉素构建的基因 工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性研究[C]. 苗庆芳, 尚伯杨, 甄永苏. 第三届中国肿瘤学术大会教育论文集. 2004
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