陈彩平 张国成 汪 萍 杨欣伟
第四军医大学西京医院儿科 陕西 西安 ７１００３２
【摘要】 目的 构建人细小病毒B１９中国株结构蛋白VP１基因片段的重组表达载体,获得大量表达的VP１蛋白.方法 从我科保存的人细小病毒B１９中国株结构蛋白VP１基因片段的重组克隆载体中获得VP１基因片段,将该片段亚克隆入表达载体pRSETA,构建VP１－pRSETA表达载体,并转化至感受态大肠杆菌BL２１中,经IPTG诱导使蛋白表达,在不同表达时间收获细菌,给予不同诱导剂浓度及在不同温度下进行诱导表达,利用蛋白电泳检测VP１蛋白表达情况;超声裂解诱导表达的细菌,收集上清和沉淀进行蛋白电泳,分析表达蛋白的溶解性.结果 成功构建了融合蛋白VP１－pRSETA 的重组表达质粒,表达的融合蛋白经１５％SDS－PAGE电泳证实大小为２．２kd结论 获得人细小病毒B１９ 中国株结构蛋白VP１基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及制备单克隆抗体和疫苗有重要意义.【关键词】 人细小病毒B１９; VP１基因片断; 载体构建; 诱导表达【中图分类号】R４５７【文献标识码】B 【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８８８－０１
１ 材料和方法１．１ 材料１．１．１ 含有B１９病毒中国株VP１基因片段重组载体VP１－pQE３０的大肠杆菌JM１０９由我科保存,该质粒保存前在上海基康公司用ABI３７００自动测序仪测序,为正确的重组质粒.１．１．２ pRSET A 载体购自Invitrogen公司,大肠杆菌BL２１、DH５α为本室保存.１．１．３ 胶回收试剂盒,质粒提取试剂盒为华舜生物工程公司产品,限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司,DNA连接酶购自Promega公司.
２ 方法２．１ B１９病毒中国株VP１基因片段的获得将含有B１９病毒中国株VP１基因片段重组载体VP１－pQE３０的JM１０９菌株复苏,增菌后提质粒,进行BamHI和PstI双酶切,酶切产物用１％琼脂糖凝胶电泳进行分析,将VP１片段经胶回收纯化.２．２ pRSETA载体的酶切和纯化将含有pRSETA质粒的DH５α菌株复苏,增菌后提质粒,进行BamHI和PstI双酶切,酶切产物进行１％琼脂糖凝胶电泳,将pRSETA 载体经胶回收纯化.２．３ 原核表达载体的构建将上述酶切并纯化的产物进行连接反应,反应体系为:VP１６μL,pRSETA载体２μL,１０×buffer２μL,DNA 连接酶１μL,去离子水９μL,１８℃ 反应１６小时.
２．４ 原核表达载体的鉴定随机挑取３个白色菌落,经BamH１、PstI双酶切,酶切产物进行１％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,确认质粒构建成功.２．５ 诱导融合蛋白的表达将VP１－pRSETA转化感受态大肠杆菌BL２１,将转化成功的大肠杆菌BL２１经方法４酶切鉴定后,３７℃振荡过夜培养,再按１:５０的比例接种LB培养基,３７℃剧烈振荡培养３小时,加入IPTG 诱导融合蛋白的表达.采用不同的IPTG浓度,３７℃分别进行诱导表达４小时;给予IPTG１mM,３７℃进行诱导表达,在不同时间(１、２、３、４、５、６小时)收集细菌;给予IPTG１mM,在３７℃,３０℃,２５℃下分别进行诱导表达４小时,将收集的细菌进行１５％SDSPAGE,检测目的蛋白的表达情况.２．６ 表达产物溶解性分析大量诱导VP１－pRSETA 转化的大肠杆菌BL２１进行表达,收集细菌,经超声破碎,４℃,５５００rpm/分钟离心１０分钟,分别收集上清和沉淀,同时进行１５％SDS－PAGE.
３ 结果３．１ VP１片段和pRSETA 载体的酶切和纯化将VP１－pQE３０和pRSETA 经BamH１、PstI双酶切的产物进行１％琼脂糖凝胶电泳,分别切取４８０bp和２．９kb附近的条带,进行胶回收.３．２ 表达载体的构建将构建的原核表达载体VP１－pRSETA经BamH１、PstI双酶切,酶切产物经１％琼脂糖凝胶电泳,证实载体构建成功
３．３ 诱导表达和表达的优化在约２２KD 附近,诱导后的细菌有大量融合蛋白表达.采用不同的IPTG浓度诱导表达４ 小时,０．０１mM 至２mM 均有表达,诱导剂浓度为０．５mM 时,表达率最高,为１９．６％(表１);固定IPTG浓度为１mM 进行诱导表达,１小时后即有表达,５小时后表达率最高,为１９．９％(表２);IPTG 浓度为１mM 进行诱导表达４小时,３７℃下表达率最高,３０℃下有表达,２５℃下几乎无表达.
表１ 不同诱导剂浓度诱导的蛋白表达率
４ 表达产物的溶解性在大约２２KD附近,诱导后全菌液有大量融合蛋白表达,超声破碎后的上清中均有融合蛋白,沉淀中融合蛋白的量较大,提示蛋白主要存在于包涵体中,也有部分可溶性表达．
５ 讨论pRSET载体是pUC来源的高效原核表达载体,具有T７启动子和一段编码N末端融合蛋白的序列.该序列包括ATG翻译起始密码子,编码可作为翻译蛋白的金属粘连区域的６个组氨酸残基的序列,使转录过程稳定进行的序列,抗Xpress表位和肠激酶裂解识别序列.其中金属粘连区域可使重组蛋白通过固相金属亲和层析法获得纯化蛋白,而肠激酶裂解识别位点可使N末端融合蛋白与纯化的重组蛋白分离.插入的DNA即位于该融合蛋白序列的下游.因此,将VP１蛋白克隆至pRSETA 载体中,既有利于VP１蛋白的高效、稳定表达,又有利于VP１蛋白的进一步制备和纯化.本实验中,作者构建了VP１－pRSETA原核表达载体,经限制性内切酶双酶切和DNA 电泳证实构建成功.将构建成功的VP１－pRSET A 原核表达载体转化感受态BL２１,在IPTG诱导下可表达融合蛋白,经SDS－PAGE证实为２２KD的融合蛋白.进一步可利用pRSET载体的６－His标签对所表达的融合蛋白进行纯化.
原核表达系统常受到目的基因本身的结构特点、转录水平的调节和蛋白质水平等诸多因素的影响.克隆化基因表达水平低下的原因可能归于RNA不稳定、过早终止、无效翻译及蛋白质不稳定.在许多情况下,蛋白质不稳定的问题可通过提高外源蛋白的合成量进行克服.首先要选择可高效表达外源蛋白的原核表达载体和菌株,其次可通过改变诱导物的量、诱导温度等策略来改变合成的动力学.本实验中,作者通过蛋白电泳观察了不同的诱导剂浓度、不同诱导温度和不同的诱导时间等条件下,细菌表达融合蛋白的情况,探索最佳的诱导表达条件,使VP１蛋白的表达达到最高量.结果提示VP１融合蛋白能在大肠杆菌BL２１中稳定表达,其最佳条件是,阳性克隆菌过夜后,增菌３－４小时开始诱导表达,IPTG 浓度０．５mM,于３７℃ 诱导５小时.我们还对诱导表达后的细菌进行了超声破碎,并分别对上清和沉淀进行了SDS－PAGE,结果提示在沉淀和上清中均有VP１融合蛋白的表达,主要在沉淀中,提示VP１蛋白主要表达在包涵体中.因此,下一步进行纯化时,首先要制备包涵体,再对包涵体进行纯化.
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论文作者:陈彩平 张国成 汪萍 杨欣伟
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年9月供稿
论文发表时间:2016/3/1
标签：蛋白论文; 诱导论文; 载体论文; 电泳论文; 质粒论文; 基因论文; 细小论文; 《中国综合临床》2015年9月供稿论文;