刘永军[1]2004年在《小麦盐胁迫应答基因的分离克隆及转基因烟草表达模式研究》文中研究指明土壤盐渍化是十分严重的农业问题。多数农作物的耐盐能力相对较低，因而培育耐盐能力相对提高的作物品种已成为植物分子育种工程的目标之一。分离与鉴定植物耐盐基因对耐盐育种起着十分重要的作用。植物的耐盐性是一个受多基因调控的数量遗传性状。近年来，人们更加重视结构基因产物(如运输蛋白、离子通道、溶质合成相关酶等)以及这些产物所起的调控作用。 植物基因组非常庞大，在遗传背景不很清楚的情况下，要从其中找出需要的目的基因实非易事。然而，随着近年来生物化学、酶学、分子生物学等学科的迅速进展，为目的基因的分离提供了有效手段。mRNA差别显示反转录PCR(mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction)技术，简称DDRT-PCR，尤为引人注目。mRNA差别显示技术的建立为研究耐盐基因在不同组织、不同器官、不同环境条件以及不同发育时期的差异表达提供了可能，为植物耐盐分子机理研究提供了很多有价值的实验结果。目前这一研究技术也已广泛应用于抗性基因如抗旱、耐低温和抗病特性的分子机理研究中。 本研究以宝丰7228~r小麦幼苗叶片为材料，利用DDRT-PCR技术对正常条件下与盐胁迫条件下小麦叶片基因表达的差异进行分析，以期找到有价值的耐盐相关基因。从1.0％NaCl处理72h的小麦幼苗叶片提取纯化mRNA，经过锚定引物Oligo(dT)12GC反转录得到cDNA第一链，用10个碱基随机引物进行二次PCR扩增，经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测到27条差异cDNA片段，包括12条诱导表达片段，4条增强片段和11条抑制表达片段。对11条差异较明显的cDNA片段西北大学学位论文进行了克隆。Northem印迹分析结果显示sR0)、sR03、SR口7片段存在明显的胁迫诱导表达特征，即盐胁迫条件下有杂交信号，而无盐胁迫时没有杂交信号。对SROI、SR03、SR07叁个克隆进行了序列测定和同源性对比分析。 GenBa创k/BLAST检索发现，SRO!与己知基因或蛋白没有明显的同源性，推测为未知蛋白;SR口了与单粒麦属肌动蛋白的核昔酸序列一致性达到33%。肌动蛋白(act in)是真核生物细胞中普遍存在的一种重要蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系统，肌动蛋白与肌球蛋白在植物细胞运动中担负重要作用。推测.外刃J对应基因的编码产物通过参与胞质运动使小麦细胞对盐胁迫做出防御性应答扣分刃7片段与植物水孔蛋白中质膜内在蛋白(PIPs)有87%的序列同源性。推测其对应基因的编码产物是一种水孔蛋白或水孔蛋白同源物，其表达是小麦适应盐胁迫的一种积极反应。 进一步对5斤口7片段的生物学信息分析表明，该基因片段含有一个561bp的开放阅读框，编码156个氨基酸残基，起始密码子和终止密码子分别位于55和613位核昔酸，5’端有54个非编码序列，3’端有165个非编码序列，由5万口7编码的蛋白质(SR07)的分子量大小约19639.65，等电点为7.745。跨膜分析表明该蛋白含有2个跨膜区分别位于10一15，25一35位氨基酸残基。此外，还预测了该编码蛋白磷酸化位点并进行了亲水性分析。 为了研究SR口7在植物耐盐性上的作用，根据3’和5’末端片段的序列信息设计SRo7的开放阅读框两侧的基因专一性引物SPI和SPZ，从而得到约56obP的产物，该产物经测序证实为SR07的完整编码序列。将SR07克隆到植物转化载体pCAMBIA中caMV35S启动子下游，构建表达载体pCAMBIA一sR07，利用根癌农杆菌(Agrobacterl’um tumefacien:)质粒介导的遗传转化系统转化烟草 (Nicotiana tabacum)，经筛选后获得3个烟草转化系，分别命名为转化系I、转化系n和转化系m。转基因植株中SR07基因的PCR和Southern杂交结果表明该基因导入了烟草的基因组。 将3个转化系烟草分别用1.0%的NaCI处理24h后，Northem分析结果显示，在不同样品之间RNA量基本一致的条件下，非转基因烟草没有杂交带出现，而在叁个转化系的植株中均出现一条杂交信号强弱不同的特异的杂交带，说明SR口7基因能够正确转录，而转录水平在不同个体之间存在差异，这种差异可能由基因沉默或因植株个体之间在生理活性方面的差异引起。 我们以烟草转化系H作为研究对象，用不同浓度的NaCI处理24h后，进行Northem分析。结果显示，SR07在烟草中的表达明显受到盐的诱导，和未处理相比，表达量明显增强。但是，当盐浓度过高时，表达量反到下降，这可能是由摘要于盐浓度过高，烟草的生长受到抑制或处于停止生长状态，以至于sR口7表达下降或停止。 以烟草转化系11作为研究对象，用1.0%的NaCI分别处理oh，6h，12h，24h，48h后，进行Northem分析。结果显示，在1 .0%的NaCI处理6h内，SR口7的表达就明显增高，至48h的表达未发生明显变化，说明SR口7的表达变化可能只是对盐胁迫的一种适应行为。 进一步研究了SR口7基因的表达在植物盐胁迫和干早胁迫中的作用。NaCI、PEG和甘露醇抗性试验结果表明，SR07基因转化株的抗盐性与对照株相比没有显着性差异(尸>0.05)，而PEG和甘露醇抗性与对照株相比有显着性差异(尸<0.05)，推测SR口7基因表达蛋白可能在植物水分调节方面有重要作用。
王彩香[2]2011年在《小麦抗逆相关基因TaABC1和TaSAP1/2的分离及功能分析》文中研究指明小麦是人类的主要粮食作物,其生产水平受到干旱、盐渍、冷害等非生物逆境的极大限制。发掘利用抗逆基因资源,培育抗逆高产新品种是应对逆境胁迫,提高小麦生产最经济有效的途径,而深入认识小麦抗逆机理是实现这一目标的重要基础。为了揭示小麦抗逆的分子机制,发掘并利用优异抗逆基因资源,本研究以强抗旱小麦品种旱选10号为试验材料,利用抑制性差减杂交建立的小麦幼苗应答水分胁迫cDNA文库,分离到小麦ABC1蛋白激酶基因TaABC1和A20/AN1锌指蛋白基因TaSAP1与TaSAP2,研究其应答逆境胁迫的表达特性,并通过转化模式植物研究它们在抗逆过程中的作用,揭示其在植物适应干旱等非生物胁迫性反应中的功能及作用机理。主要研究结果如下:1.小麦ABC1蛋白激酶基因TaABC1是一个逆境胁迫应答基因,在小麦苗期、拔节期的叶片和根系,以及孕穗期的幼穗中均能表达,TaABC1定位于细胞膜、细胞质和细胞核。在干旱、冷、盐和渗透剂胁迫条件下,过表达TaABC1的转基因烟草和拟南芥植株渗透调节能力和保水能力增强,叶片持绿时间延长,细胞膜稳定性、过氧化物稳态和光系统II的光化学效率提高。与对照相比,转基因植株的抗逆性增强。实时定量PCR分析发现,过量表达TaABC1的转基因拟南芥植株中多种胁迫应答基因上调表达,如DREB1A、DREB2A、RD29A、ABF、KIN1、CBF1、LEA和P5CS,说明该基因在植物应答逆境的遗传调控网络中可能具有重要作用。2.小麦A20/AN1锌指蛋白基因TaSAP1和TaSAP2均具有高等植物A20/AN1锌指蛋白基因重要特征基序,即N端的A20基序和C端的AN1基序。在小麦不同发育时期不同组织中TaSAP1和TaSAP2都有表达,其中在苗期叶片中的表达量均最高,孕穗期幼穗中的表达量最低。TaSAP1和TaSAP2的表达分别受PEG、NaCl、ABA和冷胁迫的诱导。在PEG和NaCl胁迫条件下,TaSAP1与TaSAP2的诱导表达模式相似,但TaSAP1上调表达的强度高于TaSAP2。在ABA处理条件下,TaSAP2的表达趋势与TaSAP1相似,但未出现低于对照的表达时间段,两个基因的上调表达幅度均较小。在冷胁迫条件下,TaSAP1呈现下调表达,而TaSAP2的表达呈缓慢升高的上调表达趋势。在拟南芥原生质体中瞬时表达两个基因,结果显示TaSAP1和TaSAP2均定位于细胞质。3.对转基因拟南芥的分析显示,在逆境胁迫条件下过表达TaSAP1的转基因植株种子萌发率提高,幼苗根长增加,渗透调节能力和细胞膜稳定性增强,叶片相对含水量、持绿性、光化学效率及植株存活率提高,转基因株系比对照具有更强的耐干旱、盐和渗透剂胁迫能力。TaSAP2可有效改善拟南芥植株对干旱和冷胁迫的耐受性,表现为转基因植株在逆境胁迫下的幼苗根长增加,组织保水率、光化学效率及植株存活率提高。4.在转TaSAP1与TaSAP2基因拟南芥中,植物逆境调控网络中的多种重要胁迫应答基因上调表达,例如DREB1B、DREB2A、RD29A、RD29B和ABF3,但ABF4、ICE1和Cor15在逆境胁迫前后的转基因和野生型株系中的表达无显着变化,说明TaSAP1与TaSAP2基因在植物应答逆境的遗传调控网络中有比较重要的作用。5.拟南芥A20/AN1锌指蛋白基因AtSAP2(AT1G51200)与TaSAP1高度相似,其突变体(SAIL_1182_C11)比野生型和转TaSAP1基因株系对干旱胁迫更敏感,在复水之后,植株的恢复程度较低。说明敲除SAP基因增加了植株对干旱胁迫的敏感性,而过表达TaSAP1能够增强植株的耐旱性。综合以上结果,小麦应答逆境胁迫的调节类基因TaABC1、TaSAP1和TaSAP2能够增强转基因拟南芥对干旱、高盐和冷害等逆境胁迫的耐受性。转基因拟南芥植株中多种胁迫应答基因上调表达,说明这3个基因在植物应答逆境的遗传调控网络中可能具有比较重要的作用。
付畅[3]2003年在《酵母盐胁迫应答基因的克隆及表达分析》文中研究表明日益严重的土壤盐渍化使通过遗传工程手段提高植物的耐盐性成为未来环境和农业发展需要迫切优先解决的问题。过去的研究工作在鉴定和分离一些在植物耐盐过程中有潜力的基因方面取得了显着的进展。为了了解盐胁迫应答反应的分子基础，分离到关键的耐盐基因，本研究克隆了盐诱导酵母ESTs和酵母耐盐基因HAL1，并对其表达进行了分析。 以鲁氏酵母菌(Zgoccharomyces.rouxii)菌株AS2.181为实验材料，以盐胁迫处理的鲁氏酵母细胞和未经胁迫处理的酵母细胞构建了抑制性消减杂交文库。运用一种高效的以PCR技术为基础的cDNA消减杂交方法构建了鲁氏酵母的盐胁迫应答差异表达ESTs文库。随机挑取cDNA克隆进行了测序分析和序列同源性比较。在所分析的序列中找到部分序列与数据库中已知的序列有同源性，其中部分序列与已知序列同源性较高，相应的已知序列与耐盐有关。其余同源性较低的序列以及和数据库中的已知序列没有任何同源性的序列可能是与耐盐相关的新序列 本研究还从酿酒酵母菌菌株AS2.375中克隆了酿酒酵母HAL1基因。HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以农杆菌介导的叶圆盘法将HAL1基因转化烟草植株。筛选到的转HAL1基因转化烟草植株的耐盐性明显高于对照。通过比较转HAL1基因烟草植株与转其它耐盐基因烟草植株的耐盐性，发现转HAL1基因烟草植株的耐盐性虽然明显高于对照，但却低于表达渗透调节剂合成酶基因的转基因植株。结果表明，单独转化HAL1基因对烟草植株耐盐性的提高是有限的。HAL1基因可被渗透胁迫诱导表达对Na~+离子外排起重要作用，但对渗透胁迫却无耐性，因而转化HAL1基因的烟草植株对盐性的提高是有限的。渗透胁迫和离子胁迫是盐胁迫是不可忽视的两个重要方面，以HAL1基因和耐渗透胁迫基因的复合基因转化策略极有希望使转基因植物的耐盐性得到大幅度提高。
王伟[4]2016年在《甜橙多胺氧化酶基因克隆及功能鉴定》文中研究说明柑橘是世界上最重要的果树之一,然而各种生物胁迫和非生物胁迫严重影响柑橘产量和质量。多胺是普遍存在于高等植物中的一类低分子量脂肪族阳离子聚合物,其分解代谢在调节胁迫应答中多胺动态平衡中起着重要作用。多胺分解代谢主要由铜胺氧化酶(CuAO)和多胺氧化酶(PAO)催化完成。本研究利用甜橙基因组数据挖掘甜橙CuAO和PAO家族成员,分析其表达模式,最后利用遗传转化及生物化学技术揭示了部分成员的功能。主要结果如下:1.通过搜索比对共得到8个甜橙CuAO候选基因(命名为CsCuAO1-CsCuAO8),分别位于3条染色体上,编码区大小分别从1389 bp到2328bp。等电点和相对分子量预测结果显示甜橙CuAO蛋白等电点范围为6.11-8.77,相对分子量为52.1-82.8 kDa。亲缘关系分析显示CsCuAO基因家族成员可以分为两类。CsCuAO拥有植物CuAO高度保守的33个氨基酸残基,并且含有C端或者N端信号肽序列。组织表达分析发现CsCuAO1-3和CsCuAO5在根、茎、叶和子叶中表达量较高,其它基因表达水平较低。外源腐胺(Put),亚精胺(Spd)和精胺(Spm)诱导CsCuAO基因表达上升。此外,ABA、低温、盐害及渗透胁迫抑制CsCuAO基因(CsCuAO1-2,CsCuAO5,CsCuAO6和CsCuAO8)表达但诱导CsCuAO3和CsCuAO7上调表达。2.比对分析共发现6个甜橙PAO候选基因CsPAO1-CsPAO6。根据亲缘关系可将CsPAO基因分为四类。CsPAO基因在根中表达水平高于茎、叶和子叶中的水平。CsPAO基因表达也受到外源多胺处理的诱导,根据其表达模式推测CsPAO4基因可能参与多胺末端分解代谢而其余CsPAO基因可能参与多胺回复反应代谢。同时在烟草中超表达CsPAO3基因可以显着提高转基因烟草体内Put含量,并且降低Spd和Spm含量,说明该基因确实参与多胺回复反应代谢。另外,CsPAO基因同时受到ABA、低温、盐害和渗透胁迫的诱导,说明其可能参与激素和逆境胁迫应答。分析CsPAO基因启动子序列发现共有203个与激素和胁迫应答相关的顺式作用元件。3.为阐明PAO基因功能,通过遗传转化和生物化学技术分析了CsPAO4在多胺分解代谢和逆境应答中的功能。CsPAO4基因位于质外体中。体外底物催化结合HPLC检测,表明CsPAO4可以催化Spd和Spm并生成二氨基丙烷(Dap),说明该蛋白能够参与多胺末端分解代谢。在烟草中超表达CsPAO4基因,发现转基因植株PAO酶活性显着高于野生型,而Spd和Spm含量显着降低,同时Dap和过氧化氢(H2O2)含量显着上升。盐胁迫下转基因烟草比野生型烟草具有更快的种子发芽速度和更高的发芽率。然而,盐胁迫下转基因植株草营养生长和根系伸长均受到明显抑制,与此同时转基因植株体内积累更多的H2O2并且具有明显的细胞程序性死亡(PCD)现象。而外源加入过氧化氢清除剂(CAT)在一定程度上恢复转基因植株根系生长和营养生长。此外,外源Spm处理抑制转基因幼苗根系生长。
高世庆[5]2007年在《大豆、小麦抗逆相关Gm/TaAREB转录因子基因、启动子克隆及功能鉴定》文中认为干旱、高盐、低温等非生物逆境胁迫严重影响着农作物的产量和品质。植物能够感知、传递胁迫信号，诱导相关功能的基因表达，对逆境作出适应性响应。研究表明：转录因子在传递逆境信号、调控胁迫相关功能基因的表达，提高植物的抗逆性中起着重要的作用(刘强等，2000)。碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)蛋白可以划分为10个亚族：A、B、C、D、E、F、G、H、I、S(Jakoby et al.,2002)。其中，A亚族主要参与ABA、干旱、高盐、氧化胁迫应答反应等，转ABFs基因的拟南芥能够显着增强逆境胁迫耐性(Choi et al.，2000)。本研究以耐盐性较强的大豆(Glycine max L.)品种铁丰8号和耐旱小麦(Triticum aestivum L.)品种小白麦为实验材料，开展了对抗逆相关bZIP转录因子基因及启动子的克隆、功能研究，具体实验结果如下：1、基因克隆及序列比对分析：通过RACE技术从大豆和小麦cDNA中分别克隆到一个新的、抗逆相关bZIP转录因子基因，即：GmAREB(Glycine max ABA Responsive Element Binding protein)和TaAREB(Triticum aestivum ABA Responsive Element Binding protein)。GmAREB、TaAREB与拟南芥ABF2、ABF3和水稻的OsTRAB1具有较高同源性；这两个基因与拟南芥的ABF2、OsTRAB1基因均存在较近的亲缘关系。2、目的基因的表达特性和拷贝数分析：GmAREB和TaAREB基因的表达均受到ABA、干旱、高盐及低温的强烈诱导，其中GmAREB基因在大豆基因组中存在一个拷贝；TaAREB基因在小麦基因组中存在叁个拷贝。组织表达特异性表明：GmAREB和TaAREB基因在大豆和小麦的根、茎、叶中均有表达，表达量的大小为：根＜茎≤叶。3、亚细胞定位分析：采用含有绿色荧光蛋白(GFP)的163-GFP载体与GmAREB、TaAREB基因构建成融合表达载体并转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位。证明GmAREB、TaAREB蛋白位于细胞核内。4、凝胶阻滞及转录激活分析：GmAREB和TaAREB蛋白在体外与正常的ABRE元件能够特异性结合，表明这两个蛋白均具有体外结合特异性；GmAREB和TaAREB基因在酵母体内不具有转录激活活性；然而它们均能够激活拟南芥中一些与胁迫相关下游靶基因的表达，在拟南芥中具有转录激活功能。5、启动子克隆及瞬时表达分析：克隆、获得了Ta/GmAREB基因的启动子序列并发现一些与ABA及胁迫相关的作用元件；将GmAREB基因启动子瞬时表达分析显示：经各种胁迫处理后，愈伤均能够被染成蓝色，说明这些启动子片段中含有一些逆境胁迫响应元件。GUS荧光定量分析发现在-400～-696 bp区段存在一个干旱响应元件，在-696～-944 bp区段存在一个低温响应元件、ABA响应元件和盐响应元件。6、转基因拟南芥抗逆性功能分析：①干旱胁迫处理后野生型存活率仅为5％(3/60)；29A/35S::GmAREB转基因植株分别为58.3％(35/60)和50％(30/60)；29A/35S::TaAREB转基因植株为55％(33/60)和51.7％(31/60)。②盐胁迫处理后，29A/35S::GmAREB转基因植株存活率为53.3％(32/60)和43.3％(26/60)；29A/35S::TaAREB转基因植株为51.7％(31/60)和45％(27/60)。③低温胁迫处理后，29A/35S::GmAREB转基因植株存活率为45％(27/60)和41.7％(25/60)；29A/35S::TaAREB转基因植株为40％(24/60)和36.7％(22/60)。④氧化胁迫处理后，29A/35S::GmAREB转基因植株叶片叶绿素含量分别为10.2 mg/g·FW和7.3mg/g·FW；29A/35S::TaAREB转基因植株为7.5 mg/g·FW和12.6mg/g·FW。上述结果表明：GmAREB和TaAREB转基因拟南芥均增强了对干旱、盐、低温及氧化胁迫耐性。7、转基因烟草的抗逆性功能鉴定：通过对转基因烟草进行逆境胁迫功能分析，证实了GmAREB和TaAREB转基因烟草增强了对干旱、盐、ABA胁迫耐性；保卫细胞气孔观察、气孔开度及蒸腾速率统计分析表明：Gm/TaAREB转基因植株的保卫细胞气孔关闭速度均明显快于对照W38，从而减少了水分的蒸发，提高了对非生物胁迫的抗性。
单雷[6]2004年在《小麦耐盐体细胞杂种盐胁迫应答基因的分离、定位及其耐盐机理研究》文中进行了进一步梳理植物在应对逆境胁迫时,从时间、空间上构成了协调复杂的调控网络。多条信号转导途径参与了盐胁迫信号的应答,激活或抑制的下游效应基因包括与离子转运和重建离子平衡有关的基因、参与渗透保护物质生物合成的基因、与水分胁迫相关的基因和与细胞排毒、抗氧化相关的酶基因等。所有这些基因协调一致地发挥作用,维持植物的正常生长发育。利用不对称体细胞杂交技术可向小麦转移异源植物的耐盐性。本实验室以普通小麦(Triticum aestivum L.)济南177胚性悬浮细胞来源的原生质体为受体,野生耐盐近源植物高冰草(Agropyron elongatum Host Nevski)悬浮细胞系原生质体经紫外线照射后为供体,进行不对称体细胞杂交,在国际上首次获得了体细胞杂种后代株系。经过连续多年的实验室及大田耐盐实验,已筛选出耐盐新品种山融3号,在0. 3%～0. 5%的盐地种植可以高产。为了进一步研究耐盐体细胞杂种新品种山融3号的耐盐机理以及探明其耐盐性的遗传基础,本研究以山融3号和其亲本济南177为实验材料,利用mRNA差异显示技术和RACE技术,分离了两个盐胁迫相关的全长cDNA序列,并对其表达特征进行了分析。本文还利用SSR标记方法,定位了一个耐盐主效基因。主要研究内容及结果总结如下:1、 小麦体细胞杂交新品种山融3号盐胁迫应答cDNA差异表达分析本研究用银染mRNA差异显示技术分析了山融3号和其亲本小麦济南177在盐胁迫前后基因的差异表达情况。从盐胁迫诱导的耐盐体细胞杂种和其亲本小麦中共获得的差异表达cDNA片段106个,其中从根获得的差异片段87个,叶中获得的差异片段仅有19个。表明200mmol/L NaCl胁迫6hr-72hr间在根中差异表达的基因远远大于在叶中差异表达的基因。山东人学博_!:学位论文 通过Reverse Northern杂交筛选,获得了27个阳性片段,它们在盐胁迫下表达增强或受到抑制。从中选出10个候选片段进行序列分析,其中片段~1一1推测的氨基酸序列与过氧化物酶有较高的同源性;片段~j一与根毛缺陷基因邢舰夕有较高同源性:片段~j芍与小麦的多种胁迫下的表达序列均有较高同源性。这叁个片段被选作下一步研究的重点。另外,从本实验结果也可以看出,盐胁迫还调动了蛋白质合成与代谢及其它的细胞排毒和细胞防御因子等方面基因的表达(wrsi-了、4柳wlis一了)。还有一些未知功能的基因还需进一步研究(wrsi一石、7、8和wlis一2)。 推测哪j一了片段编码Classln类过氧化物酶,Northern杂交进一步验证了甲厂￡j一1基因在耐盐品种山融3号的根中受盐诱导,为胁迫早期应答基因。在亲本小麦济南177中未检测到该基因的杂交信号。因此,推测在体细胞杂种的耐盐机制中,过氧化物酶基因的活化和在盐胁迫下的早期表达,对于清除盐胁迫引起的细胞中q一及其他有毒物质的积累有重要作用。2、小麦山融3号盐胁迫应答基因一根毛缺陷基因月砚珍全长cDNA的克隆 根据获得的袱厂‘j一cDNA片段序列设计基因特异性引物,利用5’RACE技术,获得T小麦根毛缺陷3(沼似夕)基因的全长eDNA(GenBank登陆号为AY557340)。该eDNA长2800bp,含有一个编码804个氨基酸残基的开放阅读框。对推导的氨基酸序列的分析表明’,小麦RHD3在蛋白的氨基端含有两个在真核生物中保守的GTP结合基序GXXXXGKS和DXXG。另外,在蛋白的梭基端包含一个18氨基酸残基(FYLAVMFVVFLVGKAI卿)组成的跨膜结构域,通过对水稻、拟南芥菜和酵母该结构域的比对,均无同源性,暗示小麦房舰夕基因有其独特的调控方式。 小麦烈似夕基因在盐胁迫下的山融3号和济南177中,其转录均受到抑制.推测形似夕基因在盐胁迫下的表达下调,可能通过使液泡增大或更新减慢或停止,进一步调控植物细胞的增大,这一过程是植物对盐胁迫适应的结果,并非耐盐的表现。该基因在山融3号和其亲本济南177中具有相同的胁迫应答机制。3、小麦山融3号盐胁迫应答蛋白醉抑制剂相关基因盯泞了一全长cDNA的克隆及表达 分析 根据获得的甲厂sj一cDNA片段序列设计基因特异性引物,利用5’RACE技术,从小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品种山融3号中克隆了两个同源性很高的wrsi一J全长eDNA(wrsi一J一I,GenBank登陆号为AY549888:wrsi一J一2)。这两个eDNA编码由90山东大学博士学位论文个氨基酸残基组成的多肤,序列中含有10个保守的半胧氨酸残基,且在32一87位包含一个保守的BowB结构域,推测wrsi石编码BBI型蛋白酶抑制剂。 Northern杂交分析表明,wrsi一J基因在盐胁迫下的山融3号和济南177的根中表达增强,并且在胁迫12小时时表达量达到最高,其高表达量可持续两天:胁迫72小时表达量开始降低;胁迫96小时时,转录量基本与未胁迫时相同。 原位杂交定位分析表明,在山融3号盐胁迫的根尖成熟区内皮层细胞中有wrsi一J基因的表达,而在亲本小麦济南177根尖的相同部位未检测到杂交信号。众所周知,植物根尖组织的内皮层细胞对于控制根中矿质营养物质的转移和水分吸收具有特殊意义。推测wrsi一万基因在控制山融3号Na+由根尖皮层细胞进入木质部中起重要作用,并且与山融3号叶中保持较低的Na+含量和较高的K7Na+比密切相关。 本文还讨论了盐胁迫导致的根尖皮层细胞程序化死亡
陈婷婷[7]2012年在《紫花苜蓿乙烯应答因子对植物耐盐性影响的研究及MsWRKY56基因的克隆分析》文中研究指明乙烯应答因子是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育各个阶段发挥重要作用,同时还与植物的胁迫应答相关。本研究以拟南芥AP2/ERF结构域为探针搜索美国国立生物信息技术中心的苜蓿属蛋白质数据库,根据获得的氨基酸序列和核苷酸序列设计引物,分离获得了两个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分别命名为MsERF8和MsERF11。为了进一步研究紫花苜蓿转录因子的结构与功能,通过电子克隆结合实验克隆的方法分离获得了紫花苜蓿WRKY转录因子基因家族成员MsWRKY56的cDNA序列,并进行了生物信息学分析。研究结果如下：1.MsERF8基因的开放阅读框为603bp,编码201个氨基酸,MsERF11基因的开放阅读框为804bp,编码268个氨基酸；生物信息学分析结果表明MsERF8和MsERF11的等电点分别为6.91和7.74,相对分子量分别为22.88kDa和29.05kDa；两个蛋白都包含大量亲水性区域和大量无规卷曲和α螺旋结构；系统进化分析结果表明这两个蛋白都属于ERF亚家族。2.以紫花苜蓿DNA为模板,通过PCR扩增获得MsERF8和MsERFll基因的DNA序列,将其与cDNA序列进行比对后发现这两个基因都不包含内含子。通过热不对称交错PCR技术分别获得位于MsERF8和MsERF11基因转录起始位点上游1032bp和906bp的序列。顺式作用元件分析结果表明MsERF8基因启动子中包含乙烯应答元件ERE、干旱诱导的MYB结合元件MBS、赤霉素应答相关的元件TATC-box等顺式作用元件,MsERFll基因启动子中包含脱落酸应答元件ABRE、茉莉酸甲酯应答元件和大量光应答元件。3.通过半定量RT-PCR结合实时定量PCR的方法研究MsERF8和iMsERF11基因的组织表达差异性和不同处理条件下的表达特性,结果表明,MsERF8基因在叶和根中的表达量高于花、花蕾和茎；MsERFll基因在叶中的表达量高于茎和花,在根和花蕾中的表达量较低；两个基因都能被NaCl、PEG6000和A12(SO4)3,以及多种激素诱导,其中生长素能诱导MsERFll基因的表达,但是对MsERF8基因的表达没有影响。构建目的基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法研究MsERF8和MsERF11基因编码产物的亚细胞定位情况,结果表明两个基因编码的蛋白都定位于细胞核。4.构建植物表达载体,将MsERF8基因导入烟草,MsERF11基因导入拟南芥中,对转基因植株的耐盐性进行分析,结果表明,在盐胁迫下,转基因烟草和拟南芥种子的发芽率、植株的相对水含量显着高于野生型植株(P<0.05),而丙二醛含量显着低于野生型植株(P<0.05)；盐胁迫条件下转基因烟草植株的游离脯氨酸含量显着高于野生型植株(P<0.05),转基因拟南芥植株的生长比野生型植株受到的抑制轻,表明转基因烟草和拟南芥的耐盐性高于野生型植株。5. MsWRKY56基因的cDNA序列长1267bp,包含一个951bp的最大开放阅读框,编码317个氨基酸；生物信息学分析结果表明,该基因编码蛋白的等电点为8.53,相对分子量为35.4kDa,大部分区域表现为亲水性,包含大量α螺旋和折叠结构,不包含信号肽,定位于细胞核中。本研究的结果为研究紫花苜蓿AP2/ERF转录因子和WRKY转录因子的结构和功能奠定了基础,同时也为通过转基因技术选育耐盐植物新品种提供了两个重要的候选基因,具有重要的理论和应用价值。
黄骥[8]2005年在《水稻非生物胁迫相关锌指蛋白基因的克隆与功能分析》文中认为高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长发育和作物高产的重要限制因素。很多研究集中于分离和鉴定在各种非生物胁迫下增强表达的基因，并期望通过了解这些基因运作的分子机制进而利用这些基因进行基因工程改良，帮助植物抵御各类非生物胁迫，而转录因子在植物的胁迫应答中发挥了至关重要的作用，在植物的基因工程改良中也得到了人们的重视。迄今为止，人们已经在多种植物中分离了大量的非生物胁迫相关转录因子基因，其编码产物几乎囊括了转录因子的各种类型。其中AP2／EREBP转录因子中的DREB亚家族在植物胁迫应答反应中占据着核心地位。 锌指蛋白是一类具有指状结构域的转录因子，主要通过与DNA、RNA的结合或与其它蛋白质的相互作用调控目的基因的表达。锌指蛋白广泛的分布于人类和动植物中。根据锌指蛋白的结构特征和功能差异又可将锌指蛋白分为TFⅢA家族、WRKY家族、GATA家族、DOF家族、PHD家族等。随着基因组测序计划的不断完成，也有越来越多的具有锌指结构的锌指蛋白基因被发现。本文主要是针对锌指蛋白在植物非生物胁迫反应的作用为研究方向，分离了3类胁迫相关的锌指蛋白基因，取得了以下一些研究进展。 首次从单子叶植物水稻中分离了TFⅢA型胁迫相关锌指蛋白基因ZFP18、ZFP245。表达分析表明ZFP18受低温、干旱、高盐和ABA的诱导，而ZFP245仅受低温和干旱的诱导。将ZFP18的启动子融合GUS报告基因转化烟草植株，组织化学检测表明正常生长条件下ZFP18的启动子在烟草幼苗的根、茎以及叶片中都无法检测到GUS报告基因的表达，在NaCl和KCl处理条件下转基因烟草叶盘中GUS高度表达，此外在NaCl处理的根的维管束中也检测到了报告基因的表达，但在其它处理条件下(4℃、20％PEG6000)以及二价阳离子胁迫(Mg~(2+)，Zn~(2+)，Cd~(2+))下没有检测到GUS的活性，推测单双子叶中以ZFP18参与的植物对单价阳离子胁迫的响应途径可能类似，但对渗透胁迫的响应可能有所不同。获得了ZFP245过量表达的烟草转基因植株，取转基因植株的叶盘进行耐逆性检测，结果表明转基因植株叶盘提高了对400mM NaCl以及20％PEF6000的耐受性。综合研究结果表明ZFP18和ZFP245在植物的非生物胁迫应答反应中发挥重要的调控作用，说明单子叶植物中也存在TFⅢA型锌指蛋白参与的环境胁迫信号传导途径。 从水稻中分离了受多种胁迫负调节的锌指蛋白基因SRZ1。SRZ1的表达受低温、干旱、高盐以及ABA的负调控。序列分析和同源建模表明SRZ1可能是RNA结合蛋白。组织表达分析表明SRZ1在检测的根、茎、叶片中组成型表达，而SRZ2在叶片中高丰度表达，在根和穗中的表达量较低。表达分析表明，SRZ1、SRZ2受低温、干
陈良[9]2011年在《油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究》文中进行了进一步梳理油菜是重要的油料作物,种子的含油量占其干重的35%-45%。菜油也是非常好的食用油,含有丰富的脂肪酸。菜油也是重要的工业原料,是我国发展生物柴油的理想的原料来源之一。因此大力发展油菜,提高油菜含油量,不仅能为我国能源安全战略作出重要贡献,还将有助于保障我国的粮食安全,促进农民增收,具有十分重要的战略意义。然而,油菜经常受到高盐、干旱、低温和营养缺乏(如低磷、低钾)等不良非生物胁迫的严重破坏,造成油菜产量严重下降。通过基因工程手段将一些具有抗逆功能的基因导入植物基因组进而获得抗逆新品种,这为传统育种模式的改革带来了新的契机。与拟南芥、水稻等传统模式植物相比,油菜中抗逆基因的鉴定和抗逆机制的研究还比较少。因此,筛选和鉴定油菜中与抗逆相关的基因,分析揭示其抗逆分子机制,可以为通过基因工程手段来改良油菜抗逆性提供了新的科学依据。本研究采用Macroarray技术,从油菜cDNA文库中筛选了参与高盐、干旱胁迫应答的基因,并对一些感兴趣的目标基因进行了深入的研究。主要结果如下：1.通过Macroarray技术从油菜cDNA文库中筛选鉴定参与高盐、干旱胁迫应答的基因采用Macroarray技术,从油菜cDNA文库中共筛选得到313个参与盐胁迫应答的基因(172个受到高盐胁迫的诱导,141受到高盐胁迫的抑制表达)；477个参与干旱胁迫应答的基因(288个受到干旱胁迫的诱导,189个受到干旱胁迫的抑制表达)；154个基因受到高盐和干旱两种胁迫的双重诱导；104个基因受到高盐和干旱两种胁迫的抑制表达。这也说明高盐胁迫和干旱胁迫之间存在着共同的调控系统或信号交叉。2.高盐干旱胁迫应答基因的表达模式分析从上述胁迫诱导表达的候选基因中选取了13个基因做进一步的研究。这些基因编码的蛋白分属于六个蛋白家族：蛋白激酶家族(MAPKKK和CIPK)、金属硫蛋白家族、生长素应答或抑制蛋白家族、脂类转运蛋白、直接和胁迫相关的蛋白、代谢酶类。实时定量RT-PCR分析了这13个基因在盐胁迫、干旱胁迫的表达模式,同时也分析了6个基因在ABA处理下的表达模式。结果如下：13个基因中,有7个基因的表达受到盐胁迫的诱导；12个基因的表达受到甘露醇(模拟干旱胁迫)的诱导,其中包括6个受盐胁迫诱导的基因；进一步的研究揭示5个受干旱胁迫诱导的基因也受ABA的显着诱导。这些结果进一步表明干旱和高盐胁迫信号、干旱与ABA信号通路之间存在着交叉。组织表达分析结果显示,这13个基因可能在油菜的不同组织器官发育中也发挥着重要的作用。3.冷调节基因BnCOR25的表达分析及功能鉴定我们从候选的288个干旱诱导的基因中,鉴定了一个新型的编码冷调节蛋白的基因,该基因编码蛋白的分子量为25KD,因此我们将其命名为BnCOR25 (GeneBank号为HM187577)。实时定量RT-PCR结果显示BnCOR25基因主要在下胚轴、子叶、茎和花中表达,但是在根和叶子中表达量较低。Northern杂交证实BnCOR25基因的表达受到干旱和冷胁迫的显着诱导。研究结果还揭示BnCOR25基因的表达是受ABA信号通路调节的。BnCOR25蛋白主要定位于细胞膜上和细胞质中。过量表达BnCOR25基因增强了裂殖酵母细胞在冷胁迫下的存活率；过量表达BnCOR25的转基因拟南芥增强了对冷胁迫的耐受性。这些结果暗示该基因可能在赋予植物对冷胁迫耐受性中起一定的作用。4. BnCIPK6基因的表达鉴定和启动子活性分析在154个受干旱和高盐胁迫诱导的候选基因中,其中有一个基因编码的蛋白和拟南芥CIPK蛋白激酶家族的成员CIPK6有很高的同源性,因而被命名为BnCIPK6。BnCIPK6基因的表达受到高盐胁迫、渗透胁迫、低磷胁迫、ABA和BL的显着诱导。组织表达分析结果显示,BnCIPK6基因主要在花中表达,在子叶中适度表达,而在其它组织中表达水平较低。我们分离得到了约850bp长度的BnCIPK6启动子片段,组织化学染色分析揭示12天苗龄的拟南芥小苗,下胚轴和子叶中均有很强的GUS信号,而在其它组织中很弱或者检测不到GUS信号；胁迫处理分析揭示BnCIPK6基因的启动子是受高盐、渗透胁迫、ABA和BL诱导的。5. BnCIPK6互作蛋白的筛选及鉴定酵母双杂交结果显示BnCIPK6可以与拟南芥的CBL1,CBL2, CBL3和CBL9发生相互作用。将BnCIPK6蛋白作为诱饵蛋白筛选油菜cDNA文库,得到27种与其相互作用蛋白,这些互作蛋白涉及到植物生长发育、代谢及信号转导等多个方面。其中包括两个CBL蛋白,分别与AtCBL1和AtCBL3蛋白同源,我们将和AtCBL1同源性较高的油菜CBL蛋白,命名为BnCBL1, BiFC实验也证明了BnCIPK6和BnCBLl蛋白在体内的相互作用。6. BnCIPK6和BnCBL1蛋白的亚细胞定位及BnCIPK、BnCIPK6T182D蛋白的体外磷酸化分析亚细胞定位研究显示BnCIPK6蛋白在细胞膜、细胞质及细胞核中均有分布,而BnCBL1蛋白定位于细胞膜上。体外激酶磷酸化分析揭示点突变的BnCIPK6T182D蛋白-BnCIPK6(M),相对BnCIPK6蛋白自磷酸化能力更强,表明182位的苏氨酸残基是蛋白激活的关键位点。7. BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1过量表达转基因拟南芥均显着增强了对盐胁迫、低磷胁迫的耐受性为研究BnCIPK6及BnCBLl基因的功能,我们分别构建了BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBLl过量表达载体并转化了拟南芥,筛选获得转基因植株。分别选取这些外源基因在拟南芥中表达量较高的纯合株系做表型分析及功能研究。结果显示BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1转基因拟南芥均显着增强了对盐胁迫、低磷胁迫的耐受性。结果说明BnCBL1-BnCIPK6可能通过功能性的相互作用来参与植物对高盐、低磷胁迫的应答。8. BnCIPK6和BnCIPK6(M)的过量表达转基因拟南芥增强了对ABA的敏感性我们分析了转基因植株对ABA的应答,结果显示BnCIPK6和BnCIPK6(M)的过量表达转基因拟南芥均增强了对ABA的敏感性,尤其是后者显示出了对ABA的超敏性。ABA相关的Marker基因包括RD29A, ABF3, ABF4在ABA处理后的BnCIPK6(M)的转基因拟南芥中的表达量显着升高。而我们并未观察到过量表达BnCBLl的转基因拟南芥对ABA应答的改变。上述结果表明BnCIPK6参与了对ABA的应答,而BnCBL1没有参与ABA的应答,暗示可能存在和BnCIPK6相互作用的其它CBL蛋白,参与并介导了对ABA的应答。9. BnCIPK6(M)的过量表达转基因拟南芥植株对BR应答改变,且提高了对BR合成抑制剂BRZ的敏感性BnCIPK6(M)过量表达转基因植株改变了对油菜素内酯(BR)的应答,提高了对BRZ的敏感性。而我们并未观察到BnCIPK6和BnCBLl过量表达转基因拟南芥对BR应答表型的改变。这说明激活形式的BnCIPK6可能参与了BR的信号,同样暗示可能存在和BnCIPK6相互作用的其它CBL蛋白,参与并介导了对BR的应答。10.拟南芥cipk6功能缺失突变体减弱了对ABA的应答、对盐胁迫和低磷胁迫更加敏感对拟南芥cipk6功能缺失突变体的研究发现,cipk6突变体对盐胁迫和低磷胁迫更加敏感,对ABA的敏感性下降,这也说明AtCIPK6基因参与了对盐、低磷胁迫及ABA的应答。
罗聪[10]2012年在《芒果SCoT分子标记与逆境和重要开花时间相关基因研究》文中研究说明芒果是重要的热带水果之一,有“热带水果之王”的美誉。我国芒果种植历史悠久,种质资源丰富且品种繁多,其中许多芒果品种来源于实生选种,亲缘关系不明。长期以来我国芒果主栽品种、国外引进芒果品种以及地方特有芒果品种之间的遗传多样性和亲缘关系还不够清楚,给芒果种质资源的收集、保护和利用带来了诸多不利。近年来由于全球气候变化,导致非生物胁迫经常发生,而芒果对非生物胁迫比较敏感,非生物胁迫严重影响芒果的品质与产量。在提高芒果产量的同时又要保障经济效益,对芒果进行产期调节是增加芒果经济效益的有效途径。四季芒成花不需要低温,具有周年自然成花的特性,是目前进行芒果产期调节的最适宜品种。而关于四季芒成花的分子机理还未见报道。基于上述原因,本研究将率先采用新型目标性状SCoT分子标记对芒果进行遗传多样性和亲缘关系分析,改良cDNA-SCoT技术并首次应用于芒果逆境胁迫差异显示研究,克隆四季芒重要开花时间基因,并对其生物信息学、表达模式和功能进行研究。主要研究结果如下：1、首次运用SCoT分子标记对芒果遗传多样性进行研究。开发了44条新的SCoT引物,使SCoT分子标记引物总数达到80条。开展了芒果SCoT分子标记和ISSR分子标记比较研究,结果显示SCoT分子标记扩增多态性百分比高于ISSR分子标记,SCoT分子标记的聚类结果比ISSR分子标记更能准确反映研究样品之间的亲缘关系,不同地域来源的芒果品种能按照其起源聚类。证明SCoT分子标记在芒果遗传多样性和亲缘关系研究中是一种非常有效的分子标记。2、改良cDNA-SCoT技术并首次应用于芒果逆境胁迫差异显示研究。在cDNA的3’末端加锚定引物,利用SCoT分子标记引物结合3’末端锚定引物对cDNA进行扩增,可以保证扩增片段是功能基因,改良的cDNA-SCoT技术方法操作简单、实验成本低廉且节省时间。用37条SCoT分子标记引物结合3’末端加尾锚定引物对逆境胁迫处理和对照芒果样品进行差异显示研究,成功获得92个基因片段,其中与逆境胁迫、转录因子、生长发育和信号传导相关的基因共有40个。3、改良5’末端RACE技术克隆芒果逆境相关基因的全长。采用新的逆转录引物,增加cDNA产物和接头引物浓度,延长加尾时间,简化操作步骤,结合巢式PCR和降落PCR获得了一种操作简单、快速、高效、成本低廉的改良5’末端RACE方法。利用改良的5’末端RACE技术对cDNA-SCoT获得的芒果逆境相关基因的5’末端进行调取,成功获得40个芒果逆境相关基因的全长序列。4、芒果逆境胁迫相关基因表达模式分析。从40个逆境相关基因中选取6个逆境功能基因、6个转录因子和4个保护酶基因,利用实时荧光定量技术进行表达模式分析,低温、NaCl和PEG处理均能调控这些基因的表达,不同基因在同一逆境胁迫下的表达模式存在差异,在这叁类基因中,转录因子对逆境胁迫的响应最明显。5、芒果重要逆境基因Harpin基因研究。利用cDNA-SCoT技术和5’末端RACE技术获得芒果Harpin基因全长。Harpin基因全长为1019bp,开放阅读框长666bp,编码222个氨基酸,与其它病原菌的hrp基因无同源性。芒果Harpin基因在各个组织中均表达,并随着果实发育,其表达水平持续上升；低温、NaCl、PEG、铅、镉和锌可诱导该基因表达；果实采后不同处理也诱导该基因表达。芒果Harpin基因转化烟草,其T0代植株高度比对照高,开花时间早于对照,并引起花形态发生变异；用NaCl、Pb(NO3)2和ZnSO4处理转Harpin基因烟草,T0代植株表型与对照差异不明显。芒果Harpin基因功能还需要进一步对T1和T2转基因植株进行研究才能确定。6、利用同源克隆法、染色体步移法或改良5'RACE法,从芒果中获得了LFY,CO、SOC1、FT和TFL1共5个开花时间基因的序列全长,并对这些基因的生物信息学、表达模式及其功能进行研究。基因生物信息学分析：LFY基因基因全长为1332bp,其中开放阅读框长1149bp,编码383个氨基酸,存在一个FLO_LFY superfamily结构域；LFY基因的启动子区域包含多个逆境和光响应元件,同时还存在ABA、GA、CTK、IAA和蔗糖响应元件。CO基因开放阅读框长为966bp,编码322个氨基酸,存在两个B-box锌子结构域和一个CCT结构域,属于第一类CO基因家族,与拟南芥COL4基因最相似。SOC1基因开放阅读框长为669bp,编码223个氨基酸,存在一个MADS结构域和一个K-box结构域,属于MADS-box基因家族,不同物种的SOC1基因编码氨基酸数差异很小FT基因开放阅读框长为588bp,编码196个氨基酸,存在一个PEBP结构域,属于FT/TFL1基因家族的FT-like类基因,但其编码氨基酸数明显多于其它FT/TFL1基因。TFL1基因开放阅读框长为516bp,编码172个氨基酸,也存在一个PEBP结构域,属于第一类FT,TFL1基因家族的TFL1-like类基因。基因表达模式分析：LFY和CO基因在营养组织和生殖组织中均表达,而SOCl基因主要在营养组织中表达。LFY、CO、SOC1、FT和TFL1基因在紫花芒和四季芒的成熟叶、成熟茎和嫩茎中的表达模式既类似又存在明显差异,在芒果花芽分化期的10月-12月份之间这些基因都具有较高的表达水平,在来年的3月-6月份之间还存在另外一个小的表达高峰；但在同一时间不同组织、同一组织不同时间以及不同芒果品种之间表达高峰出现的时间以及表达水平都存在差异；进一步分析显示,芒果开花时间基因之间也存在网络调控。基因功能研究：分别构建了LFY、CO、SOC1、FT和TFL1基因的正义和反义表达载体,并转化烟草。不同转基因烟草插入拷贝数存在差异,并且芒果基因在转基因烟草中正常表达。分别转LFY+、CO+、FT-和TFL1-基因的烟草,转基因T0代株高低于对照的株高,而分别转LFY-、CO-、SOC-、FT+和TFLl+基因的烟草,其T0代株高比对照烟草的株高高,SOC+转基因株高与对照差异不明显。在本研究中,这些芒果开花时间基因转化烟草后,转基因引起烟草花形态发生变异,但T0代转基因烟草开花时间未能达到预想效果,其功能还需要进一步验证。
参考文献：
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[5]. 大豆、小麦抗逆相关Gm/TaAREB转录因子基因、启动子克隆及功能鉴定[D]. 高世庆. 中国农业科学院. 2007
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[7]. 紫花苜蓿乙烯应答因子对植物耐盐性影响的研究及MsWRKY56基因的克隆分析[D]. 陈婷婷. 四川农业大学. 2012
[8]. 水稻非生物胁迫相关锌指蛋白基因的克隆与功能分析[D]. 黄骥. 南京农业大学. 2005
[9]. 油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究[D]. 陈良. 华中师范大学. 2011
[10]. 芒果SCoT分子标记与逆境和重要开花时间相关基因研究[D]. 罗聪. 广西大学. 2012