姜润德[1]2003年在《人鼻咽癌顺铂耐药细胞系（CNE-2/CDDP）的建立及耐药相关基因的筛选》文中进行了进一步梳理鼻咽癌是中国南部及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，该地区鼻咽癌的发病率最高可达50／10万，死亡率占全部恶性肿瘤的2.81％。与其它恶性肿瘤相比，它具有以下几个方面的显着特点：(1)具有非常明确的地理分布；(2)与EB病毒的感染有特殊的相关关系；(3)绝大多数鼻咽癌属未分化或低分化癌，恶性程度高，浸润生长快，极易发生癌细胞的远处转移和局部治疗的不彻底。在临床上化疗是鼻咽癌最主要的辅助治疗手段，然而癌细胞耐药性的产生常常引起药物治疗的失败。因此体外建立鼻咽癌耐药细胞系，筛查鼻咽癌耐药相关基因，从基因组DNA水平和基因表达水平寻找在耐药产生中具有关键作用的分子改变，对于全面了解肿瘤细胞的耐药机制，寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的理论和现实意义。 肿瘤细胞耐药产生的机制从化疗用于肿瘤的治疗之初便开始受到了广泛的研究。人们很早就认识到肿瘤细胞具有多药耐药现象，肿瘤的多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)指的是肿瘤细胞在接触某一种化疗药物后，不仅对此种药物产生耐受性，而且对其它的结构和功能不同的多种药物也产生交叉耐受性。多药耐药是恶性肿瘤难治和复发的重要原因之一，客观地讲，其本质是肿瘤细胞在生存压力之下建立起来的一种适应过程。肿瘤细胞可以通过多种机制产生MDR，其中细胞膜上表达药物排流泵、通过泵机制把药物从细胞内排出细胞外是其最主要的耐药方式。其它尚包括细胞解毒能力的增强、DNA修复能力的增强、药物靶蛋白如拓扑异构酶量或活性的改变、蛋白激酶C各种同工酶活性和表达水平的改变等。然而迄今以这些分子作为靶点的耐药逆转研究仍存在着许多难以克服的问题。肿瘤耐药是否还存在其它的分子机制?另外，由于鼻咽癌发生的特殊性和其独特的生物学特点，鼻咽癌细胞耐药的产生是否也具有特殊性? 本研究首先用鼻咽癌药物敏感细胞CNE-2作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系。在此基础上，用改良的消减杂交方法筛选鼻咽癌耐药相关基因，用比较基因组杂交技术研究耐药细胞在基因组DNA水平上可能存在的异常扩增和缺失，以此探讨与鼻咽癌耐药性产生有关的分子机制。博士学位论文:鼻咽癌耐药细胞系(CNE一2/CDDP)的建立及耐药相关基因的筛选研究主要包括叁个部分的内容:一人鼻咽癌顺铂耐药细胞系(CNE一2/C DDP)的建立 以鼻咽癌低分化细胞系CNE一2为研究对象，以鼻咽癌一线化疗药物顺铂 (CDDP)为诱导剂，采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法，诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系CNE一2/CDDP。耐药指标的检测包括MTT法测定耐药细胞和其亲本细胞对不同药物的敏感性，流式细胞术测定细胞内荧光药物罗丹明的蓄积，细胞生长曲线和倍增时间的测定及细胞的形态学观察。结果:所建立的人鼻咽癌耐药细胞系CNE一2/CDDP对CDDP的耐药指数为27.9，对5一氟尿嗜睫(5一FU)及长春新碱(VCR)的耐药指数分别可达227.9和55.5，表明其具有多药耐药的特性。流式细胞术测定显示细胞被荧光药物罗丹明作用后，CNE一2/CDDP的细胞内罗丹明荧光强度显着低于CNE一细胞(1 2.98/243.62)，说明耐药细胞能有效地把细胞内药物排出细胞外。CNE一2/CDDP的细胞倍增时间也明显延长 (26h/19h)。在形态学上，CNE一2/CDDP细胞较CNE一2细胞表现为体积减少，形态变圆，在培养瓶中易形成克隆集聚现象。 结论:本研究建立了稳定的人鼻咽癌耐药细胞系CNE一2/CDDP，为进一步研究恶性肿瘤耐药性产生的机理建立了理想的耐药细胞模型。二.用改良的消减杂交方法克隆鼻咽癌耐药相关基因 在建立鼻咽癌耐药细胞系的基础上，采用基于PCR技术的改良的消减杂交方法筛选并克隆鼻咽癌耐药相关基因。对获得的系列差异表达片段连接T一easy载体，转化入JM109菌株，建立消减文库。并对差异表达的基因片段进行一系列鉴定:质粒的酶切鉴定、反向点杂交鉴定、RT一PCR鉴定和Northern b10t鉴定。对经过鉴定的基因进一步做DNA序列测定并利用NCBI的GenBank数据库(http://w ww. nCbi·nlm.nih.gov)对其进行比较分析，以初步了解差异表达基因的性质并分析其在鼻咽癌耐药性产生中可能的作用机理。结果共发现了6个在耐药细胞中差异表达的基因片段，其中3个为耐药细胞所高表达，3个在耐药细胞中表达下调。高表达的序列中有一个是功能未知的恶性肿瘤相关基因，有完整的开放读框，其编码产物是含有79个氨基酸的DC13蛋白。其余两个序列分别与泛素C基因和线粒体编码基因NADH脱氢酶亚单位2(ND2)有同源性。在耐药细胞中表达受到抑制的基因序列分别与细胞色素氧化酶亚单位1(COXI)、核糖体蛋白大亚基27单体(RPL27)以及核糖体蛋白小亚基27单体(RPS27)基因有同源性。博士学位论文:鼻咽癌耐药细胞系(CNE一2/CDDP)的建立及耐药相关基因的筛选 由于改良的消减杂交法所克隆的基因片段从理论上讲应该是表达产物mRNA的全长，因此，所克隆的cDNA如果有完整的开放读框(ORF)，该序列就有可能包含完整的cDNA。本研究所克隆的6个基因片段经分析其中5个有完整的ORF，推测有可能代表不同的基因表达产物。为此对该
唐叁元[2]2012年在《鼻咽癌顺铂耐药细胞系的建立及耐药蛋白质组学研究》文中研究表明研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方最常见的恶性肿瘤之一,绝大多数NPC分化差,恶性程度高,易早期发生颈淋巴结和远处转移。目前,鼻咽癌的临床治疗主要以放疗和化疗为主,5年生存率约50%-70%之间。中晚期NPC临床疗效差,再加上在鼻咽癌治疗过程中往往会出现多药耐药性(multi-drug resistance, MDR),而导致化疗失败。因此,研究鼻咽癌耐药的分子机制很有必要。MDR是指恶性肿瘤细胞在接触一种抗癌药后,产生了对多种结构不同、作用机制各异的其他抗癌药的耐药性。MDR是恶性肿瘤化疗失败和复发的重要原因之一,涉及到多种复杂的分子机制,其中,以多药耐药相关蛋白(multi-drug resistance protein, MRP)在抗癌药物耐药中所起的作用备受重视。比较耐药肿瘤细胞与其对应的亲本肿瘤细胞之间差异表达的蛋白质,可以发现与耐药相关的蛋白质,为筛选肿瘤耐药的分子标志物及肿瘤耐药的靶向治疗提供了新的研究方向。第一章鼻咽癌顺铂耐药细胞系的建立目的：本研究通过顺铂(cis-Diammine-Dichloro-Platinum, cDDP)浓度递增法建立了鼻咽癌耐药的细胞株CNE2/cDDP,并研究其生物学行为。方法：采用cDDP浓度递增法,经过3个月左右的时间建立了鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/cDDP,倒置显微镜进行形态学观察,MTT检测不同细胞系的耐药性。结果：MTT实验研究发现在不同药物(顺铂、长春新碱、卡铂、紫杉醇、5-FU)作用下,CNE2/cDDP较CNE2的IC50值及耐药指数均有明显的增加,CNE2/cDDP细胞对顺铂的耐药性最强,增加到200.6倍,对5-Fu的耐药性最差,增加到2.8倍；耐药细胞株CNE2/cDDP较非耐药细胞株CNE2生长速度减慢,其细胞倍增时间由18小时增加到24小时；CNE2/cDDP细胞体积较CNE2为小,常呈克隆聚集现象。结论：CNE2/cDDP不光对顺铂具有耐药性,对其他化疗药物也具有不同的耐药性,即具有MDR,并且该细胞系性状稳定,可稳定地传代和保存,是一个理想的用于鼻咽癌的多药耐药研究的细胞系,为下一步蛋白质组学研究提供了基础。第二章鼻咽癌顺铂耐药细胞系的耐药蛋白质组学研究及耐药关键蛋白功能研究目的：本研究通过蛋白质组学方法分离鉴定鼻咽癌耐药细胞系的差异表达蛋白,并对其中的关键蛋白keratin1进行功能研究,以揭示keratin1在鼻咽癌耐药中的作用。方法：采用2-DE+MALDI-TOF-MS进行鉴定,获得了鼻咽癌顺铂耐药的差异表达谱；并对其中的叁个关键耐药蛋白(KRT1,CTSD,ANXA5)表达水平进行western blot验证;通过siRNA干扰KRT1表达后,观察KRT1与鼻咽癌耐药性的关系。结果：蛋白质组学方法获得了鼻咽癌细胞株CNE2与其顺铂耐药细胞株CNE2/cDDP的差异蛋白表达谱,并鉴定了其中的17个差异表达蛋白,包括：角蛋白1,角蛋白18,膜联蛋白A5,组织蛋白酶D, cDNA FLJ52723, NME2(转移抑制蛋白),3,2-反式-烯酰辅酶A异构酶,组蛋白2B,热休克蛋白p-1,3-羟氨基-辅酶a脱氢酶-2,丙酮酸硫转移酶,谷氨酸脱氢酶1,内质网转运ATPase, α-烯醇酶,热休克蛋白90a,NADH脱氢酶,核内核糖体蛋白C1/C2等。这些蛋白功能涉及到：细胞骨架,基因组稳定,分子伴侣,代谢相关酶,转运相关信号通路,蛋白合成和转移相关信号通路等。其中叁个蛋白KRT1,CTSD, ANXA5在耐药细胞株中CNE2/cDDP中的表达水平均明显上调,与蛋白质组学鉴定的结果是一致的,说明蛋白质组学方法鉴定获得的差异蛋白表达谱是可靠的;keratin1在CNE2/cDDP中表达高于CNE2, siRNA下调keratin1表达后,可以显着性减少鼻咽癌细胞株对五种化疗药物的IC50值,增加鼻咽癌细胞对化疗药物的敏感性；当siRNA下调keratin1表达后,多药耐药蛋白(MRP)的表达也下调,说明keratin1表达与MRP表达具有相关性；keratin1表达下调引起鼻咽癌细胞中MRP表达下调,从而引起鼻咽癌细胞的耐药性降低。结论：1.2-DE结合质谱获得了鼻咽癌顺铂耐药的差异蛋白表达谱；2.获得了17个与鼻咽癌顺铂耐药有关的差异表达蛋白,这些蛋白功能涉及到细胞骨架、基因组稳定、分子伴侣、代谢相关酶、转运相关信号通路、蛋白合成和转移相关信号通路等；3.KRT1,CTSD,ANXA5经验证与鼻咽癌顺铂耐药有关；4. KRT1表达下调可导致鼻咽癌细胞株对顺铂、长春新碱、卡铂、紫杉醇、5-FU的耐药性减低；降低KRT1可导致化疗药物的耐药性降低；5.鼻咽癌顺铂耐药的分子机制可能与KRT1通过下调MRP表达有关。
参考文献：
[1]. 人鼻咽癌顺铂耐药细胞系（CNE-2/CDDP）的建立及耐药相关基因的筛选[D]. 姜润德. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[2]. 鼻咽癌顺铂耐药细胞系的建立及耐药蛋白质组学研究[D]. 唐叁元. 中南大学. 2012
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