（1.衡阳市中心医院骨科；2.南华大学附一医院神经内科 湖南衡阳 421001）
摘要：目的 高温依赖蛋白HtrA的克隆表达，为进一步研究其结构与功能奠定基础。方法 构建重组质粒pGEX-6P-1/HtrA，经PCR、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌E.coli BL21中。结果 构建了重组质粒pGEX-6P-1/HtrA，并在E.coli BL21菌中高效表达出相应分子量的GST-HtrA目的蛋白，表达了相对分子量（Mr）与预测分子量相近的可溶性蛋白。重组蛋白经GST树脂成功纯化。结论 成功克隆表达了HtrA蛋白，为进一步研究其结构与功能奠定了基础。
关键词：鹦鹉热嗜衣原体；克隆；表达
衣原体肺炎（chlamydia pneumonia，Cpn）是一种主要的人类呼吸道病病原体[1]，专性细胞内寄生，具有独特的发育周期，包含形态和生物学特性不同2种发育状态：原体（EB）和始体（RB）[2]。现代治疗和预防性药物设计的关键是选择合适的药物靶点。Zhong等[3]明确指出，作为一种胞内寄生菌，衣原体要进入无吞噬功能的宿主细胞，并维持在宿主细胞包涵体内的正常生长，形成发育周期，调控宿主细胞基因的转录与翻译，必须要分泌效应蛋白与宿主细胞相互作用，相互调节[4]。因此，寻找新的Cpn和宿主细胞相互作用的关键效应蛋白作为设计防治性药物的靶点是医学基础研究攻关的重点。本实验将克隆表达预测的分泌效应蛋白HTRA蛋白，为进一步研究其结构与功能奠定基础。
1材料和方法
1.1 材料 pGEX6p-1质粒，E.coliBL21菌株，THP-1细胞株：均为中南大学所保存。AxyPrep PCR试剂盒（AXYGEN）、GST纯化树脂（默克Novagen）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司）Tag酶、T4连接酶、BamHⅠ、NotⅠ限制性内切酶（美国Promega公司）。
1.2方法
1.2.1 原核表达载体pGEX-6p-1/HtrA的构建与鉴定 根据编码基因的碱基序列，以Cpn 6BC基因组为模板，设计扩增引物。，并分别引入BamHⅠ、Not
I酶切位点，设计引物，上游：ccggaattcatggcaatttctggaaacagc3'，下游：5' ttttccttttgcggccgc ttaatctcccgaatctatatcc 3'，引物由武汉Invitrogen公司合成。反应体系为：总体积50μL，其中ddH2O39.6 μL、10×pfu buffer 5 μL、10mol/L、dNTPmix 1 μL、P1 1 μL、P2 1 μL、DNA Polymerase（5 U）0.4 μL、Cpn template 2 μL混匀后点离。循环参数：94℃预变性5 min后，进入94℃变性30 s，52℃退火45 s，72℃ 延伸60 s，共计30次，末次循环后72℃延伸10 min，终止反应。扩增产物用10 g/L（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测，采用Axygen公司的AxyPrep PCR试剂盒对PCR产物进行纯化。纯化回收后亚克隆到原核达载体pGEX-6p-2上，pGEX-6p-2/Cpn0585重组质粒被转化入E.coli BL21中，经PCR筛选，双酶切和测序（武汉Invitrogen公司）鉴定。
1.2.3 重组蛋白的表达、纯化和鉴定 按《分子克隆实验指南》第3版所述方法，用IPTG诱导表达重组蛋白，并反复优化表达条件诱导表达可溶性蛋白。然后用GST纯化树脂按说明书进行纯化。10%SDS-PAGE分析蛋白质的表达形式及纯度；在核酸蛋白分析仪上，采用A280紫外分光光度法测定蛋白质浓度。纯化产物用Cpn6BC多克隆抗体行 Western blot 鉴定。
2.结果
2.1 HtrA基因的PCR扩增 PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳结果（图1），在相应位置可见清晰的特异性条带（图2），与预期片段大小相符。
图2 重组蛋白纯化的SDS –PAGE结果
Fig.2 SDS-PAGE of purified HtrA Proteins
1.Marker 2. HtrA
3.讨论
本研究选择的表达菌E.coli BL21是常用的表达菌株，一般配合以强表达载体pGEX载体来进行目的基因的强表达。由于BL21菌株缺失Lon和OmpT蛋白酶产物，这可以降低宿主细胞内蛋白酶降解的影响。此外还可以帮助提高完整可溶性蛋白的产率。为高效表达可溶性GST融合蛋白提供良好条件。
我们用PCR法从基因组模板中扩增出目的片段，经测序证实与基因库登陆的核苷酸序列一致，将目的基因亚克隆到原核表达载体构建了表达重组体pGEX6p-1/ HtrA，并成功转化至E.coli BL21。重组蛋白可以充分结合在默克Novagen的GST纯化树脂柱上，经纯化得到高纯度的目的蛋白。本研究还对重组融合蛋白进行了透析处理，蛋白透析可降低谷光甘肽（GST）的浓度，因而进一步优化了本研究的条件。
参考文献
[1] Knittler M R，Berndt A，Bocker S P，et al. Chlamydia psittaci：new insights into genomic diversity，clinical pathology，host-pathogen interaction and anti-bacterial immunity [J]. Med Microbiol，2014，304：877-893.
[2] He?QZ，Zeng?HC，Huang?Y，et al.The?type?III?secretion?system（T3SS）ofChlamydophila psittaci?is?involved?in?the?host?inflammatory?response by? activatingthe?JNK/ERK?signaling?pathway[J].?Biomed?Res?Int，2015，2015：652416.
[3] Lu C，Peng B，Li Z，et al.Induction of protective immunity against Chlamydia muridarum intravaginal infection with the chlamydial immunodominant antigen macrophage infectivity potentiator. Microbes Infect，2013，15（4）：329-338.
[4] Lu C，Holland MJ，Gong S，et al.Genome-wide identification of Chlamydia trachomatis antigens associated with trachomatous trichiasis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53（6）：2551-2559.
资助项目：2017衡阳市科学技术发展计划项目（项目编号：2017KJ201）
论文作者:陈威1（通讯作者）,王燕2
论文发表刊物:《航空军医》2019年4期
论文发表时间:2019/6/6
标签：蛋白论文; 宿主论文; 目的论文; 质粒论文; 衣原体论文; 可溶性论文; 引物论文; 《航空军医》2019年4期论文;