黄琛[1]2002年在《幽门螺杆菌CagA蛋白肽段的基因克隆和表达》文中进行了进一步梳理目的：通过对幽门螺杆菌CagA蛋白肽段的基因克隆和表达，确定CagA蛋白中与相应抗体亲和力最强的肽段，为制备幽门螺杆菌高毒株感染血清学诊断试剂盒奠定基础。 方法：根据幽门螺杆菌cagA全基因序列以DNAMAN软件设计五对引物，采用PCR方法扩增出五条幽门螺杆菌cagA基因片段。采用碱裂解法提取原核表达载体质粒pGEX-3X，并对其进行单酶切。将PCR扩增产物插入至原核表达载体pGEX-3X中，采用氯化钙转化法将连接产物转化至大肠杆菌Top10中，形成五种重组质粒。先通过氨苄平板初步筛选，再采用PCR方法筛选转化阳性的质粒，最后通过核酸限制性内切酶酶切及测序确定其连接方向。经筛选为阳性的重组质粒以1mMol／L的IPTG诱导表达，预测所表达的CagA蛋白肽段分子大小分别为66KD、29KD、36KD、99KD和63KD，并以包涵体的形式存在。包涵体经8Mol／L尿素初步纯化后，运用ELISA方法检测其抗原性并确定相应抗体亲和力最强的CagA蛋白肽段。 结果：五条cagA基因片段在大肠杆菌中都得到了表达，表达的蛋白均具有强弱不等的抗原性，其中66KD的蛋白肽段与抗CagA抗体亲和力最强。 结论：66KD的蛋白肽段与抗CagA抗体亲和力最强
黄琛, 佘菲菲, 陈月秀[2]2003年在《幽门螺杆菌CagA蛋白肽段的基因克隆、表达及抗原性检测》文中研究指明目的 克隆幽门螺杆菌 Cag A蛋白肽段的基因 ,确定 Cag A蛋白与相应抗体亲和力最强的肽段。 方法 根据幽门螺杆菌 cag A全基因序列以 DNAMAN软件设计 5对引物 ,采用 PCR方法扩增出 5条幽门螺杆菌cag A基因片段。将 PCR扩增产物插入原核表达载体 p GEX- 3X并转化至大肠杆菌 Top10中 ,形成 5种重组质粒。经 PCR、双酶切和测序鉴定后 ,以异丙硫半乳糖苷 (IPTG)诱导其表达 Cag A蛋白肽段。包涵体经 8mol/ L 尿素初步纯化后 ,运用 EL ISA方法检测其抗原性并确定相应抗体亲和力最强的 Cag A蛋白肽段。 结果 5条 cag A基因片段在大肠杆菌中都得到了表达 ,表达的蛋白均具有强弱不等的抗原性 ,其中 6 6 k D的蛋白肽段与抗 Cag A抗体亲和力最强。 结论 6 6 k D的蛋白肽段与抗 Cag A抗体亲和力最强
张静, 陈月秀, 佘菲菲[3]2005年在《幽门螺杆菌cagAM1′基因表达抗原的纯化及应用》文中研究表明目的克隆cagAM1′基因,以其表达的蛋白为抗原,通过血清学方法检测幽门螺杆菌(Hp)cagA阳性菌株的感染。方法以既往克隆的cagAM1基因为模板设计引物,PCR扩增681bpcagAM1′基因,将其定向连接入载体pET-42a(+),转化宿主菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达。可溶部分的表达产物用GST·Tag方法纯化。以该纯化抗原经WesternBlot方法,检测39份Hp培养阳性(其中28份cagA基因阳性,11份阴性)及17份无Hp感染患者的血清,以鉴定抗原检测的敏感性和特异性。同时用进口试剂盒进行对照实验。结果获得62kD的CagAM1′与GST融合蛋白,以此为抗原,28株cagA阳性患者的血清26份检出抗cagA抗体,表明cagAM1′蛋白具有抗原性,且该抗原检测相应抗体的敏感性为92.9%,高于进口试剂盒(71.4%),17份无Hp感染患者的血清14份抗cagA抗体阴性,表明该抗原检测相应抗体的特异性为82.4%,高于进口试剂盒(52.9%)。结论cagAM1′蛋白有望进一步开发用于临床Hp高毒株感染诊断。
佘菲菲, 李妮, 林旭, 陈豪[4]2009年在《幽门螺杆菌oipA基因片段的克隆表达及抗原性分析》文中研究表明目的:分片段克隆表达幽门螺杆菌oipA基因,确定抗原性最强的重组蛋白肽段。方法:从Hp国际标准株NCTC11637中获取oipA全长基因,克隆至pGEM-T载体并鉴定正确,以重组pGEM-T/oipA为模板PCR扩增6个不同大小的oipA基因片段,与表达载体pET-42a连接,转化大肠杆菌BL-21,重组子经PCR、酶切、测序鉴定。IPTG诱导重组蛋白肽段的表达,经Western Breeze化学发光法鉴定融合蛋白;优化诱导时间和IPTG浓度,诱导重组蛋白大量表达;Ni-NTA His·Bind树脂亲和纯化表达产物;羊抗Hp多克隆抗体,Western blot法检测纯化蛋白的抗原性,间接ELISA法筛选抗原性最强的重组肽段。结果:6条oipA基因片段在大肠杆菌中都得到了表达,表达的蛋白肽段均可被抗Hp多克隆抗体识别,具有抗原性,其中反应性最强的是最小的蛋白肽段。结论:oipA基因片段可在原核系统中表达,所获取的最小的肽段抗原性最强,可望制备检测血清相应抗体的试剂盒。
李海波[5]2013年在《基于多亚单位Th表位的幽门螺杆菌疫苗的研究》文中提出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)在全球人口中的感染率超过50%，已被确定为慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病菌，并被世界卫生组织列为胃癌的Ⅰ类致癌因子。表位是抗原分子中决定抗原特异性的关键部分，合理组合优势表位，可诱导出比原始抗原更为高效和特异的免疫应答。H. pylori感染导致机体对H. pylori自身天然抗原产生免疫耐受，选择H. pylori保护性抗原的优势表位来构建表位疫苗，有可能打破免疫耐受，从而达到免疫预防和清除H. pylori感染的目的。前期研究证实，特异性CD4+T细胞应答在抗H. pylori感染的保护性免疫应答中至关重要。本研究通过构建H. pylori Th表位疫苗，采用先免疫后攻毒以及先感染后治疗两种方式，在动物模型上对疫苗的预防和清除的保护效果进行评价，并探讨相应的免疫应答机制。主要研究方法、结果和结论如下：1.幽门螺杆菌Th表位的筛选和疫苗的设计通过生物信息学的方法预测并筛选H. pylori保护性抗原HpaA、CagA和UreB的优势Th表位，共筛选到17个表位肽。动力学模拟考察不同表位连接顺序所构成蛋白的动力学和热力学稳定型，确定以HpaA表位-CagA表位-UreB表位的连接顺序来构建Th表位疫苗Epivac。2.幽门螺杆菌Th表位疫苗的构建、表达和纯化构建疫苗蛋白的原核表达质粒pET30a-epivac，转化至BL21(DE3)，经诱导表达和纯化，获得目的蛋白Epivac，HPLC分析蛋白纯度在90%以上。相同的技术方法制备含分子内佐剂的疫苗蛋白LTB-epivac。3.幽门螺杆菌Th表位疫苗的免疫保护效果评价及应答分析1)幽门螺杆菌Th表位疫苗免疫预防效果的评价及应答分析采用鼻腔滴注和皮下注射两种免疫途径，Epivac联用不同佐剂对BALB/c小鼠进行免疫，评价疫苗的免疫预防效果。结果显示，单用疫苗以及联用佐剂都可以有效预防H. pylori感染，且联用佐剂效果更优。此外，鼻腔滴注发挥保护作用的时间点要早于皮下注射。ELISA检测特异性抗体IgG、IgA的产生；Real-time RT PCR和ELISA检测脾淋巴细胞和胃组织细胞因子的表达变化；流式细胞术定量检测抗原特异性CD4+T细胞的水平及其应答特征。结果提示疫苗的保护作用与抗体应答无关，而主要依赖于疫苗诱导的系统性和局部的Th1型CD4+T细胞应答。2)幽门螺杆菌Th表位疫苗免疫清除效果的评价及应答分析：利用BALB/c小鼠模型对表位疫苗的免疫清除效果进行评价。相对于未免疫组，疫苗免疫可以显着降低小鼠胃内H. pylori的定植量，具有一定的治疗效果。通过分析小鼠抗体应答的特征，推测疫苗的免疫清除作用可能与特异性Th1型细胞应答密切相关。4.幽门螺杆菌Th表位疫苗的初步安全性评价通过内毒素检测、急性毒性试验和豚鼠最大化试验对疫苗的安全性进行初步评价，结果显示疫苗内毒素低于限量，且鼻腔滴注和皮下注射两种给药方式不会引起机体损伤和过敏反应，初步说明疫苗是安全无毒的。
黄志刚, 段广才, 唐焕文, 胡利人, 杜进林[6]2010年在《幽门螺杆菌cagA基因影响胃粘膜上皮细胞肿瘤相关蛋白表达》文中提出目的筛选和鉴定与幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关基因A(cagA)有关的宿主细胞肿瘤相关蛋白。方法用幽门螺杆菌野生株和cagA基因敲除株分别与胃粘膜上皮细胞Ges-1共培养10h(细菌与细胞的比例为100:1),提取2组细胞总蛋白,进行等电聚焦和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,比较2组细胞蛋白质表达谱差异,选取差异蛋白点进行质谱分析鉴定。结果经肽质量指纹图(PMFs)检索分析鉴定,与cagA基因敲除株比对,幽门螺杆菌野生株攻击后的胃粘膜上皮细胞Ges-1总蛋白中的磷酸丙糖异构酶、膜联蛋白A1和α-烯醇酶(2个相邻位点)4个差异蛋白点均呈高表达,质谱评分依次为:325,254,395,347;肽段匹配率分别为:95%,79%,77%,76%。结论 3种差异表达的蛋白均与幽门螺杆菌cagA基因有关,属于胃粘膜上皮细胞肿瘤相关蛋白。
陈雄, 徐灿霞, 王芬, 沈守荣, 贾燕[7]2010年在《幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定》文中指出目的:合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法:选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-Ca-gA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果:设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列(AF289435)基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论:本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。
袁小澎[8]2004年在《幽门螺杆菌多亚单位融合疫苗的实验研究》文中研究说明目的： 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种全世界范围的人类感染病原菌，对人类健康构成严重危害。本研究拟通过生物信息学方法和体外尿素酶活性中和试验筛选稳定的能够替代全长尿素酶B(UreB)亚单位的活性片段，在此基础上将片段与另外两个已确定的Hp保护抗原成分热休克蛋白A(HspA)、鞭毛粘附素蛋白A(npak)构建融合基因。通过不同表达系统得到多亚单位的蛋白和基因疫苗，分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用，为揭示Hp潜在的保护性机制以及新型多亚单位Hp疫苗的研制提供理论和实验依据。 方法： 1．通过生物信息学方法对尿素酶B亚单位蛋白亲水性、抗原性和结构功能域等进行分析，结合尿素酶B亚单位蛋白的叁级结构X射线衍射图，依据尿素酶B亚单位蛋白功能、结构稳定性，选择能够替代全长亚单位的活性片段。 2．采用PCR方法从HpCQ9803基因组中扩增目的片段基因(UreB414)并构建到原核表达载体pET-28a(+)，通过酶切、测序鉴定阳性重组子。将阳性重组子转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，Tris-trcine PAGE及免疫印迹确定目的蛋白表达。Antheprot V 5.0软件分析蛋白性质，AKTA纯化仪纯化融合蛋白。将纯化片段免疫家兔制备高免血清，对免疫后血清通过体外尿素酶中和试验检验片段的生物学活性。 3．http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk蛋白linker库中选择合适的蛋白linker，采用重迭延伸的方法，以HspA为融合蛋白前端，将HspA、HpaA及UreB活性片段依次串联，酶切及测序鉴定连接结果，NcoI、XhoI双酶切将融合基因构建到原核表达载体中。SDS-PAGE电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白表达，软件分析融合蛋白理化特性，通过包涵体洗涤，纯化条件摸索，AKTA纯化仪纯化融合蛋白。 4．将160只小鼠随机分为4组：融合蛋白组(HspA-HpaA-UreB414)、叁亚单位物理混合组(HspA+HpaA+UreB)、单一尿素酶组(UreB)和PBS对照组。以LT无毒突变体为佐剂，分别于O、7、14、28天免疫接种，剂量为150μg／只／次。末次免疫后10天，每组取10只小鼠剖杀取样，ELISA检测口服免疫后血清特异IgG、IgA、IgGl、IgG2a，第叁军医大学博士学位论文粪便、胃肠道冲洗液slgA，EISp0T法检测小肠Pp结19卉^sc、xgG一^se数目，盯一PeR检测脾脏淋巴细胞IL一4，正N一Y水平。每组余下30只口服10scFu Hp动物适应株，30天后通过Hp培养、快速尿素酶试验、涂片及特异性PCR检测小鼠胃部标本并计算口服免疫后各组攻毒保护率。 5，将融合基因构建到真核表达载体pCDNA3.1(+)，酶切及测序鉴定得到阳性重组子。磷酸钙法将阳性重组子转染COS一7细胞，RT一PCR方法确定了融合基因在细胞中的表达。40只BALB/c小鼠，随机分为2组，大量抽提质粒，分别以空质粒载体和阳性重组子质粒，按照O、21、42天各一次，每次100林g/.q/次胫前肌注射的方案免疫接种小鼠，在末次免疫后30天依前法检测免疫后血液、胃肠道冲洗液标本指标及攻毒保护率。 结果: 1.选择了从UreB蛋白中5’端251位氨基酸到389位氨基酸的138个氨基酸为目的片段UreB414，该片段含有己确定的CHHLDKSIKEDV12肤的尿素酶活性相关位点。 2.成功构建目的片段的表达载体pET一28a-UreB414，目的片段分子量约为巧.SKD，包涵体鉴定试验证实为可溶形式表达，纯化后得到>90%纯度的目的蛋白，.蛋白免疫家兔后产生的抗体在体外能够中和尿素酶活性。 3.成功构建了包含HsPA、HpaA、UreB414叁个Hp保护性亚单位的融合基因，不同基因组分之间以R场甲PP6氨基酸linker的相应碱基连接，该U川沈r为非螺旋刚性蛋白linker。 4.得到融合蛋白表达载体phhu，表达的融合蛋白具有叁个亚单位蛋白各自的免疫反应性，分子量约为43.9KD。UVP扫描证实融合蛋白表达约占总蛋白的26%。包涵体鉴定试验证实融合蛋白以包涵体形式表达，确定了采用亲和层析、离子交换层析相结合的纯化方法。纯化后得到纯度>85%的融合蛋白。 5.融合蛋白组血清IgG、IgA，粪便，胃肠道冲洗液slgA水平，肠道PP结IgA一Asc、IgG一AsC细胞数量与PBs组相比，升高明显，差异非常显着(P<0 .001)，与叁个亚单位蛋白物理混合组相比，无明显差别(P>0.05)，血清IgGI、IgGZa，脾脏淋巴细胞体外Hp刺激后IL一4，正N一Y的水平都明显增高。融合蛋白组、叁个亚单位物理混合组和单一蛋白组小鼠的攻毒保护率分别为89.6%、72.3%和65.5%。 6.转染后融合基因能够在细胞中的表达。与空质粒免疫对照组相比，融合基因免疫组小鼠血清IgG、IgA显着升高(P<0.001)，粪便，胃肠道粘液slgA未见升高，血清IgG以IgGZa升高为主。动物攻毒保护率为88.75%。 结论:第叁军医大学博士学位论文 1.通过理论预测及尿素酶体外中和试验实验得到性质稳定能够替代全长尿素酶B亚单位的活性片段UreB414。 2.重组融合蛋白经口服免疫后激发的为一种Thl、Th:平衡的免疫应答模式小鼠免疫应答，攻毒保护试验取得89.6%的保护率。融合蛋白组小鼠的攻毒保护率显着高于单一蛋白组(P二0.0283)。 3.Hp多亚单位融合基因DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，诱导产生一种以Th;为主?
龙敏[9]2007年在《幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的致病与免疫机理探讨》文中研究指明幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是微需氧革兰氏阴性螺杆菌。1983年，澳大利亚科学家J Robin Warren和Barry J Marshall首先发现了幽门螺杆菌，并且证实慢性胃炎和消化性溃疡是由Hp感染所致，他们因为这一卓越的发现荣膺2005年诺贝尔生理学医学奖。幽门螺杆菌是世界范围内感染率最高的病原菌，全球人口感染率超过50％，它是慢性胃炎和消化性溃疡的罪魁祸首，并与胃腺癌、胃粘膜相关性淋巴样组织淋巴瘤(gastric mucosal-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT)的发生密切相关，1994年被世界卫生组织确定为Ⅰ类致癌物。怎样有效控制Hp感染，一直是国内外学者关注的一大难题。幽门螺杆菌的定植，伴随着胃粘膜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的浸润，细菌诱导的免疫反应不仅不能阻止细菌的定植，相反导致慢性胃部炎症，粘膜损伤程度与中性粒细胞浸润程度密切相关。幽门螺杆菌两种主要的毒力因子是空泡毒素(vacuolating cytotoxin A，VacA)和中性粒细胞激活蛋白(HP neutrophil-activiting protein，HP-NAP)。中性粒细胞激活蛋白HP-NAP由napA基因编码，分子量150kDa，是由4螺旋结构单体构成的十二聚体蛋白，对中性粒细胞、单核细胞有趋化作用，导致中性粒细胞浸润胃粘膜，并诱导中性粒细胞NADPH氧化酶激活，产生活性氧中间产物ROI(reactive oxygen intermediates，ROI)，引起粘膜炎症和组织损伤。此外，HP-NAP能诱导中性白细胞和单核细胞表达β2整合素，以介导白细胞的粘附及吞噬作用，并介导免疫细胞间及免疫细胞与上皮细胞间的粘附作用；HP-NAP还能促进单核细胞中组织因子合成和2型纤维蛋白溶酶原激活抑制分子的分泌；HP-NAP通过MAPK途径激活中性粒细胞并激活肥大细胞脱颗粒和释放前炎症细胞因子IL-6；该蛋白中空可储存铁，其结构类似大肠杆菌DNA结合蛋白Dps。最近研究发现，HP-NAP能促进Th1免疫反应，在感染位点形成以IL-12、IL6、IL8、TNF-a增高的Th1型细胞因子环境，影响感染的结局。HP-NAP抗原性强，大多数HP感染病人产生NAP抗体，用HP-NAP免疫小鼠能保护机体抵抗Hp的感染，保护率80％。表明HP-NAP可作为Hp多成分疫苗的候选抗原。在HP-NAP的致病机理研究方面，由于它能激活中性粒细胞产生活性氧中间产物ROI，ROI能直接攻击DNA而具致突变作用，提示ROI可能是致突变因子，与Hp相关性胃癌的发生有关。目前，人们对HP-NAP与Hp相关性胃癌之间的关系知之甚少，弄清它们之间的关系对Hp相关性胃癌的诊断和治疗具有十分重要的意义。已知HP水溶性粗提物可上调中性粒细胞CXC趋化因子IL-8基因和生长相关癌基因GROa的mRNA和蛋白表达，IL-8是致炎症因子，GROa促进新生血管生成，与癌症的产生有关。NAP是否通过上调胃上皮细胞IL-8和GROa的表达发挥其致炎症和致肿瘤作用，目前尚不清楚。在Hp感染的治疗方面，目前国内外常用叁联药物(如铋剂+甲硝唑+抗生素)治疗慢性胃炎和消化性溃疡。但是，Hp容易产生耐药性，导致抗生素治疗失效。如果Hp未能根除，多达75-80％的患者很快又旧病复发。有学者认为，病人口腔中存在Hp，可源源不断地向胃内供应病菌，是导致感染复发的另一重要原因。此外，抗生素可引起菌群失调等毒副作用。鉴于抗生素疗法不甚理想，疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。目前Hp苗研究的热点主要集中在尿素酶(Ure)、毒力因子CagA、VacA和热休克蛋白60(HSP60)等亚单位保护性抗原上。但尿素酶难以诱导出全面而稳定的保护性免疫应答；CagA和VacA变异较大；HSP60和人体自身蛋白有比较高的同源性，用HSP60免疫小鼠只能获得局部保护性免疫应答，并且会导致小鼠肠胃炎，其作为疫苗的安全性和有效性尚需进一步验证。因此，迫切需要寻找新的合适的Hp疫苗候选抗原，深入探讨其免疫机理，为Hp疫苗的发展提供理论基础。多项实验证明，HP-NAP是疫苗研究的重要候选抗原，在HP-NAP抗原表位的研究方面，国内外尚未见报道。在本项研究中，我们首先构建了原核表达系统，体外克隆和表达了幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白HP-NAP。在此基础上，应用生物信息学、分子生物学、免疫学和生物化学等方法和技术着重从以下叁个方面对HP-NAP的致病和免疫机理进行了初步的探讨。一、幽门螺杆菌NAP抗体水平与胃癌的相关性及致病机理初探应用PCR技术检测了Hp临床菌株中napA基因存在状况；应用重组的NAP蛋白，采用ELISA方法检测82例胃癌患者血清中NAP抗体含量，并与慢性胃炎和消化性溃疡、正常人群血清中NAP抗体含量进行比较，同时分析NAP抗体产生与患者年龄的关系。本研究还采用不同浓度的HP-NAP刺激SGC7901胃上皮细胞，测定细胞上清液中IL-8和癌细胞生长因子GRO-α浓度的变化，对HP-NAP与胃上皮细胞的相互作用进行了初步探讨。实验结果发现：所有Hp临床菌株中都存在napA基因，正常人血清中NAP抗体阳性率为42.6％，而HPIgG抗体的阳性率为55％，与我国人群中Hp感染率相似。HP-NAP抗体的阳性率略低于HPIgG抗体的结果表明，虽然所有Hp临床菌株均存在napA基因，但不同菌株NAP蛋白的表达有差异，与文献报道一致。胃癌患者血清HP-NAP抗体阳性率为97.5％，高于胃溃疡92.9％和慢性胃炎患者85.7％的抗体阳性率；胃癌患者NAP抗体水平显着性高于胃炎患者，但与胃溃疡患者无差异，表明NAP蛋白与胃癌的发生有一定相关性，NAP可能是胃癌发生的危险因子。NAP抗体水平与患者年龄无明显相关性。而且，NAP仅有轻微的刺激SGC7901胃上皮细胞株产生IL-8的作用，不能刺激SGC7901细胞产生GRO-α，说明NAP对胃上皮细胞的直接刺激作用十分有限，它主要通过激活中性粒细胞发挥其致炎症或致肿瘤的作用。二、HP-NAP单克隆抗体的制备、鉴定及临床意义以天然的Hp全菌蛋白为抗原制备单克隆抗体，并用原核表达的重组HP-NAP蛋白鉴定筛选针对HP-NAP的抗体，对获得的3株抗体进行亚类鉴定、效价、特异性、临床应用等鉴定，结果获得3株抗NAP蛋白的单抗，在Westernblot实验中，能与相应的重组蛋白发生反应。抗NAP单抗与其它肠道杆菌无交叉反应。免疫组化鉴定发现，3株NAP单抗能与Hp临床菌株发生反应；E019单抗可以与Hp感染胃癌患者胃粘膜上的Hp特异性结合。在单抗鉴定过程中，我们建立了用抗HP-NAP单克隆抗体检测胃活检标本的免疫组化方法，可以用来比较胃炎、胃溃疡和胃癌患者NAP蛋白的阳性率，进一步探讨NAP蛋白与胃癌的相关性。在免疫组化实验中，我们发现HP-NAP单克隆抗体E019与HP感染胃癌组织发生强阳性反应，但与胃炎组织的反应较弱，不显色或微弱显色，尚需加大例数作进一步探讨。而且，通过制备NAP单抗，可以建立更加特异和简便的诊断方法，用于Hp感染的诊断和预后的判断。还可应用鉴定出的NAP单抗作为靶分子，利用噬菌体肽库技术筛选NAP具有免疫原性的抗原表位，用于Hp多表位疫苗的研究。叁、NAP生物信息学分析和B细胞抗原表位作图首先，应用生物信息学技术，对HP-NAP的叁维结构和napA基因的ORF进行了分析，由Linux操作系统预测的叁维结构显示有多个a螺旋，提示HP-NAP中存在跨膜结构，该蛋白是外膜蛋白；DNAMAN对napA基因的ORF分析显示，它有两个正向ORF和一个反向ORF，表明napA有许多不同的转录产物。接下来，依据HP-NAP的氨基酸序列，用DNAstar和EMBOSS在二级结构预测、亲水性和抗原性指数分析的基础上，进行B细胞抗原表位预测，发现有4个高抗原性肽段位于4-24，55-77，95-103和118-140氨基酸处，平均抗原性指数为1.0236，位于55-77氨基酸抗原性指数高达1.15并含有一个β转角。然后，用抗HP-NAP单克隆抗体E019作为靶分子，对噬菌体随机7肽库分别进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，对获得的阳性噬菌体克隆进行筛选和鉴定，从筛选得到的阳性克隆菌株提取单链DNA，进行测序和分析，获得模拟的B细胞表位，结果获得3个模拟的B细胞表位XVXFXKV，LXHXPXX和XQKSHTV，分别位于14-20，60-66及131-137氨基酸处。而且，肽库筛选获得的抗原表位分别位于预测的4-24，55-77，118-140氨基酸处的高抗原性肽段中。结果说明生物信息学是蛋白质抗原分析的良好工具，抗原表位能通过噬菌体展示肽库筛选而获得。本研究为Hp感染的免疫蛋白组学研究及疫苗研究提供了重要的信息。
胡平, 罗军, 张文炳, 龙北国[10]2007年在《幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析》文中指出目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。
参考文献：
[1]. 幽门螺杆菌CagA蛋白肽段的基因克隆和表达[D]. 黄琛. 福建医科大学. 2002
[2]. 幽门螺杆菌CagA蛋白肽段的基因克隆、表达及抗原性检测[J]. 黄琛, 佘菲菲, 陈月秀. 福建医科大学学报. 2003
[3]. 幽门螺杆菌cagAM1′基因表达抗原的纯化及应用[J]. 张静, 陈月秀, 佘菲菲. 中国人兽共患病杂志. 2005
[4]. 幽门螺杆菌oipA基因片段的克隆表达及抗原性分析[J]. 佘菲菲, 李妮, 林旭, 陈豪. 中国免疫学杂志. 2009
[5]. 基于多亚单位Th表位的幽门螺杆菌疫苗的研究[D]. 李海波. 第叁军医大学. 2013
[6]. 幽门螺杆菌cagA基因影响胃粘膜上皮细胞肿瘤相关蛋白表达[J]. 黄志刚, 段广才, 唐焕文, 胡利人, 杜进林. 中国公共卫生. 2010
[7]. 幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定[J]. 陈雄, 徐灿霞, 王芬, 沈守荣, 贾燕. 中南大学学报(医学版). 2010
[8]. 幽门螺杆菌多亚单位融合疫苗的实验研究[D]. 袁小澎. 第叁军医大学. 2004
[9]. 幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的致病与免疫机理探讨[D]. 龙敏. 第一军医大学. 2007
[10]. 幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析[J]. 胡平, 罗军, 张文炳, 龙北国. 热带医学杂志. 2007
标签：基础医学论文; 幽门螺杆菌论文; 融合蛋白论文; 抗原表位论文; 抗原抗体反应论文; 血清蛋白论文; 抗原抗体论文; 基因合成论文; 基因克隆论文; 融合基因论文; 蛋白质纯化论文; 尿素酶论文; igg抗体论文;