杨宾侠[1]2003年在《双苯氟嗪对大鼠脑缺血再灌注保护作用和机制研究》文中研究说明双苯氟嗪（dipfluzine，Dip）是我校药学院首创设计合成的一个新型的桂利嗪类衍生物，已采用生理、生化及形态学多项技术，在大鼠全脑缺血模型从不同角度证明Dip对缺血性脑损伤有明显的保护作用，且此种保护作用与其选择性扩张血管、增加脑血流、改善脑缺血能量代谢、降低缺血脑兴奋性氨基酸浓度及阻滞钙通道有关。鉴于溶栓疗法目前已被临床首选治疗脑梗塞病人，细胞凋亡已被认作缺血再灌注脑损伤，特别是迟发性神经元死亡的主要形式，本研究拟在大鼠中动脉缺血再灌注模型，以细胞凋亡和自由基产生作为主要评价指标，进一步观察双苯氟嗪对脑缺血再灌注所致脑损伤有无保护作用，并从双苯氟嗪对Caspase-3、细胞色素c （Cytochrome c，Cyt c）、Bcl-2及线粒体通透性转变（Mitochondrial permeability transition,MPT）等细胞凋亡相关因素的影响，进一步阐明其保护缺血再灌注脑损伤的分子机制。实验内容和结果如下：1 不同脑缺血再灌注时间所致脑损伤模型比较目的：研究脑缺血再灌注后不同时相细胞损伤的变化，以确定评价抗缺血药物的最佳模型。方法：选择54只，随机分为9组， 假手术组，缺血1h再灌注0.5h组,缺血1h再灌注2h组， 缺血2h再灌注0.5h组,缺血2h再灌注2h组, 缺血3h再灌注0.5h组, 缺血3h再灌注2h组, 缺血6h再灌注0.5组, 缺血6h再灌注2h组,每组6只动物。采用Zea-Longa等线栓法，建立大脑中动脉栓塞（MCAO）动物模型。于实验结束后，采取所需标本。采用HE和甲苯安蓝染色于光镜下观察组织凋亡的变化。采用免疫组织学方法检测caspase-3蛋白的改变。采用酶标仪测定MDA的含量变化。以评价各项指标反映缺血再灌注脑损伤的灵敏程度，比较不同缺血时间与再灌注时间多脑损伤程度的影响。结果：HE染色组织学观察 假手术组无明显异常变化，缺血1h<WP=5>再灌注0.5h组未见明显的神经细胞坏死，缺血1h再灌注2h组有散在坏死细胞，而缺血2h以上组不管再灌注时间长短,其皮质和纹状体出现细胞肿账，胞核碎裂、溶解、固缩，及染色质浓缩、空泡化等病理改变。甲苯安蓝染色: 缺血1h 再灌注0.5h可见散在的甲苯安蓝染色阳性细胞, 缺血1h 再灌注2h 和缺血2h 再灌注0.5h阳性细胞表达增多, 至缺血2h 再灌注2 h时与缺血3h、6h组相似均出现大量甲苯安蓝染色阳性细胞。假手术组仅有少量阳性细胞表达。各组Caspase-3蛋白表达结果与甲苯安蓝染色结果相似，缺血1h 再灌注0.5h可见散在的Caspase-3蛋白的表达阳性细胞, 缺血1h 再灌注2h 和缺血2h 再灌注0.5h阳性细胞表达增多, 至缺血2h 再灌注2h时阳性细胞已表达成群,同缺血3h再灌注和缺血6h再灌注组相似，假手术组有少量阳性细胞表达。 MDA含量，缺血1h 再灌注0.5h组MDA的含量较低，随缺血再灌注时间的延长MDA的含量呈递增趋势。结论：本实验用的HE染色、甲苯安蓝染色、caspase-3蛋白及MDA指标均随脑缺血再灌注时间的延长而明显改变，提示可作为从不同角度反映脑缺血再灌注损伤的灵敏指标，而这些指标均在缺血2h再灌注2h时达到显着改变，可用作评价抗脑缺血药物的动物模型。2 双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响目的：研究双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响。方法：取大鼠30只，随机分为5组，假手术组，溶剂对照组及双苯氟嗪小、中、大叁个剂量组，每组6只。采用Zea-Longa等线栓法建立MCAO动物模型，于再灌注前40min分别给各组动物腹腔注射生理盐水、溶剂或双苯氟嗪20mg、40mg和80mg.kg-1，再灌注2h后处死动物，取标本用于各项指标检测，其中采用HE观察脑组织损伤变化，采用FCM观察组织凋亡百分率变化，采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的DNA原位末端标记技术检测脑组织神经细胞的凋亡。采用酶标仪检测SOD活性及MDA、的含量。结果：HE染色 溶剂对照组，皮质和纹状体出现细胞肿账，胞核碎裂、溶解、固缩，染色质浓缩及空泡化等改变。给予双苯氟嗪治疗后可减轻上述各种损伤，假手术组未见上述变化。<WP=6>原位凋亡检测（细胞个数/高倍视野），假手术组可见少数凋亡细胞（21(6 ）， 溶剂对照组细胞凋亡发生率明显增加（86(4），给予双苯氟嗪后凋亡细胞显着减少，其中双苯氟嗪20 mg.kg-1组为62(8 （P(0.01），40 mg.kg-1为51(6 （P(0.01）, 双苯氟嗪80 mg.kg-1组为30(7, （P(0.01）可显着抑制神经细胞的凋亡。 用FCM检测细胞凋亡百分率，假手术组DNA为5.9(0.9，溶剂对照组明显增加为17.6(1.9，给予双苯氟嗪80 mg.kg-1组凋亡率下降为9.1 (1.0，双苯氟嗪40 mg.kg-1组为12.5(2.2，双苯氟嗪20 mg.kg-1组为14.0(1.7。MDA (nM.ml-1)含量：假手术组为6.1(1.1，溶剂对照组增加为13.5(1.5，给予双苯氟嗪后MDA含量显着下降。SOD (NU.mg prot-1)活性： 溶剂组（108(14）显着降低于假手术组（139(9，P(0.05），给双苯氟嗪后SOD活性增加(136(11, Dip80, P(0.01)。O2 (NU.ml-1)的含量：溶剂组（580(54）显着降高于假手术组（421(62，P(0.05），给双苯氟嗪后降低（（Dip80、440(45、 P(0.01，Dip40、470(43，P(0.05，Dip20、475(52、P(0.05）。结论： 缺血再灌注时，脑组织有明显的损伤，表现为大量的凋亡细胞和坏死细胞，缺血
董玉[2]2004年在《双苯氟嗪对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中研究表明双苯氟嗪 (Dipfluzine, Dip) 是由河北医科大学合成的一类新型氟桂利嗪类钙通道拮抗剂。已有实验证明，其可以阻断细胞外钙离子内流，保证细胞内钙离子的稳定；并且能在脑组织中达较高的浓度，增加脑血流，保证脑细胞的能量和营养供应；改善小鼠的记忆障碍和提高小鼠的耐缺氧能力等。目前，临床上溶栓药物越来越广泛的应用给脑梗死患者带来新的希望，但同时也带来了新的再灌注损伤的问题。因此，本实验拟在大鼠全脑缺血再灌注模型中，以线粒体内钙含量为主要评价指标，观察 Dip 对全脑缺血再灌注所致的脑损伤有无保护作用，并且通过观察 Dip 对线粒体活性、线粒体膜肿胀度、线粒体膜电位的影响，探讨外源性钙离子致大鼠脑线粒体损伤和 Dip 保护线粒体损伤的作用机制。实验内容和结果如下： 一、不同的脑缺血再灌注时间所致脑组织线粒体损伤模型比较 目的：研究脑缺血再灌注后不同时相线粒体损伤的变化，以确定评价抗脑缺血再灌注损伤的最佳模型。 方法：采用 Pulsinelli 等的四动脉结扎法 (Four vesselocclusion, 4-VO) 造成大鼠急性全脑缺血再灌注损伤模型。取健康SD大鼠24只，体重250-300g，雄性，随机分为4组;(1) 假手术对照组 (Sham operation control group); (2) 缺<WP=5>血15分钟再灌注1小时组；(3) 缺血15分钟再灌注2小时组；(4)缺血15分钟再灌注4小时组。其中假手术对照组大鼠只行手术通路，不结扎颈总动脉，也不电凝椎动脉。假手术对照组大鼠于术后 24 小时直接断头取脑，其余各组选取模型成功的大鼠于再灌注结束时迅速断头取脑。除去小脑和嗅球，用密度梯度离心的方法提取大鼠脑线粒体，用第二代钙离子荧光指示剂 Fura-2/AM 负载后，采用双波长荧光法测定线粒体钙含量，按试剂盒操作分别测定线粒体 Ca2+-ATP酶活性以及 SDH 活性。脑组织线粒体蛋白含量采用考马斯亮兰法测定。 结果：假手术对照组大鼠脑组织线粒体钙含量为339±40nmol/L, 大鼠全脑缺血15分钟再灌注1小时、2小时及4小时组线粒体钙含量显着升高，分别为862±75nmol/L、1224±113nmol/L和1735±142nmol/L(p<0.01)。从生化指标来看：假手术对照组Ca2+-ATP酶活性为10.34±0.61U/mgpro，缺血再灌注1小时、2小时及4小时组，脑组织线粒体Ca2+-ATP 酶活性分别降低至 8.53±0.28U/mgpro、7.87±0.53U/mgpro 和 7.00±0.67U/mgpro，与假手术对照组相比缺血再灌注后脑组织线粒体 Ca2+-ATP 酶活性明显降低(p<0.01)；假手术对照组 SDH 活性为 5.8±0.6U/mgpro，缺血再灌注 1小时、2小时及 4 小时组，脑组织线粒体SDH 活性分别降低至 4.8±0.5U/mgpro、3.9±0.6U/mgpro 和 3.4±0.7U/mgpro，与假手术组相比缺血再灌注损伤后脑组织线粒体 SDH 活性均显着降低 (p<0.01)。 结论：本实验所选用的线粒体钙、Ca2+-ATP 酶活性及SDH 活性指标均随脑缺血再灌注时间的延长而明显改变，提<WP=6>示可作为从不同角度反映脑缺血再灌注对线粒体损伤的灵敏指标，在缺血 15 分钟再灌注 2 小时达到显着改变，因而可用作评价抗脑缺血再灌注损伤的最佳模型。
梅和珊[3]2004年在《双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用》文中认为随着对脑缺血机制研究和认识的不断深入，发现单纯阻断造成缺血性脑损伤的某一个环节并不能产生明显的神经保护作用，溶栓仍是目前临床治疗急性脑卒中的主要手段，但溶栓后的再灌注往往会加剧脑损伤，因此研究和开发能有效的对抗再灌注性脑损伤的药物显得尤其重要。 双苯氟嗪（dipfluzine，Dip）是我校药学院研制开发的二苯哌嗪类钙通道阻滞剂，全脑缺血模型研究表明双苯氟嗪可以选择性扩张脑血管、缓解缺血脑区的脑血流减少、减轻脑水肿、抑制脑缺血引起的脑内兴奋性氨基酸含量升高，显示了良好的脑保护作用。本研究拟采用endothelin-1（ET-1）诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，通过对脑血流、细胞凋亡、胞浆钙浓度、自由基损伤和脑透析液中兴奋性和抑制性氨基酸含量变化的检测，进一步评价双苯氟嗪在脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制。第一部分 Endothelin-1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型目的：研究ET-1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，确定适合进行缺血再灌注损伤机制研究和抗缺血性脑损伤神经保护剂筛选的最适ET-1浓度。 方法：40只雄性Wistar大鼠，随机分为假手术组，ET-1 300pmol组，ET-1 360pmol组，ET-1 400pmol组和ET-1 500pmol组。将4?l不同浓度的ET-1分别以1?l·min-1的速度经导管灌注到一侧大脑中动脉（MCA）附近，通过ET-1强烈的缩血管作用造成局灶性脑缺血再灌注模型。假手术组行手术通路，将等体积的人工脑脊液(aCSF)灌注到大脑中动脉附近，采用氢清除法监测灌注ET-1前后大鼠灌注侧纹状体脑血流（CBF）的变化，尾动脉插管术检测灌注ET-1对大鼠血压的影响，并于灌注ET-1后6h进行神经功能评分，采用TTC染色法观察灌注不同浓度ET-1后24小时脑梗塞体积的变化。结果：ET-1可使纹状体血流呈现浓度依赖性的降低，于灌注ET-1后<WP=5>10min时纹状体CBF降至最低，分别为：ET-1300 pmol组(27.1±2.9)%、360pmol组(12.7±2.1)%、400pmol组(11.9±1.8)%、500pmol组(9.5±1.6)%；神经功能评分显示假手术组大鼠未表现出神经功能损伤，而各浓度ET-1可造成大鼠不同程度的神经功能损伤，依次为300pmol组2.8±0.5分，360 pmol组6.1±0.6分，400pmol组6.9±0.4分，500pmol组9.3±0.5分，显着低于假手术组（P<0.01）；灌注ET-1后24h，脑梗塞体积百分率随ET-1浓度的增加而呈上升趋势，并显示出良好的浓度依赖关系：300pmol组(3.9±0.3)%、360pmol组(7.4±0.5)%、400pmol组(11.3±1.3)%、500pmol组(16.2±1.8)%；r = 0.9926 ( P<0.05 )；灌注ET-1对大鼠血压无影响。结论：该模型操作简单，造成的脑梗塞范围稳定、重现性好，是一种更接近人类卒中临床状况的较理想的局灶性脑缺血再灌注模型；其中400pmol ET-1所致大鼠局灶性脑缺血再灌注模型更适合于进行脑缺血再灌注损伤机制研究和抗缺血性脑损伤神经保护剂的筛选。第二部分 双苯氟嗪对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及对胞浆Ca2+浓度的影响目的：评价双苯氟嗪（Dip）和氟桂利嗪(Flu)在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用和对胞浆Ca2+浓度的影响。 方法：大鼠随机分为假手术组，灌注400pmol ET-1后2小时组，4小时组，8小时组，24小时组，溶剂组，Flu20mg·kg-1组，Dip10mg·kg-1组，Dip20mg·kg-1组和Dip40mg·kg-1组。采用ET-1诱导的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，分别将4μl 400pmol ET-1灌注到大脑中动脉（MCA）附近，分别于灌注ET-1后30 min 和4.5h腹腔注射溶剂、氟桂利嗪和不同剂量的双苯氟嗪，假手术组行手术通路，将等体积的人工脑脊液（aCSF）灌注到大脑中动脉附近。氢清除法监测灌注ET-1前、后纹状体脑血流(CBF)变化，并于灌注ET-1后24h测定脑梗塞体积、血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）的含量，双波长荧光分光光度法检测灌注ET-1后不同时间大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆游离Ca2+浓度的变化及双苯氟嗪对胞浆Ca2+浓度变化的影响。结果：大鼠脑缺血前纹状体平均脑血流量为34.0ml·100g-1脑组<WP=6>织·min-1，溶剂组缺血侧纹状体脑血流明显降低，给予Dip20mg·kg-1和Dip40mg·kg-1明显改善灌注ET-1后70min和100 min缺血侧纹状体脑血流下降（P<0.01），而Flu20mg·kg-1仅于灌注ET-1后100min时可明显改善缺血侧的脑血流（63.1±5.3）%，显着低于同剂量双苯氟嗪改善脑血流的作用（P<0.01）；灌注ET-1后24h，除假手术组外其它各组实验大鼠右侧半脑呈现不同程度的脑梗塞，Dip 10, 20, 40 mg·kg-1 可以剂量依赖性的使脑梗塞体积由溶剂组的(11.1±1.0)%分别降至 (10.6±1.1)%、(7.3±1.1)%和(4.2±0.8)%（r = 0.9797，P<0.01）；同剂量的氟桂利嗪可以产生与双苯氟嗪相似的作用（7.6±0.7）%，灌注ET-1后，溶剂组血清中SOD活性明显低于假手术组，分别为162±31kU·L-1和306±53 kU·L-1，给予双苯氟嗪和氟桂利嗪后血清中SOD活性明显增加，Dip10mg·kg-1：165±40kU·L-1；Dip20mg·kg-1：246±53kU·L-1；Dip40mg·kg-1：269±60kU·L-1；Flu20 mg·kg-1：249±49kU·L-1；双苯氟嗪和氟桂利嗪可以明显对抗脑缺血引起的血清中MDA含量的增加：假手术组9.1±0.5 m
刘向楠[4]2012年在《盐酸双苯氟嗪对缺血/再灌注性脑损伤的保护作用及机制研究》文中认为目前，临床上急性脑卒中的主要治疗手段是溶栓，但溶栓后的再灌注往往会加剧脑损伤，因此急需研究和开发能有效对抗缺血再灌注性脑损伤的药物。盐酸双苯氟嗪是由河北医科大学首创合成的一个新型的桂利嗪类衍生物。本实验室已通过生理、生化及形态学等多种技术从不同角度证明双苯氟嗪对缺血/再灌注性脑损伤有明显的保护作用。但是由于双苯氟嗪较难溶于水，不方便临床上脑卒中病人使用。所以我们将其制成盐酸盐，增加了其在水中溶解度，使其注射液可直接血管内给药。本研究拟在整体动物水平与细胞水平建立缺血再灌注脑损伤模型，观察盐酸双苯氟嗪对缺血/再灌注损伤的保护作用，并进一步探讨其保护机制。第一部分盐酸双苯氟嗪对大鼠局灶性缺血再灌注所致脑损伤的保护作用及机制研究目的：评价盐酸双苯氟嗪在大鼠局灶性缺血再灌注所造成的脑损伤中的保护作用及其机制方法：大鼠随机分为假手术组，溶剂对照组，盐酸双苯氟嗪组2.5μmol/kg组，盐酸双苯氟嗪1.3μmol/kg组，盐酸双苯氟嗪0.7μmol/kg，氟桂利嗪（Flu）1.3μmol/kg组。采用线栓法制备大鼠局灶性缺血再灌注模型，各组在缺血再灌注的同时尾静脉注射给药，给药容积为0.2ml/100g。假手术组只行手术通路，不插线栓不给药。缺血2h再灌4h后测定神经症状、脑含水量、血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，采用HE染色法光镜下观察组织病理变化，采用免疫组织化学染色法检测AQP-4蛋白的表达，以评价盐酸双苯氟嗪对缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其可能的机制。结果：（1）神经功能评价结果显示，假手术组大鼠未产生神经功能损伤，溶剂组大鼠神经功能评分为9.50±0.22，有明显损伤（P＜0.01）。盐酸双苯氟嗪大、中剂量组和Flu组与溶剂组相比有明显下降（P＜0.01），大鼠神经功能评分分别降至6.50±0.96、7.33±0.94和7.66±0.42。（2）脑含水量测定结果显示，缺血再灌注损伤后脑组织含水量明显升高至82.24±0.23%，药物干预后，盐酸双苯氟嗪各剂量组与Flu组大鼠脑含水量有明显降低，分别为大剂量组78.96±0.95%、中剂量组79.95±0.47%、小剂量组81.08±0.40和Flu组79.41±0.65%，抗脑水肿效果明显。（3）血清中SOD活性与MDA含量测定结果显示，缺血再灌注损伤后血清中SOD活性明显下降至24.86±0.86U/ml，MDA含量明显升高至6.11±0.05nm/ml，给予盐酸双苯氟嗪干预后，可减轻以上损伤，其中大剂量盐酸双苯氟嗪作用最为明显，SOD活性提高至61.79±1.09U/ml，MDA含量下降为4.64±0.05nm/ml。（4）HE染色结果显示，假手术组大鼠神经细胞未见明显病变。溶剂组大鼠缺血侧大脑皮层、纹状体和海马区出现严重的神经细胞变性坏死，胞体固缩，核浓缩深染，细胞与周围组织形成明显的间隙，出现空泡变性。高中低叁个剂量的盐酸双苯氟嗪可以剂量依赖性明显改善上述病变。（5）免疫组化检测AQP-4蛋白表达结果显示，AQP4主要在血管周围的胶质细胞有阳性表达，表达部位为细胞膜。假手术组胶质细胞仅有少量AQP-4的表达，缺血再灌注以后梗死周边区域AQP-4的表达则明显增多。盐酸双苯氟嗪大剂量组（4.60±0.31）、盐酸双苯氟嗪中剂量组（6.10±0.37）以及Flu组（5.70±0.47）胶质细胞的AQP-4表达与溶剂组相比均有显着减少（P＜0.01）。结论：盐酸双苯氟嗪能够通过清除自由基、抗脂质过氧化及减少梗死周边区域AQP-4的表达而减轻脑水肿程度，发挥神经保护作用。目的：评价盐酸双苯氟嗪在糖氧剥夺/复氧所致海马神经元损伤中的保护作用以及机制研究方法：体外培养原代海马神经元，7-8天成熟后，细胞随机分为I2h-R24h组、I4h-R24h组、I6h-R24h组、I8h-R24h组，通过MTT比色法测定细胞存活率，确定使用I6h-R24h作为糖氧剥夺/复氧模型。经I6h-R24h损伤后的细胞随机分为空白对照组、溶剂对照组、盐酸双苯氟嗪10μmol/L组、盐酸双苯氟嗪1μmol/L组、盐酸双苯氟嗪0.1μmol/L组和氟桂利嗪（Flu）1μmol/L组。分别测定各组神经元细胞MTT OD值、LDH漏出、胞内钙离子浓度、NO含量、NOS活性、细胞凋亡率，以评价盐酸双苯氟嗪的保护作用并研究其机制。结果：（1）经不同浓度盐酸双苯氟嗪干预的细胞，MTT测定的OD值明显增高，显示细胞活性升高，LDH漏出显着降低，表示细胞受损程度减小。（2）糖氧剥夺/复氧可致海马神经元胞浆内钙离子超载，盐酸双苯氟嗪可减轻由糖氧剥夺/复氧所致的海马神经元钙超载，其中高浓度组（238.50±7.73）与溶剂组(319.40±10.79)相比有显着性差异（P＜0.01）。（3）糖氧剥夺/复氧损伤会使细胞NO含量与NOS活性都明显升高，不同浓度的盐酸双苯氟嗪与Flu能够不同程度的改善此种损伤变化。（4）原位凋亡实验结果显示，正常对照组细胞可见有少量凋亡细胞（41.30±1.78），糖氧剥夺/复氧损伤使凋亡细胞数目明显增多（152.20±2.29，P＜0.01），盐酸双苯氟嗪可降低凋亡细胞数目，其中高浓度组（60.70±1.61）和中浓度组（100.10±1.94）与溶剂组相比有显着性差异（P＜0.01）。结论：盐酸双苯氟嗪可能通过阻断糖氧剥夺/复氧所致海马神经元胞浆内游离钙离子浓度， NO含量以及NOS活性的升高，改善糖氧剥夺/复氧引起的海马神经元损伤，发挥抗凋亡的作用。
陈雪彦[5]2003年在《双苯氟嗪对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用》文中研究表明双苯氟嗪(Dipfluzine, Dip)是由河北医科大学合成的一种新型桂利嗪类钙离子拮抗剂。实验证明，Dip具有舒张各种血管的作用，能选择性地松弛去甲肾上腺素(NA)和高钾所致的猪离体基底动脉的收缩；选择性地降低麻醉犬的椎动脉阻力；还能通过增加缺血区脑血流对抗大鼠缺血性脑水肿；并可改善小鼠的记忆障碍和提高小鼠的耐缺氧能力。本实验旨在，采用Pulsinelli等的四动脉拮扎法(Four vessel occlusion, 4-VO)造成大鼠全脑缺血再灌注损伤模型，观察大鼠全脑缺血再灌注损伤后脑组织水份的变化、学习记忆能力的下降以及脑电图(EEG)和组织形态学的改变。从而研究Dip的抗脑水肿作用以及对缺血性脑损伤的保护作用。并从自由基角度出发，通过测定超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性及丙二醛(MDA)的含量，进一步研究Dip的抗脂质过氧化作用，探讨其作用机制。实验内容如下：一、Dip对大鼠全脑缺血再灌注早期脑水分及一些生化指标的影响目的：通过探讨Dip对大鼠全脑缺血再灌注损伤早期脑水份及脂质过氧化产物含量的影响，研究Dip对早期缺血性脑损伤的保护作用。方法：用四动脉拮扎法造成大鼠急性全脑缺血30分<WP=5>钟后再灌注1小时的损伤模型。将体重250-300g的健康雌性SD大鼠随机分为六组：①假手术对照组（sham operation control group）；②溶剂对照组：此组大鼠均灌胃给溶剂。③氟桂利嗪（Flunarizine）阳性对照组（40mg/kg体重）；④大剂量双苯氟嗪（high dose Dip）治疗组（80mg/kg体重）；⑤中剂量双苯氟嗪（middle dose Dip）治疗组（40mg/kg体重）；⑥小剂量双苯氟嗪（low dose Dip）治疗组（20mg/k体重）。其中假手术对照组大鼠只行手术通路，不结扎颈总动脉，也不电凝椎动脉。其他各组大鼠均需做模型处理。给药方式均为灌胃给药，灌胃容积为0.8ml/100g体重，分别于缺血前30分钟及再灌注后即刻灌胃给药。假手术对照组大鼠于术后24小时直接断头取脑，其余各组大鼠造模成功后于再灌注结束时迅速断头取脑。沿大脑半球后极横切，去除切面以下部分。左半脑用干湿重法测脑组织水分含量。右半脑冰冻保存，用于制备脑组织匀浆，按试剂盒操作分别测定SOD、LDH的活性及MDA的含量。脑组织匀浆中蛋白含量用考马斯亮兰法测定。结果：经测定，假手术对照组大鼠脑组织含水量为78.3%，全脑缺血30分钟再灌注1小时后溶剂对照组大鼠脑组织水份含量显着升高，平均高达80.9%，与假手术组相比有统计学差异。灌胃给药Dip 80mg/kg、40mg/kg均可改善脑组织水肿程度，分别使脑水分含量下降至78.8%、79.1%。与溶剂对照组相比有显着性差异。Flu 40mg/kg也显着降低了脑水份的含量，达到79.2%。但与Dip大、中剂量组比较无统计学意义。Dip叁剂量组之间有剂量依赖<WP=6>性趋势但无统计学意义。从各项生化指标来看，缺血再灌注损伤后，脑组织MDA含量明显增高，而LDH、SOD活性显着下降。与假手术组相比有明显统计学差异。Flu和Dip叁个剂量组均可明显降低MDA的含量。Flu和Dip大、中剂量组也可明显提高LDH和SOD的活性，与溶剂对照组相比有统计学意义。但Dip小剂量组虽有提高LDH和SOD活性的趋势，但无统计学意义。结论：Dip对大鼠全脑缺血再灌注早期损伤有明显的保护作用，这可能与其抗脂质过氧化产物产生有关。关键词：双苯氟嗪,脑水肿,脂质过氧化,超氧化物歧化酶,丙二醛,乳酸脱氢酶,全脑缺血,再灌注
李海芳[6]2003年在《双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血及脑缺血-再灌注损伤的保护作用》文中提出双苯氟嗪（Ｄipfluzine, Dip）系由河北医科大学首创合成的哌嗪类钙拮抗剂。以前的研究工作表明：在体内外实验中Ｄip具有显着的选择性扩脑血管作用，在体内实验中有抗脑水肿作用，而抗血小板聚集和抗血栓形成作用在体内及体外实验中也已被证实。从这些研究结果中可以看出Dip有可能是一个很好的脑保护剂。为了进一步研究Dip的脑保护作用。本实验采用大鼠永久性局灶性脑缺血及大鼠局灶性脑缺血－再灌注两种病理模型来观察Dip的脑保护作用。第一部分 双苯氟嗪对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用目的：1.采用线栓法制备大鼠永久性局灶性脑缺血<WP=5>模型，并检验该模型的稳定性及手术对于大鼠的血压、心率有无影响。2.探讨Dip对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法：1. 大鼠永久性局造性脑缺血模型的制备与评价：将体重为250~300g的健康雌性SD大鼠随机分为：①假手术组；②缺血组。假手术组除不向颈内动脉插入尼龙线外其余步骤与缺血组均相同。采用线栓法制备模型，同时尾动脉插管监测血压及心率。术后６h进行神经功能评分，然后断头取脑冠状切片进行2,3,5叁苯基四氮唑（TTC）染色，计算脑梗死体积百分比（IV%）。2.Dip对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用：将体重为250~300g的健康雌性大鼠随机分为：①假手术组；②溶剂对照组；③氟桂利嗪（Flu）40mg/kg组；④Dip 80mg/kg组；⑤ Dip 40mg/kg组；⑥ Dip 20mg/kg组。以上各组的灌胃给药容积均为0.8ml/100g体重。每组又随机分为两组（A组和B组）。A组用来测IV%，B组用来做ＨＥ染色。术后1.5h进行灌胃给药治疗，假手<WP=6>术组和溶剂组均给予等容积的溶剂。术后６h，盲法进行神经功能评分。A 组断头取脑，冠状切片利用TTC染色法测定IV%；B组断头取脑，用固定液固定，常规石蜡包埋，切片，进行HE染色，用光镜观察脑梗死病理变化情况。结果：1.手术操作过程对大鼠的血压、心率没有影响。缺血组有明显的神经功能损伤（神经功能评分为７.8±0.8分），且IV%（12.2±0.5%）稳定性好(变异系数为4%)。假手术组没有神经功能损伤及缺血灶。2.Dip 80mg/kg和Dip 40mg/kg组神经行为学评分分别为5.5±0.8和6.0±0.6，与溶剂组（7.7±0.8）相比有显着性差异（P<0.01）；Dip 80mg/kg和Dip 40mg/kg组的IV%分别为4.6±1.5%和7.3±1.7%，与溶剂组相比亦有显着性差异（P<0.01），且Dip这种作用具有剂量依赖性。光镜观察大脑皮层第Ⅲ层：溶剂组，神经元水肿变性, 呈红色神经元改变；胞膜与周围组织间隙明显增大，呈空泡样。Dip 80mg/kg对之改善明显。Dip 40mg/kg及Flu 40mg/kg对之改善也较明显，但Dip 20mg/kg改善不<WP=7>明显。结论：1. 该模型成功率高，稳定性好，利于评价药物的药效学作用。2.Dip对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤具有保护作用。关键词：动物模型，大鼠，脑缺血，双苯氟嗪，氟桂利嗪，脑梗死范围，神经功能评分。第二部分 双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用。目的：1.采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血－再灌注模型，并检验该模型的稳定性。2. 探讨Dip 对大鼠局灶性脑缺血－再灌注损伤所致神经功能评分、IV%、血清中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性变化的影响。方法：1. 大鼠局灶性脑缺血－再灌注模型的制备与评价：将体重为230~270g的健康雌性SD大鼠随机分为：①假手术组；②缺血2h再灌注4h组（I2R4）。假手术组<WP=8>除不向颈内动脉插入尼龙线外，其余操作步骤均与I2R4组相同。采用线栓法制备该模型。同时监测脑血流的变化，再灌注后4h进行神经功能评分，然后断头取脑冠状切片进行TTC染色，计算IV%。2.Dip对大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤的保护作用： 将体重为230~270g的健康雌性SD大鼠随机分为：①假手术组；②溶剂组；③Flu 40mg/kg组；④Dip 80mg/kg组；⑤ Dip 40mg/kg组；⑥ Dip 20mg/kg组。假手术组除不向颈内动脉插入尼龙线外其余步骤与手术组相同。术后各组立即十二指肠给药（0.8ml/100g体重），而假手术组和溶剂组均给予等容积溶剂。缺血2h后，拔出线栓进行再灌注4h，进行神经功能评分，大鼠眼眶取血，留血清－80℃储存备用，然后断头取脑，TTC染色，计算IV%结果：1.术后I2R4组脑血流（CBF）由缺血前的52.9±2.9ml/100g/min降至14.8±1.5ml/100g/min，当拔出线拴再灌时，CBF又恢复至53.2±4.7ml/100g/min，证明该方法血流再灌注成功。假手术组CBF没有显着变化<WP=9>（P>0.05）。术后I2R4组神经功能有明显损伤，评分为8.0±1.0，IV%（15.2±1.3%）稳定性好（变异系数为9%）。假手术组未产生神经功能损伤及缺血灶。2. Dip 80mg/kg, 40mg/kg, 20mg/kg叁个剂量组剂量依赖性改善大鼠术后的神经功能评分至4.8±0.4、 6.2±0.8和7.2±0.4，与溶剂组（8.0±0.0）相比具有显着性差异（P<0.01）；Dip 80mg/kg、 40mg/kg 和 20mg/kg可分别降低IV%至 4.9±0.9% 、 9.2±1.4%和12.1±0.4%，与溶剂组（15.0±1.3%）相比均有显着性差异（P<0.01及P<0.05），且Dip 的这种改善作用亦具有剂量依赖性；Dip 80mg/kg 和 40mg/kg 能?
吕平[7]2004年在《双苯氟嗪对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中指出双苯氟嗪（Dipfluzine Dip）是由河北医科大学合成的一种新型桂利嗪类钙拮抗剂。它可通过选择性扩张脑血管、增加脑血流、改善脑缺血能量代谢等而发挥脑保护作用。研究发现：细胞凋亡是脑缺血后神经元死亡的重要方式，因此本实验采用大鼠全脑缺血模型，以细胞凋亡为主要评价指标，旨在观察双苯氟嗪是否具有抗凋亡作用，并从双苯氟嗪对caspase-3、NO、NOS等细胞凋亡相关因素的影响，更深一步的探讨其对缺血性脑损伤的保护作用的机制。一、不同缺血再灌注时间与神经元凋亡的关系目的：通过研究不同缺血再灌注时间点神经元损伤的变化，以确定评价抗缺血药物的最佳再灌时间。方法：采用四动脉结扎法造成大鼠急性全脑缺血15分钟再灌注模型。将50只体重250～300g、健康、雄性SD大鼠按照不同再灌注时间随机分为5组：（1）假手术对照组（2）缺血15分钟再灌4小时组（IR4h）（3）缺血15分钟再灌8小时组（IR8h）（4）缺血15分钟再灌24小时组（IR24h） （5）缺血15分钟再灌72小时组（IR72h）。其中假手术组只行手术通路，不电凝双侧椎动脉也不夹闭颈总动脉，于术后24小时直接断头取脑。其余各组均于预定再灌注时间结束后断头取脑。每组中4只大鼠断头取脑后迅速剥离双侧海马，放入70%乙醇中固定，用于流式细胞仪检测凋亡百分率及<WP=5>caspase-3表达。其余6只大鼠断头取脑后，沿冠状切面取视交叉后1.2～5.2mm脑片，迅速放入4%多聚甲醛中固定，用于免疫组化方法检测caspase-3表达及HE染色在光镜下观察细胞形态的变化和神经元密度。结果：经测定，假手术组细胞凋亡百分率为2.23±0.21%，随着缺血再灌注时间的延长，凋亡百分率明显增加，IR4h、IR8h、IR24h及IR72h凋亡百分率依次为：4.97±0.49%、8.00±0.30%、10.17±1.31%、及12.03±1.17%，与假手术组相比，均有显着性差异（P<0.01）。流式细胞仪及免疫组化检测caspase-3表达量的变化，与凋亡百分率的变化趋势相似，均随着缺血再灌注时间的延长，caspase-3的表达量逐渐增加，假手术组、IR4h、IR8h、IR24h、IR72h分别为5.03±0.08 channel、5.51±0.14 channel、5.61±0.18 channel、6.14±0.17 channel、及6.37±0.27 channel。HE染色组织形态学观察表明，假手术对照组CA1区有3～4层锥体细胞，排列整齐紧密，细胞核大而圆，透明，有1～2个明显核仁。IR4h组和IR8h组，CA1区锥体细胞层基本结构正常，细胞形态无明显异常改变，细胞数目无明显变化。IR24h组神经元数目减少，细胞体积缩小，核不规则、深染。IR72h组 CA1区失去正常结构，细胞排列散乱，大量锥体细胞变性，胞体肿胀变形，胞浆中出现空泡，核固缩或溶解，神经元数目明显减少。结论：脑缺血再灌时，随着再灌注时间的延长，凋亡百分率和caspase-3蛋白的表达量均逐渐增加，光镜下细胞损伤程度也呈进行性加重，锥体细胞存活数目逐渐减少。这些指标均在缺血15分钟再灌24h达到显着改变，因此，我们选用再灌24小时，为评价药物的最佳时间点。<WP=6>二、双苯氟嗪对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡及相关因素的影响目的：研究双苯氟嗪对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡的影响以及对NO、NOS和iNOS的作用。方法：采用四动脉结扎法造成大鼠急性全脑缺血15分钟，再灌注24小时模型。将84只体重250～300g、健康、雄性SD大鼠随机分为7组：（1）假手术对照组（2）缺血再灌24小时组（IR24h组）（3）溶剂对照组 （4）小剂量双苯氟嗪治疗组（0.5mg/kg）（5）中剂量双苯氟嗪治疗组（1mg/kg）（6）大剂量双苯氟嗪治疗组（2mg/kg）（7）氟桂利嗪（Flunarizine Flu）阳性对照组（1mg/kg）。其中假手术组只行手术通路，不电凝双侧椎动脉也不夹闭颈总动脉。其余各组均做模型处理。（3）～（7）组于再灌注同时尾静脉注射给药，给药容积为0.25ml/100g体重。各组大鼠在处死前，均内眦取血，离心后取上清液-80℃保存，用于检测NO，NOS及iNOS。假手术组于术后24小时，其余各组于再灌24小时后分别断头取脑。采用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率和caspase-3表达量，HE染色进行组织形态学观察和记数CA1区锥体细胞密度，按试剂盒操作分别测定NO含量、NOS、iNOS的活性。结果：经测定，假手术对照组大鼠脑组织的凋亡百分率和caspase-3表达量分别为2.23±0.21%和5.03±0.08 channel，脑缺血再灌后，溶剂组凋亡百分率和caspase-3表达量均明显增高，分别高达10.00±0.46%和6.40±0.26 channel，与假手术组相比，有统计学差异。Flu和Dip小、中、大剂量均可明显抑制凋亡及caspase-3表达，其中使凋亡百分率依次降至<WP=7>7.73±0.15%、8.87±0.42%、7.17±0.25%、和4.77±0.29%；使caspase-3表达量分别降至5.09±0.27 channel、6.09±0.09 channel、5.22±0.09 channel和5.03±0.08 channel。与溶剂组相比有统计学意义。从各项生化指标来看，脑组织和血清中的NO含量以及NOS和iNOS活性，在脑缺血再灌后也明显增加，与假手术组相比有明显统计学差异。Flu和Dip中、大剂量均可明显降低脑组织和血清中的NO含量、iNOS活性以及脑组织中的NOS活性，对血清中的NOS活性虽有降低的趋势，但无统计学意义。Dip小剂量对NO、NOS和iNOS作用不明显?
梅和珊, 张英俊, 苗庆峰, 王永利[8]2005年在《双苯氟嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤后胞浆[Ca~(2+)]_i的影响》文中研究表明目的研究双苯氟嗪(Dip)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑神经细胞胞浆Ca2+浓度([Ca2+]i)变化的影响。方法将400pmol的内皮素-1(ET-1)灌注到大鼠大脑中动脉附近制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,以Fura-2/AM作为钙荧光指示剂,双波长荧光分光光度法检测灌注ET-1后不同时间大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca2+]i的变化及Dip对灌注ET-1后4h胞浆[Ca2+]i变化的影响,并采用TYC染色法观察了Dip对灌注ET-1后24h脑梗死范围的影响。结果灌注400pmolET-1诱发大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后,大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca2+]i明显升高,并于灌注EF-1后4h达峰值,随着再灌注时间的延长,胞浆[Ca2+]i逐渐降低;Dip20,40mg·kg-1可以明显降低灌注ET-1后4h大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca2+]i的升高(P<0.01),Dip10mg·kg-1组虽表现出一定的降低胞浆[Ca2+]i的作用,但与溶剂组比较,差异无显着性(P>0.05);对脑梗死范围的测定结果显示,Dip可以缩小脑梗死范围,其作用呈现明显的剂量依赖关系(r=0.9797,P<0.01)。结论Dip对抗脑缺血再灌注损伤后胞浆[Ca2+]i升高可能是其产生神经保护作用的重要机制。
陈雪彦, 李海芳, 张伟, 王永利, 张永健[9]2005年在《双苯氟嗪对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用》文中研究说明目的研究双苯氟嗪(D ip)对大鼠急性全脑缺血再灌注损伤的保护作用,并初步探讨其作用机制。方法采用Pu lsinelli等的四动脉结扎法(4-VO)造成大鼠全脑缺血再灌注损伤模型,观察大鼠全脑缺血再灌注损伤后早期脑组织水分的变化、生化指标的改变,再灌注后期行为学和组织形态学的改变。结果缺血30 m in再灌注1 h脑组织水分及丙二醛(MDA)含量升高,乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性下降;缺血20 m in再灌注5 d后海马CA1区椎体细胞层破裂,胞核固缩或溶解,间质也变得疏松。行为学实验表明大鼠记忆力明显受损。D ip可不同程度地抑制上述变化,能对抗自由基损伤和脑水肿,并能保护海马CA1区神经元免受缺血损伤,提高大鼠对空间辨别的记忆能力。结论D ip对大鼠全脑缺血再灌注早期损伤有明显的保护作用,并能保护海马CA1区神经元免受缺血损伤,提高大鼠对空间辨别的记忆能力,对迟发性神经元死亡有一定的保护作用。这可能与其抗脂质过氧化产物产生有关。
李海芳, 陈雪彦, 张伟, 王永利, 张永健[10]2008年在《双苯氟嗪对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用》文中认为目的观察双苯氟嗪(dipfluzine,Dip)对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法采用线栓法建立雌性大鼠永久性局灶性脑缺血损伤模型。将雌性SD大鼠随机分为假手术组、缺血对照组、Dip(20,40和80mg·kg-1)治疗组、氟桂利嗪40mg·kg-1治疗组。术后1.5hig给药。术后6h,采用盲法进行神经功能评分;测定脑梗死体积(IV%)及观察脑细胞病理组织学改变。结果缺血对照组神经功能评分为(7.7±0.8),Dip20、40及80mg·kg-1治疗组分别为(6.8±0.8)(P<0.05);(6.0±0.6)(P<0.01)和(5.5±0.8)(P<0.01);Dip40和80mg·kg-1组Ⅳ%与缺血对照组相比分别低39%和62%。且Dip上述作用均呈剂量依赖性。病理组织学观察结果表明,Dip40和80mg·kg-1可以减轻脑损伤。结论Dip对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤具有保护作用。
参考文献：
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