刘芳1 李波清2
（1山东省荣成市中医院 山东荣成 246300）
（2山东省滨州医学院 山东滨州 256600）
【摘要】目的：通过对产ESBLs肺炎克雷伯菌进行诱导产生L型、L型返祖，分析原菌株和返祖菌株的药物敏感情况和产酶情况以及其相应的分子机制。了解L型在ESBLs耐药传播中的作用和产酶L型菌株药敏的特征改变，为临床用药提供指导。方法：应用K-B法进行L型细菌的诱导，对原菌株和返祖菌株的药敏特征进行分析比较。结果：原菌株和返祖后仍有ESBLs质粒菌株，产ESBLs，对β-内酰胺类、头孢类、单环β-内酰胺类、糖基甙类、磺胺类抗生素耐药，对喹诺酮类、头霉素类、碳青霉烯类抗生素敏感。结论：返祖后菌落可分为两种：有ESBLs质粒菌株和ESBLs质粒丢失菌株。
【关键词】产ESBLs细菌L型 诱导 返祖 药敏特征
【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）18-0087-02
L型细菌(L-form bacterial)是在某些水解酶或抗生素等因素的作用下，细菌肽聚糖的合成受阻导致细胞壁受损而形成的细胞壁缺陷型细菌(cell-wal1-deficient bacteria，CWDB) [1]。L型细菌，为变异型，其培养条件、染色特征及其致病性均与原菌不同，还可产生毒素和酶而致病 [2-3]。
ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，是水解青霉素、广谱及超广谱头孢菌素和单环β-内酰胺抗生素且能被克拉维酸抑制的一类β-内酰胺酶 [4]。其传递由质粒介导，通过接合、转化和转导等形式在细菌间传播。对于L型菌传递R质粒能力，已有报道称L型菌存在接合现象但频率明显降低[5]，但缺乏有关产ESBLs细菌L型的药敏特征和传递机制的相应研究。
1.资料与方法
1.1标本采集 用接种针取临床检出的产ESBLs肺炎克雷伯菌菌种转种到L型菌种保存培养基中。
1.2ESBLs检测 采用双纸片协同试验和NCCLS2005年推荐的纸片确证法。采用头孢噻肟(30μg)和头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg)、头孢他啶(30μg)和头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg)，两组药敏纸片贴在同一M-H琼脂平板上，任何一组药物，加与不加克拉维酸后的抑菌环直径增大≥5 mm. 时，判定为ESBLs(超广谱β-内酰胺酶)阳性。
1.3L型细菌的诱导
1.3.1材料
A、血平板、L型细菌培养基：杭州天和微生物试剂有限公司。
B、革兰氏染液：结晶紫染液，碘液，95％酒精，石炭酸复红染液。
C、细胞壁染液：10％鞣酸，0.5％结晶紫水溶液，0.5％刚果红。
D、药敏纸片：Oxoid Ltd，Basingstoke，Hampshine，England 产品。
1.3.2方法
A、自保存培养基中挑取原菌株，接种到血平板上，进行增菌培养8h，然后，转种到L型增菌液中培养24h。
B、取50μl肺炎克雷伯菌培养物，用L形接种棒均匀涂布在L型细菌培养基上，待平板稍干后取环一片丙沙星药敏纸片，贴于平板中央，置37℃培养，次日观察有无抑菌环。
C、每隔一天观察抑菌环内有无油煎蛋样小菌落。如出现，则取油煎蛋样菌落和抑菌环外细菌分别进行涂片、革兰氏染色和细胞壁染色。
1.3.3结果判读 抑菌圈内菌落形态为油煎蛋样、颗粒型或丝状，G-，细胞壁染色后，无细胞壁结构，全菌呈紫色；抑菌圈外菌落较大呈圆型，G+，细胞壁染色后，菌体外周呈紫色，胞浆无色或呈淡紫色，两种细菌区别明显。
1.4.L型细菌增菌培养
取抑菌环内小菌落接种到L型液体增菌培养基中，并将培养基置37℃ CO2培养缸培养1周后，涂片染色镜下观察。
1.5.L型细菌的返祖
1.5.1材料：BACT/ALERT?SA血培养瓶、一次性采血盛血器。
1.5.2方法
A、抽取BACT/ALERT?SA血培养瓶中培养基3ml，标明序号1号，用接种环取L型细菌培养基上小菌落转种到1号培养基中，然后置于37℃温箱孵育。每隔两天观察盛血器中有无混浊现象，若有，涂片染色观察细菌形态。
B、如观察到细菌仍为L型，另取3ml培养基，标明2号，用接种环蘸取1号管中混浊物2-3环转种到2号管中，按A中方法继续培养观察。依次，直到观察培养出正常细菌。
1.5.3结果判读 方法同3.3中叙述。
药敏试验采用K-B纸片扩散法，选取血琼脂培养基上20个菌落分别做药敏试验药敏。质控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC 700603为产ESBLs标准菌株，作为ESBLs阳性对照，药敏质控菌为E．coli ATCC25922。
2.结果
2.1产ESBLs检出情况
肺炎克雷伯L型细菌返祖后产ESBLs菌株检出率为70%（14/20）。
2.2药敏结果（见表1）
表1 药敏结果总结
3.讨论
本试验诱导产生L型细菌，然后返祖，细菌产ESBLs情况的发生改变。细菌含有ESBLs质粒，产生ESBLs，此酶可水解氧亚氨基β-内酞胺抗生素，而导致细菌对此类抗生素耐药。氧亚氨基β-内酞胺类抗生素包括第三代头孢菌素如头孢噻肟和单环酰胺类抗生素如氨曲南，也包括第四代头孢菌素如头孢吡肟，这些抗生素都有一个含氧亚氨基基团的侧链。如表1所示，当经过诱导、返祖后ESBLs质粒丢失，耐药情况也发生了改变。碳青霉烯类亚胺培南是对产ESBLs细菌最稳定的β-内酰胺抗生素，所以药敏情况不改变。喹诺酮类、氨基糖甙类、头霉素类、磺胺类、碳青霉烯类抗生素不受ESBLs质粒是否丢失影响所以其药敏结果不发生改变。
【参考文献】
[1]周正任．医学微生物学[M]．第六版．北京：人民卫生出版社，2003．10—11．
[2]Domingue GJ， Woody HB: Bacterial persistence and expression of disease. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 320-344.
[3]Mattman LH．Cellwall deficientforms，stealth pathogens[M]．3rd ed．New York：CRC Press，2001：
[4]Marshall TG， Marshall FE. Sarcoidosis succumbs to antibiotics-implications for autoimmune disease [J].Autoimmun Rev. 2004 Jun;3(4):295-300.
[5]张阳根，张海艳，江先海. 超广谱内酰胺酶研究进展江西医学检[J].2007，25（3）：254-255
论文作者:刘芳1,李波清2
论文发表刊物:《心理医生》2015年18期供稿
论文发表时间:2016/5/12
标签：细菌论文; 菌株论文; 培养基论文; 质粒论文; 菌落论文; 细胞壁论文; 头孢论文; 《心理医生》2015年18期供稿论文;