（1、怀化市中医院，湖南 怀化 418000 ；
2、湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）
[摘要] 目的：建立生物效价法测定紫草膏的抗菌功效的方法。方法：按照《中国药典》(2015年版)四部“抗生素微生物检定法第一法管碟法”，以金黄色葡萄球菌为菌种，建立生物效价评价紫草膏的方法。结果：紫草膏的抗菌实验量效之间有良好的线性关系。结论：该方法操作简便，重现性好，可用于紫草膏的抗菌功效测定。
[关键词] 生物效价法；紫草膏；管碟法
Determination of Antibacterial Efficiency of Lithospermum Ointment by Biovalence Method
Qing Xue wen
(Huaihua Traditional Chinese Medicine Hospital , Huaihua，Hunan 418000 )
ABSTRACT Objective：Establishment of a bioavailability method for the determination of antimicrobial efficacy of Lithospermum Ointment.Method：According to the four parts of Chinese Pharmacopoeia (2015 edition), the first method of microbial identification of antibiotics, tubesheet method, and the method of biological potency evaluation of Shikong ointment with Staphylococcus aureus as strain were established. Result：There is a good linear relationship between the dosage and effect of Shicao Ointment in antimicrobial experiment.Conclusion：The method is simple, reproducible and can be used to determine the antimicrobial efficacy of Shicao Ointment.
紫草膏由紫草、当归、防风、地黄、白芷、乳香、没药等组成，具有化腐生肌，解毒止痛的。用于热毒蕴结所致的溃疡，症见疮面疼痛、疮色鲜活、脓腐将尽。紫草膏中主要成分为紫草，紫草具有清热凉血，活血解毒，透疹消斑等功效，常用于湿疹，水火烫伤[1]。本研究以紫草膏中紫草的有效抗菌成分紫草素为对象，制定基于生物效价法测定紫草膏中抗菌成分的质量标准。
1 仪器与试药
AB135-S型电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；隔水恒温培养箱(上海一恒)；游标卡尺（哈尔滨量具刃具集团有限责任公司）。红霉素对照品（批号：130307-200716，每mg相当于938单位，中国药品生物制品检定所）；金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]（中国药品生物制品检定所）；营养琼脂培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）；紫草膏（湖南省怀化市中医院，批号为20181206，20181025,20191115，20181210，20181122，20181130、20181030、20181115、20181216、20181222、20181225、20181203）；石油醚（60～90 ℃）、盐酸、氢氧化钠、乙醇均为分析纯，水为无菌超纯水。
2 方法与结果
2.1 试验材料的准备
参照《中国药典》(2015年版)四部“抗生素微生物检定法第一法管碟法[2]”。
2.2 标准溶液的制备
精密称取红霉素适量，加水溶解并稀释至105 µg/mL作为标准品储备液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品30 g，加石油醚（60～90 ℃）80 mL使溶解，用2%氢氧化钠溶液振摇提取2次，30 mL/次，合并提取液，滴加盐酸使液面浮有红色油状物，加乙醚80 mL振摇提取，分取乙醚液，挥干，残渣加乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。
2.4 菌悬液的制备
取金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂斜面，在37 ℃下培养22 h时，用无菌水将细菌洗下，制成菌悬液。
2.5 双碟的制备
往灭菌后的培养皿注入灭菌后的营养琼脂培养基10 mL，铺匀，使其冷却凝固，作为底层。另取200 mL灭菌后的营养琼脂培养基，放冷至50 ℃左右，加入1 mL菌悬液，摇匀，往每个双谍中加5 mL带菌液的营养琼脂培养基，铺匀，作为菌层。冷却后，每个双碟均匀放置4个牛津杯。
2.6 方法学考察
2.6.1 线性关系考察[3-8]
取上述制好的双碟16只，每两只双碟一组，分为8组，分别取标准溶液按照1：0.8剂距用无菌水稀释成10.5、8.4、6.72、5.376、4.300、3.44、2.752、2.202 µg/mL的溶液。每组分别将不同浓度的标准溶液283 μL加入牛津杯中，置于培养箱中培养22 h，取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径。以抑菌圈直径为横坐标X，标准品浓度Y为纵坐标，得线性方程Y=0.7657X+9.0253，R2=0.9948，结果表明在2.202~10.5 µg/mL范围内浓度与抑菌圈线性关系良好。
2.6.2 精密度试验
取同一标准品溶液，按上述条件重复测定6次，抑菌圈直径的RSD%为0.78%，表明精密度良好。
2.6.3 稳定性试验
取同一标准品溶液，分别于0、2、8、24 h时按上述条件测定。结果抑菌圈直径的RSD%为0.95%（n=6）。表明标准品在24 h内稳定。
2.6.4 重复性试验
取同一标准品溶液，稀释至5.376 µg/mL，共6份，按上述条件测定各自的抑菌圈直径，其RSD%为0.98%。
2.7 试验设计[2]
采用三剂量法进行试验，随机区组设计实验，将标准品与样品溶液按照1:0.8的比例随机分成高、中、低6组。取6只制备完的双碟，在每只双碟中一侧的3个牛津杯中分别滴加高、中、低浓度的红霉素溶液，另一侧3个牛津杯中分别滴加高、中、低浓度的样品溶液，滴加量283µL，在37 ℃培养22 h后，测量各个抑菌圈直径，照生物检定统计法中（3·3）法进行可靠性测验及效价计算。
2.8 结果及小结 通过进行三剂量试验，紫草膏的实验结果均能通过可靠性检测，表明紫草膏可以通过（3·3）法进行效价计算。通过检测紫草膏的抗菌效价为3.02～3.21u/10g。
3 讨论
为寻求解决中药质量控制问题的新突破,根据现行中药质量控制管理模式的现状和问题、中药与生物制剂和化学合成药生产质量控制管理模式的差异性和合理性、以及道地药材在中药生产质量控制上的历史作用和现实意义,肖小河等提出:应借鉴生物制品生产质量管理模式,建立基于道地优级药材和生物检测的中药质量控制模式和方法,以期从常规、化学和生物多重角度共同把关中药质量,创新和完善中药质量控制方法体系
3.1 菌种的选择
紫草膏主要用于烧伤、烫伤等症状，皮肤作为人体抵御微生物入侵的天然屏障被破坏而出现细菌感染，常见细菌为金黄色葡萄球菌。因此本试验选取金黄色葡萄球菌作为试验菌株。
3.2 溶剂的选择
紫草膏中的主要抑菌成分为紫草素，其不溶于水，溶于乙醇、有机溶剂和植物油，易溶于碱水，遇酸又沉淀析出。因此选取乙醇作为溶剂。同时对乙醇的抑菌效果进行测定，乙醇作为溶剂对抑菌试验没有干扰。
3.3 菌液浓度的选择
试验中采用了0.5%、1%、1.5%、2% 4种菌液浓度进行试验，发现0.5%的菌液菌层生长良好，抑菌圈清晰，边界明显。故选取0.5%的菌液浓度。
参考文献
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论文作者:覃薛文1贺涟漪2 向鹏1,易琴2,王雅丽1 易丹1 张绪
论文发表刊物:《总装备部医学学报》2019年第07期
论文发表时间:2019/9/29
标签：紫草论文; 溶液论文; 生物论文; 中药论文; 中国论文; 抑菌论文; 质量控制论文; 《总装备部医学学报》2019年第07期论文;