李状[1]2012年在《二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究》文中提出第一章卵巢癌多药耐药的研究进展(文献综述)卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一。卵巢隐匿于盆腔的深部,早期病变时不易被发现,一旦出现症状时大多属于晚期,治疗后容易复发,死亡率亦一直位居妇科恶性肿瘤之首。目前卵巢癌的治疗目的是早期争取治愈、晚期控制复发、延长生存期及提高患者生活质量。治疗原则是以手术为主,联合化疗及放疗的综合治疗。大多数的情况下,手术是很难将卵巢癌的转移灶彻底的切除干净。对于那些残留的细小的转移和种植结节.都需要化学药物来进行治疗。因此,化疗在卵巢癌治疗的过程中具有极其重大的意义。晚期卵巢癌的治疗方法主要以肿瘤细胞减灭术及术后辅助化疗为主。但化疗失败常会导致卵巢癌的复发,其主要原因在于肿瘤细胞产生的多药耐药(multidrug resistance,MDR)。以顺铂为主的联合化疗对卵巢癌的有效率达40%-60%,由于疾病进展和机体对化疗产生耐药,晚期卵巢癌患者的5年生存率低于20%。所以,多药耐药是肿瘤化疗失败的主要因素之一。因此,肿瘤产生耐药机制的研究以及在临床上预防耐药、对抗耐药并尝试逆转耐药就成为了当前卵巢癌治疗中的热点和难点,成为提高卵巢癌的治疗效果及改善卵巢癌患者生存的重要目标之一。第二章卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义目的探讨卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因(DHFR)(?)的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR法测定80例卵巢癌组织、50例良性卵巢组织及30例正常卵巢组织中的DHFR mRNA表达情况,分析其与卵巢癌临床病理及多药耐药的相关性。结果(1)DHFR mRNA表达量在止常卵巢,良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中分别为0.584±0.234,0.895±0.783和0.197±0.412,相比较差异有统计学意义(P<0.001,P=0.027,P<O.001)。(2)卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者临床分期及病理分级无相关(P>O.05),但在上皮性癌中浆液性癌组织中DHFR mRNA表达量则明显高于粘液性和内膜样癌,相比较差异有统计学意义(P<0.001)。(3)卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者的腹水量,淋巴结转移和远处器官转移无明显相关(P>O.05),但大网膜转移者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量则低于无转移者(P=0.044)。(4)在卵巢癌患者中治疗后缓解者组织中DHFR mRNA表达量低于肿瘤进展者(P<O.001)；而铂类药物敏感型患者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量也低于铂类药物耐药者(0.130±0.103vs0.341±0.701P=0.011)。(5)DHFR mRNA表达量判断卵巢肿瘤性质的ROC曲线Youden旨数最大值所对应的数值为0.331, DHFR mRNA表达量高于0.331的患者中位生存时间为16.4个月,而低于0.331的患者中位生存时间为44.5个月,著异有统计学意义(P<0.001),且COX模型多因素分析亦显示DHFR mRNA表达量为影响预后的独立因素(P=0.018)。结论DHFR mRNA在正常和良性卵巢组织中表达量高于卵巢癌组织,提示DHFR参与正常组织细胞生理代谢；而在卵巢癌中DHFR mRNA在铂类耐药组织中高表达(O.341±0.701),在铂类敏感组织低表达(0.130±0.103),提示DHFR与卵巢癌多药耐药相关,可能为判断卵巢癌多药耐药潜在标志之一。第三章二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮癌细胞系生物学特性影响的体外实验研究目的构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindⅢ及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pWPI-SKOV3细胞、空载pWPI-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下(2.5ug/ml,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1)不同时间段(24h、48h及72h)的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度(6.0ug/m1)下三种细胞的周期变化,高效液相法(HPLC法)检测不同顺铂浓度(4.0ug/ml,6.0ug/ml,8.0ug/ml)不同时间段(24h、48h及72h)药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度(6.0ug/m1)下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的过表达对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果(1)成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达,将其病毒液感染SKOV3细胞。(2)通过流式细胞仪检测转染DHFR基因的细胞的凋亡变化,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度(2.5ug/ml、5.0ug/m1)刺激下,其24h、48h及72h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度(10.0ug/ml、20.0ug/ml)刺激下,其24h及48h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞,但在72h时,凋亡率却高于SKOV3细胞株。表明DHFR-pWPI-SKOV3细胞在浓度小于5.0ug/ml时,不管时间的改变(72小时内),其对顺铂的抵抗力高于其他两种细胞。(3)通过流式细胞仪检测不同时间段IC50顺铂浓度(6.0ug/m1)对三种不同处理卵巢癌细胞的周期变化,结果提示1C50(6.0ug/m1)顺铂浓度给药时,DHFR-pWPI-SKOV3、pWPI-SKOV3及SKOV3三种细胞在24h、48h时其G1期含量明显低于G2+S细胞：而在72h时,DHFR-pWPI-SKOV3细胞的G2+S期明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。(4)采用HPLC法检测细胞内顺铂浓度,结果显示细胞培养液中顺铂浓度(4.0ug/m1)给药24h、48h后及顺铂浓度(6.0ug/m1)给药24h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量均明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；顺铂浓度(6.0ug/m1)给药48h及顺铂浓度(8.0ug/ml)给药24h、48h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量明显高于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。(5)通过电镜观察1C50顺铂浓度在不同时间段刺激三种不同处理的细胞的超微结构改变,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在给药24h及48h其微丝聚集,线粒体从数量上及结构上改变明显,而pWPI-SKOV3细胞微丝少见,线粒体数目减少,但结构改变不明显,SKOV3细胞亦很少见到微丝,但其线粒体的结构改变亦明显,扩张与固缩同时存在；三者均出现扩张的内质网；三者均少见正常的细胞器；在给药72h后,pWPI-SKOV3及SKOV3细胞可见微丝排列紊乱,核膜部分消失,核糖体大量的聚集,进入了明显的坏死阶段,而DHFR-pWPI-SKOV3细胞未见微丝,核膜几乎完全消失,胞质内有白色囊状物质,线粒体结构基本消失,大部分细胞濒临死亡。结论成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,耐药性功能实验表明DHFR表达量增高时卵巢癌细胞系耐药性增加,可以认为DHFR与卵巢癌顺铂的耐药性相关,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。第一节RNA干扰质粒载体的构建及鉴定目的构建二氢叶酸还原酶(DHFR, dyhidrofolate reductase)基因RNAi慢病毒载体,为探讨抑伟DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入p GSCIL载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。结果将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGPU6/GFP/Neo载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,PCR鉴定干扰效果。G418筛选稳定细胞株。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。第二节DHFR慢病毒干扰载体的构建及其在卵巢上皮癌细胞中生物学特性影响目的构建二氢叶酸还原酶(DHFR, dyhidrofolate reductase)基因RNA干扰慢病毒载体,研究其耐药性功能影响,为探讨抑制DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入pGSCIL/GFP载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。Western blot验证构建成功通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pGSCIL-SKOV3细胞、空载pGSCIL-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下(2.5ug/m1,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1)不同时间段(24h、48h及72h)的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度(4.4ug/ml)下三种细胞的周期变化,高效液相法(HPLC法)检测不同顺铂浓度(2.5ug/ml,5.0ug/ml,7.5ug/ml)不同时间段(24h、48h及72h)药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度(4.4ug/m1)下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的沉默对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果(1)将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGSCIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,Western blot鉴定十扰效果。(2)在给药24h、48h及72h,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞的凋亡率随着顺铂浓度(2.5ug/ml、5.0ug/ml、10.0ug/ml、20.0ug/m1)的增大而升高,且DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞给药48h及72h后的凋亡率明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。(3)在IC50(4.4ug/ml)顺铂浓度给药24h、48h后,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞均以G1期为主。DHFR-pGCSIL-SKOV3在48h时G1期的细胞比例明显减少,S期和G2/M期比例增多,72h后三种细胞G1期的含量均明显降低,S期和G2/M期的含量均增高。(4)采用高效液相检测细胞内顺铂浓度时,当2.5ug/m1、5.0ug/ml顺铂浓度作用三种不同处理的卵巢癌细胞时,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在给药后24h、48h其细胞内顺铂浓度均明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。而DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在7.5ug/ml顺铂浓度给药后24h其细胞内顺铂浓度均明显低于PGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,而在48h却又高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。(5)在IC50(4.4ug/m1)给药24h、48h三种不同处理细胞的微丝均少见,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在24h时可见线粒体肿胀、脊消失、空泡化、萎缩,内质网扩张明显,有聚集的核糖体,末见高尔基体,48h时其有些线粒体溶解消失,且出现大量的白色囊泡；而pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞24h、48h内质网扩张少见,线粒体结构改变不明显,甚至有2-3个高尔基体存在；DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞至72h时,微丝明显的聚集、增多,线粒体结构亦消失。余两种细胞微丝排列紊乱,线粒体形态多样化。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA慢病毒载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。通过对DHFR下调后耐药性功能研究证实DHFR基因的下调与经过铂类药物作用的体外卵巢癌细胞的药物敏感性有一定的联系,抑制DHFR基因表达能增加顺铂药物敏感性,因此,抑制卵巢癌细胞DHFR基因的表达可以考虑作为顺铂多药耐药的逆转机制。
李艳博[2]2009年在《pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES双基因—放射治疗的体外抑瘤效应实验研究》文中认为放射治疗是目前临床治疗肿瘤的重要手段之一,但是由于肿瘤周边组织的放射损伤及某些肿瘤的辐射抗性问题,使放疗的疗效和应用受到限制。恶性肿瘤基因-放射治疗是近年来肿瘤治疗领域新的研究热点之一,是根据放射治疗和基因治疗的各自特点,将二者联合应用,即将辐射诱导性基因的调控序列与肿瘤杀伤基因相偶联,转染肿瘤细胞,在对肿瘤实施局部放疗的同时诱导肿瘤杀伤基因表达的增强,产生辐射和基因表达产物的协同抑瘤作用。该疗法一方面将放疗与基因治疗有机地结合,发挥协同作用;另一方面,由于辐射具有靶向性和可控性,实现了对杀伤基因表达的时空调控。利用Egr-1启动子具有辐射诱导特性,即电离辐射诱导下可启动其下游基因的表达,本实验构建了含Egr-1启动子和TRAIL、endostatin双基因的重组质粒pshuttle-Egr1- shTRAIL-shES,研究在电离辐射诱导下,该重组质粒携带的双基因TRAIL和endostatin mRNA及蛋白表达的时效和量效规律,以及观察其联合X射线照射后,分别对人乳腺癌细胞MCF-7和人血管内皮细胞ECV304增殖、周期和凋亡的影响。结果表明,重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIl-shES中TRAIL和endostatin mRNA和蛋白的表达具有辐射诱导双基因共表达特性,且在联合X射线照射后,对MCF-7和ECV304细胞均具有明显的增殖抑制和促凋亡作用,并可改变细胞周期进程。本研究为提高基因-放射治疗效果开辟了新途径,为双基因-放射治疗的临床应用提供理论和实验依据。
王璟[3]2017年在《c-Met及抑制剂在卵巢上皮性癌凋亡的实验研究》文中提出来源于卵巢组织的恶性肿瘤是全球七大癌症之一,新发病例中约有80%以上病例为III期-IV期,较早出现远处转移。近二十年,卵巢癌发病率虽有所下降,死亡率却是仍居高不下。卵巢癌发病隐匿、早期诊断较难,早期即多处扩散转移、术后易出现复发及耐药,致使卵巢癌患者死亡率为女性三大生殖器肿瘤之首。随着卵巢癌肿瘤细胞减灭术广泛应用、紫杉醇等一线化疗药物的应用及分子生物学手段日新月异,I期患者生存率有了显著提高,五年生存率能达到90%左右。III/IV期患者通常经过约两年时间治疗,多数病例出现复发或耐药,因此五年存活率仅有25-30%。卵巢癌的发生、早期即远处转移、耐药等是异常复杂的过程,多数病例就诊时无特异性症状,高雌激素刺激、精神心理、遗传等相关因素导致疾病发展。多步骤、多因素、多种关键分子或信号通路所致,通过影响卵巢癌细胞周期调控、增殖、迁移和侵袭,促进卵巢癌的发生发展。原癌基因c-Met(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor)位于细胞膜,高亲和力配体为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)。c-Met在肿瘤组织中表现为过表达或异常活化,在甲状腺癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、结直肠癌组织学及细胞系中均已证实。c-Met位于人7号染色体(7q),具有酪氨酸激酶活性,参与多种细胞功能活动。c-Met基因突变或c-Met蛋白过度表达激活下游多条信号通路PI3K/Akt、MAPK、STAT、Notch,影响细胞的增殖、运动、凋亡,调控细胞周期。研究发现,肿瘤细胞中c-Met蛋白过表达,肿瘤细胞会表现出更强的迁移、侵袭以及抗凋亡能力。研究证实减少c-Met蛋白过表达或者阻止c-Met自磷酸化及下游通路可有效调控肿瘤细胞的增殖、迁移,并增强细胞凋亡能力。针对c-Met蛋白这一肿瘤重要靶标,现已研发出特异性小分子抑制剂作为抗癌药物。c-Met小分子抑制剂分为三型,Ib型抑制剂具有高选择性,精确的结合c-Met非磷酸化构象结合位点,作为这类抑制剂的代表药物Capmatinib(INCB28060,苯扎米特),目前应用于晚期肝癌、结肠癌、非小细胞肺癌、直肠癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤进行I/II期临床研究阶段。国内外尚无文献报道c-met抑制剂incb28060对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,也无联合紫杉醇对卵巢癌细胞增殖和凋亡的研究,incb28060是否能有效抑制c-met及其下游pi3k/akt/mtor信号通路,同时incb28060联合紫杉醇对c-met下游信号通路pi3k/akt/mtor是否有作用,是否影响卵巢癌生物学行为。本研究以卵巢癌组织、正常卵巢组织、体外培养的卵巢癌skov3、ovcar-3细胞系、卵巢癌裸鼠荷瘤模型为研究对象,通过免疫组化、实时定量rt-pcr、western-blot等方法检测c-met在卵巢癌组织、正常卵巢组织的表达情况;通过incb28060抑制c-met蛋白的表达,运用实时定量rt-pcr、流式细胞术、western-blot、mtt、tunel等技术,研究c-met蛋白在skov3、ovcar-3细胞中的表达、对下游pi3k/akt/mtor信号通路的影响、对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响;构建裸鼠荷瘤模型,了解incb28060抑制c-met蛋白表达后荷瘤裸鼠模型肿瘤体积变化,c-met及下游通路pi3k/akt/mtor变化;以阐明c-met在卵巢癌细胞增殖、凋亡过程中的重要影响,可能为卵巢癌基因治疗探寻潜在靶向药物提供理论依据。第一部分c-met在卵巢癌中的临床病理表达目的:探讨c-met在卵巢癌、正常卵巢组织中的表达情况及其与卵巢癌临床病理特征的关系。方法:选取2012.1-2012.12在河北医科大学第四医院经手术病理证实为上皮性卵巢癌标本104例作为研究对象,及同期行子宫加双附件切除术,病理证实为正常卵巢组织26例为对照组。采用免疫组化、rt-pcr及western-blot方法比较c-met在卵巢癌组织及正常卵巢组织中的表达情况。选取研究组病例患者年龄25-74岁之间,中位年龄55岁。figo分期:i-ii期32例,iii-iv期72例。组织学分级:g1级19例,g2-g3级85例。淋巴结转移55例,无淋巴结转移病例49例。选取同期26例行子宫加双附件切除术且病理证实卵巢无病变者为对照组。所有标本分两组,一组10%福尔马林固定,一组投入液氮后再冷冻至-80℃待用。结果:1c-met在上皮性卵巢癌细胞的细胞浆及部分胞膜表达,104例卵巢癌组织阳性率表达为74.04%;c-met在正常卵巢组织细胞中表达较少,阳性表达率为11.54%,两组比较有统计学差异(p<0.05)。2c-met在卵巢癌组织学分级g1级阳性表达率为52.63%、g2/g3级中阳性表达率为85.88%,比较两组数据有统计学差异(p<0.05);c-met蛋白在卵巢癌i/ii期组织中阳性表达率为53.12%,iii/iv期组织中阳性表达率为88.87%,比较两组数据有统计学差异(p<0.05);c-met在卵巢癌有淋巴结转移组表达率为92.72%,无淋巴结转移组表达率为67.35%,比较两组数据有统计学差异(p<0.05)。3rt-pcr结果显示c-met在卵巢癌组织相对表达量(3.0786±0.09)高于正常卵巢组织中的相对表达量(1.0009±0.001),比较两组数据有统计学差异(p<0.05)。4western-blot结果显示c-met蛋白在卵巢癌组织的相对表达量为(0.979±0.009),明显高于正常卵巢组织中的(0.263±0.003),两组比较有统计学差异(p<0.05)。结论:c-met在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织,提示c-met可能参与卵巢癌的发生;c-met蛋白在卵巢癌组织中的表达与临床分期、组织学级别、淋巴结转移相关,提示c-met参与卵巢癌的发生、发展、远处转移。第二部分incb28060对卵巢癌细胞体外凋亡作用研究目的:探讨incb28060作用卵巢癌细胞系c-met、pi3k/akt、细胞增殖、细胞凋亡的影响。方法:利用rt-pcr、wertern-blot、mtt、tunel、流式细胞术检测卵巢癌skov3、ovcar-3细胞c-met的表达情况;向细胞系中加入不同浓度incb28060,采用mtt法检测抑制剂对卵巢癌细胞存活率的影响,流式细胞术、jc-1探针检测细胞膜线粒体去极化和细胞周期变化;向细胞株中加入相同浓度incb28060但作用时间不同,采用mtt法检测其对细胞存活率的影响;向细胞株加入不同浓度紫杉醇,采用mtt法检测incb28060+紫杉醇对细胞存活率的影响;向细胞株加入同一浓度紫杉醇但作用时间不同,采用mtt检测其对细胞存活率的影响;向细胞株加入incb28060,采用wertern-blot法检测对c-met及下游通路pi3k/akt的影响,检测p-c-met、p-pi3k、p-akt1、mtor、mdm2和p53的表达;应用incb28060联合紫杉醇作用细胞,wertern-blot检测细胞dna损伤修复标志物γh2ax的表达;用incb28060联合紫杉醇处理细胞,应用tunel检测细胞凋亡情况;结果:1incb28060处理卵巢癌skov3、ovcar3细胞,与对照组相比用不同浓度(0umol/l、2umol/l、4umol/l、6umol/l和8umol/l)的incb28060作用处理细胞,skov3、ovcar3细胞存活率随incb28060浓度的增加而下降,提示incb28060对细胞存活率的影响为剂量依赖性,以6umol/l浓度最佳,skov3细胞存活率(50.12±2.369%)与对照组细胞存活率(97.23±3.71%)相比,有统计学差异(p<0.05);ovcar-3细胞存活率(65.72±1.996%)与对照组细胞存活率(97.62±2.98%)相比,有统计学差异(p<0.05)。2incb28060处理skov3、ovcar3细胞,mtt检测6umol/lincb28060不同培养时间(0h、12h、24h、36h和48h)细胞存活率,结果显示,skov3、ovcar3细胞存活率随作用时间延长而下降,提示incb28060对卵巢癌细胞的影响是呈时间依赖性的,以24h为最佳,skov3细胞存活率(51.92±1.996%)与对照组细胞存活率(98.19±3.69%)相比,有统计学意义(p<0.05);ovcar3细胞存活率(63.27±3.061%)与对照组细胞存活率(96.91±3.84%)相比较有统计学差异(p<0.05)。3单独应用6umol/lincb28060以及联合紫杉醇与skov3、ovcar-3细胞共同培养,mtt检测不同浓度紫杉醇(0nm、10nm、20nm、30nm、40nm)对细胞存活率的影响,结果显示,紫杉醇浓度以20nm最佳,skov3、ovcar3细胞存活率依剂量增加而降低,呈剂量依赖性;skov3细胞存活率为(49.91±2.167%)与对照组细胞存活率(98.23±3.994%)相比较,有统计学差异(p<0.05);ovcar-3细胞存活率为(59.72±1.991%)与对照组细胞存活率(97.83±3.269%)相比较有统计学差异(p<0.05);单独应用6umol/lincb28060以及联合20nm紫杉醇处理skov3、ovcar-3细胞,mtt检测不同作用时间(0h、12h、24h、36h、48h)对细胞存活率的影响,结果显示,作用时间以24h最佳,skov3、ovcar-3细胞存活率依时间延长而降低,呈时间依赖性;skov3细胞存活率为49.91±2.167%与对照组细胞存活率96.23±3.99%相比较有统计学差异(p<0.05);ovcar-3细胞存活率为53.17±2.02%与对照组细胞存活率96.19±4.10%相比较有统计学差异(p<0.05);4不同浓度incb28060与skov3、ovcar-3细胞共培养,检测c-met、p-c-met、p-pi3k、p-akt的表达。结果显示,应用抑制剂incb28060的卵巢癌skov3、ovcar3细胞p-c-met、p-pi3k、p-akt蛋白表达量随着incb28060浓度增加表达下降,呈剂量依赖性,有统计学差异(p<0.05)。5流式细胞仪检测不同浓度incb28060与skov3、ovcar-3细胞共培养,细胞线粒体去极化膜电位比例以及去极化与极化比值。结果显示:随着浓度增加两株细胞线粒体去极化比例增加,以6umol/l最佳,skov3细胞线粒体膜电位去极化比例为(65.77±3.26%),与对照组相比较(8.41±0.26%),有统计学差异(p<0.05);ovcar-3细胞线粒体膜电位去极化比例为(56.81±2.51%),与对照组相比较(7.34±0.30%),有统计学差异(p<0.05);流式细胞仪检测细胞去极化与极化比例,结果显示:随着incb28060浓度增加,比例随之增加,skov3细胞线粒体去极化与极化比值为(0.83±0.041%),与对照组相比较(0.17±0.006%),有统计学差异(p<0.05);ovcar-3细胞线粒体去极化与极化比值为(0.77±0.039%),与对照组相比较(0.18±0.006%),有统计学差异(p<0.05);6incb28060对skov3、ovcar-3细胞dna损伤能力的影响应用westernblot检测γh2ax,观察6umol/lincb28060及联合20nm紫杉醇对skov3、ovcar3细胞γh2ax的影响,结果显示,incb28060及联合紫杉醇对skov3、ovcar3细胞共培养细胞dna损伤程度增强,与对照组相比,有统计学差异(p<0.05)。7流式细胞学检测incb28060及联合紫杉醇对skov3、ovcar-3细胞周期影响incb28060联合紫杉醇作用于skov3、ovcar-3细胞。共同作用随时间递增,incb28060联合紫杉醇作用skov3细胞g2/m期细胞比例(23.44±1.026%),明显低于单用incb28060组细胞g2/m期细胞比例(29.99±1.391%),有统计学差异(p<0.05);incb28060联合紫杉醇作用ovcar-3细胞处于g2/m期细胞比例(21.17±1.167%),明显低于对照组(31.73±1.4%),有统计学差异(p<0.05);incb28060联合紫杉醇作用skov3细胞sub-g1期比例(47.26±1.98%),与单用incb28060(21.78±1.01%)或紫杉醇组(18.71±0.92%)比较,有统计学差异(p<0.05);incb28060联合紫杉醇作用ovcar-3细胞sub-g1期比例(43.94±2.0016%),与单用incb28060(18.73±0.95%)或紫杉醇组(21.16±1.06%)比较,有统计学差异(p<0.05);结论:1应用incb28060抑制卵巢癌skov3、ovcar-3细胞存活率,存在剂量依赖性及时间依赖性。2应用incb28060抑制卵巢癌skov3、ovcar-3细胞c-met蛋白表达。3应用incb28060作用卵巢癌skov3、ovcar-3细胞抑制c-met下游通路pi3k/akt。4应用incb28060作用卵巢癌skov3、ovcar-3细胞,抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。5应用incb28060作用卵巢癌skov3、ovcar-3细胞,可能增加肿瘤细胞对化疗药物紫杉醇敏感性。第三部分incb28060联合紫杉醇作用于卵巢癌裸鼠荷瘤模型的实验观察目的:构建卵巢癌裸鼠荷瘤模型,并观察incb28060联合紫杉醇对卵巢癌裸鼠荷瘤模型的作用。方法:1培养卵巢癌skov3、ovcar-3细胞株;2构建裸鼠荷瘤模型;3incb28060及紫杉醇干预裸鼠荷瘤生长;4westernblot法检测肿瘤细胞c-met及下游通路pi3k/akt表达情况。结果:1成功构建卵巢癌裸鼠荷瘤模型。2应用incb28060及紫杉醇干预卵巢癌裸鼠荷瘤模型,结果提示,incb28060+紫杉醇联合用药组的肿瘤体积最小(540.19±26.11mm3),与对照组(930.22±29.10mm3)比较有统计学差异(p<0.01)。incb28060+紫杉醇联合用药组的肿瘤质量最轻(900.094±56.099mg),与对照组(1630.194±68.031mg)比较有统计学差异(p<0.01)。incb28060+紫杉醇联合用药组的裸鼠荷瘤模型体重(2150.987±0.096mg),与对照组(2070.238±0.079mg)比较无统计学差异(p>0.05)。3 Western blot法对肿瘤组织的c-Met、p-c-Met、PI3K、p-PI3K、AKt1、p-AKt1、mTOR、p-mTOR、mdm2、p53蛋白表达情况。结论:1成功构建卵巢癌裸鼠荷瘤模型。2应用INCB28060及紫杉醇干预裸鼠荷瘤模型,能有效缩小成瘤体积、减轻肿瘤质量。3 INCB28060抑制c-Met及下游通路PI3K/AKt,抑制细胞增生,促进肿瘤细胞凋亡。结论1上皮性卵巢癌组织c-Met基因表达上调,c-Met蛋白呈高表达。2 INCB28060可通过抑制c-Met的表达调控下游通路PI3K/AKT,p-c-Met、p-PI3k、p-AKT的表达量均下降,可通过调控c-Met及下游通路mTOR、Mdm2、p53、γH2AX自磷酸化的表达,干扰卵巢癌细胞株的增殖、存活、促进凋亡、调控细胞周期,可能提高对紫杉醇化疗药物的敏感性。3应用INCB28060能够降低荷瘤裸鼠肿瘤体积,促进细胞凋亡,同时可能增加对紫杉醇化疗药物的敏感性。4 INCB28060可能是卵巢癌未来潜在的靶点药物,有望为卵巢癌的辅助治疗带来新的前景。
范国昌[4]2000年在《耐药肿瘤基因治疗的实验研究》文中提出目的 探讨重组腺病毒介导入野生型p53.GM-CSF和B7—1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响。为临床使用该重组腺病毒治疗多药耐药的肿瘤提供实验基础。方法 选用p53异常的KB—S(VCR敏感)和KB—v200(VCR耐药)细胞作为肿瘤化疗药物敏感和耐药的模式细胞,感染携带入野生型p53,GM-CSF和B7—1基因的重组腺病毒后,观察这两种转基因癌细胞的生物学行为(包括药物敏感性及其遗传机制)的变化,结果 药物敏感和耐药细胞都对腺病毒易感,重组腺病毒携带的三个外源基因(p53、GM—CSF、B7—1基因)在两种细胞中都能得到有效表达,并且能抑制它们的生长及诱导其凋亡。耐药细胞KB-v200在转染该重组腺病毒48h后,其细胞膜上Pgp糖蛋白的泵出药物的功能却受到显著影响,表现为罗丹明123在其细胞内的积累增加。MTT的实验结果也显示出其对VCR药物敏感性的增加,但是RT-PCR检测结果却表明.mdr1基因和mrp基因的转录水平均有所上升。裸鼠体内实验证实了感染上述重组腺病毒的KB-v200细胞的致瘤性降低.同时能增加对化疗药物VCR的敏感性。结论 临床使用该重组腺病毒并结合化疗药物,对治疗多药耐药的肿瘤会更有效。
叶霈智[5]2006年在《浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究》文中研究说明成人AL初治患者约有30%左右难治,CR后仍有60%左右最终复发难治,甚至造血干细胞移植后复发。难治性急性白血病对治疗反应差,诱导缓解率低,复发率高,生存期短,是白血病治疗中的难题,目前仍以联合化疗为主要治疗方法。多药耐药性(MDR)的形成是难治的主要原因。研究MDR现象产生的机制及克服方法是提高白血病疗效的主要途径之一。已被证实具有逆转肿瘤/白血病细胞多药耐药性的化合物、生物制剂和中药很多,但现有逆转剂大多数停留在体外研究阶段,且存在不良反应大、临床疗效不满意等缺点,临床应用受到限制。我科既往MDR相关研究表明,浙贝母生物碱体外具有逆转白血病细胞MDR的生物活性,并能增加急性白血病细胞内抗癌药物浓度。临床预实验显示,常规化疗加用浙贝母粉,治疗组完全缓解率显著高于对照组,对难治及复发白血病患者优势更为明显,且能提高Pgp高表达患者临床疗效。在上述研究基础上,我们在国内首次进行以中药为主,干预围化疗期难治性急性白血病前瞻性随机、双盲、多中心临床研究。严格遵守随机双盲临床研究原则,统一制定临床研究方案和病例观察表,拟定规范的难治性白血病诊断标准;由计算机产生随机排列表划分治疗组和对照组,两组比例为1:1。在使用标准化疗方案的同时,于化疗开始前3天加用颗粒剂,治疗组为浙贝母颗粒,每次1袋(10g),每日3次;对照组为麦芽颗粒,每次1袋(10g),每日3次。除此以外,不加用任何具有逆转白血病多药耐药性的中西药。所有病例均连续服药14天,以标准化疗疗程为一个治疗周期。若一个疗程无效,可随下一周期化疗继续服用颗粒剂,继续观察一个疗程,并记作另一人次。研究者使用统一制定的《浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究》CRF表,参加临床研究者需经过一定的培训,充分了解临床研究方案,严格记录化疗前后各项指标(骨髓及外周原始细胞、外周血象、MDR相关蛋白、安全性指标)和不良事件,判定临床疗效。最终对研究结果分两次揭盲,并进行统计分析。本次研究病例来源于在全国12家医院,为2004年1月～2006年4月间住院患者,共127例(治疗组66例,对照组61例)。研究结果表明:①两组患者性别、年龄、病型、病程等基线资料均衡可比。②疗效结果显示,两组完全缓解(CR)病例分别为26例、占39.4%(治疗组)与15例、占24.6%(对照组);部分缓解(PR)病例分别为24例,占36.4%(治疗组)与17例,占27.9%(对照组);未缓解病例(NR)病例分别为16例,占24.2%(治疗组)与29例,占47.5%(对照组)。两组病例疗效整体比较,经秩和检验,有统计学意义(P<0.05),治疗组优于对照组;两组病例有效性(CR+PR)比较,经χ2检验,具有显著统计学意义(P<0.01),治疗组有效率显著高于对照组(75.8%>52.5%)。③疾病分型与疗效关系分析结果,两组间ALL患者有效性(CR+PR)比较,经χ2检验,具有统计学意义(P<0.05),治疗组高于对照组(92%>60%)。④性别与疗效关系分析结果,治疗组男性患者疗效与对照组相比,经秩和检验,有统计学意义(P<0.05),治疗组疗效优于对照组。⑤病程与疗效关系分析结果,治疗组病程<6个
汪泱[6]2014年在《RGD修饰的IL-24和PTEN双基因腺病毒载体对非小细胞肺癌PC-9/GR细胞吉非替尼获得性耐药逆转及耐药机制的研究》文中认为目的：研究腺病毒介导的IL-24和PTEN双基因共表达载体对人肺腺癌PC-9/GR细胞吉非替尼耐药性的逆转及耐药机制的探索。方法：构建Ad.RGD-IL-24、Ad.RGD-PTEN、Ad.RGD-IL-24-PTEN单双基因重组腺病毒，将上述病毒转染QBI-293A细胞，经多轮感染扩增、纯化后测定效价，-80℃保存备用。分组处理细胞后用MTT法检测各组PC-9/GR细胞生长情况及对吉非替尼的IC50的变化；流式细胞仪检测细胞生长周期分布；Westernblot检测治疗后PC-9/GR细胞相关蛋白表达量的变化；检测PC-9、PC-9/GR细胞株中P-gp、LRP、IGF-1R的表达，以探索PC-9/GR细胞株吉非替尼耐药的机制；培养PC-9/GR细胞株，建立PC-9/GR肺腺癌裸鼠移植瘤模型，随机分组治疗后摘取瘤体，计算体积、重量，免疫组化法检测各凋亡相关蛋白及肿瘤血管生成相关因子的表达。结果：1.成功构建了含RGD的载有IL-24和PTEN的单双基因重组腺病毒载体；2. PC-9/GR细胞在经过单、双基因感染，再予以吉非替尼治疗后，对细胞的生长抑制率较单纯吉非替尼治疗有显著升高，其中，以双基因联合吉非替尼对细胞的生长抑制率最高；3.经过含有PTEN、IL-24单双基因重组腺病毒感染PC-9/GR细胞后出现半数致死所需吉非替尼的浓度明显下降，Ad.RGD-IL-24-PTEN双基因组表达对吉非替尼耐药的逆转尤为明显；4.经双基因组联合吉非替尼处理PC-9/GR细胞后，细胞在G2/M期出现明显阻滞，可达（55.13±3.79）%，十分接近吉非替尼敏感的PC-9细胞。5. Western-Bolt显示，IL-24，PTEN单、双基因均能上调促凋亡相关蛋白表达，以双基因联合吉非替尼组调节作用最为显著。6. IGF-1R在PC-9/GR细胞中表达较PC-9细胞高。7.裸鼠模型的抗肿瘤实验证实：双基因联合吉非替尼组抑瘤效果明显优于单基因组及单基因联合吉非替尼组，并且，其上调促凋亡因子、下调抑制凋亡相关蛋白及肿瘤血管生成因子的作用也显著强于其它各组。结论：1、RGD修饰的腺病毒介导的IL-24-PTEN双基因共表达载体可以高效地介导外源双基因的表达。2、腺病毒介导的IL-24-PTEN双基因共表达载体对耐吉非替尼的人肺腺癌PC-9/GR细胞具有明显的耐药逆转作用及其裸鼠移植瘤生长抑制作用，其分子机制可能与IGF-1R有关。3、腺病毒介导的IL-24-PTEN双基因共表达载体对耐吉非替尼的人肺腺癌PC-9/GR细胞及裸鼠移植瘤的生长抑制优于其中任一单个基因的作用。
黄暨生[7]2016年在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中认为恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段(如手术治疗、放疗、化疗等)后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能(GJIC)的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯(GJIC)功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP(tk+)细胞混合A375(tk-)细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显著的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高(P<0.05),说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显著提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能(即缝隙连接机制)发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
张雷[8]2017年在《沉默Galectin-1对逆转耐顺铂人肺腺癌A549细胞系的作用及其临床相关性研究》文中提出研究背景由于癌症发病率和死亡率的持续增高,目前仍然是世界上重要的公共卫生问题。从2010年开始,癌症在中国已成为主要的致死原因。根据中国癌症中心2016年报道,在分析了国内2009-2011年72个始终可用的登记中心数据后,对2015年新发病例及死亡数进行估计,预计有4292000个新发癌症病例和2814000个癌症死亡病例,其中肺癌的发病率和死亡率最高,总发病率为733300人,其中男性为509300人,占恶性肿瘤第一位,女性为224000人,仅次于乳腺癌发病率;总死亡率为610200人,其中男性为432400人,女性为177800人,死亡率均为第一位。近年来,肺癌发病率最高的病理类型已由肺鳞癌向肺腺癌转变,肺腺癌成为肺癌中发病率最高的类型,约占非小细胞肺癌的一半,而非小细胞肺癌约占全部肺癌的85%。肺腺癌易复发及远处转移,预后相对鳞癌差。目前,肺腺癌的治疗方案是以外科手术为主的综合治疗,化疗为其中的综合治疗方法之一。肺癌的化疗以联合用药为主,铂类为联合用药的基础药物之一。顺铂(cisplatin,DDP)是最常用于肺癌化疗的一线铂类药物,在肺癌的综合治疗中具有重要作用。虽然肺腺癌对化疗比较敏感,但由于各种原因导致部分患者产生耐药,从而降低了化疗效果,致使病情进展,出现复发或远处转移。DDP为铂的金属络合物,其靶点为DNA,作用在链间与链内交链,形成DDP-DNA复合物,从而干扰DNA的复制,属周期非特异性细胞毒药物。目前铂类药物主要耐药机制包括:增强了药物的失活、减少了细胞内药物积累、增强DNA修复能力、间接调控因子变化等,涉及多种基因和信号转导通路。然而肺腺癌的耐顺铂机制复杂,目前尚未完全阐明。因此进一步研究顺铂的肺腺癌耐药机制,改善化疗的敏感性,提高化疗效果,对延长耐药患者的生存时间具有重要意义。半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)是β半乳糖凝集素家族成员之一,在多种组织中分布,与较多生理过程有关。Gal-1由位于22q12染色体的LGALS1基因编码,其中对Gal-1表达的调节机制中包括启动子的甲基化状态。Gal-1过表达与细胞转化、粘附、增殖、血管生成以及侵袭等方面有关,对肿瘤的进展和预后具有较大影响。Gal-1的高表达与多种恶性肿瘤有关,例如鼻咽癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌等。有研究显示,Gal-1的表达与宫颈癌的分期、浸润和淋巴结转移呈正相关。目前国内外在肿瘤耐药方面筛选基因或蛋白时发现Gal-1可能与部分肿瘤耐顺铂有关。由此说明,Gal-1参与多种恶性肿瘤的发生发展,深入研究Gal-1在恶性肿瘤中的作用对于临床上诊治恶性肿瘤具有重要意义。目前国内外尚未见对耐顺铂肺腺癌中Gal-1进行体内外研究的报道,本课题重点研究探索Gal-1在肺腺癌耐顺铂中的潜在机制。RNA干扰(RNAinterference,RNAi),由Fire等在1998年首次发现并给予命名,作为在2002年度美国科学界最重要的科技成果之一。在随后的几年中,在RNAi方面的研究发展迅速,取得了很多重要研究成果:2001年在哺乳动物的细胞培养中,应用RNAi技术进行抑制基因的表达被首次报道,创新性的应用该技术在高等生物基因功能中进行研究;2002年RNAi技术用于哺乳动物的实验研究;2004年RNAi技术用酶法构建全基因组短干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)文库新技术,并对动物基因功能进行了高通量RNAi研究等。肿瘤多药耐药的发生是多基因、多因素参与的过程,而RNAi成为了研究肿瘤多药耐药的新策略。本课题设计采用RNA干扰技术特异性沉默Gal-1,观察Gal-1被干扰后对顺铂的敏感性实验,研究Gal-1对耐顺铂A549(A549/DDP)细胞生物学特性的影响。用A549细胞系、A549/DDP细胞系及沉默Gal-1的细胞系接种裸鼠成瘤,进行顺铂的敏感性实验;通过体内、外实验验证Gal-1对A549/DDP细胞系耐药的影响。同时选择临床中肺腺癌手术患者,对其组织进行Gal-1的检测,并收集临床相关数据,进行统计学分析。通过体内、外实验及临床相关性研究,进一步了解Gal-1在肺腺癌顺铂耐药中的机制,为针对逆转肺腺癌顺铂耐药进行研发药物提供实验依据。第一部分Galectin-1在人肺腺癌A549及A549/DDP细胞中表达情况目的通过检测Gal-1在人肺腺癌A549及A549/DDP细胞中的表达情况,探讨Gal-1对人肺腺癌A549/DDP细胞系耐顺铂的影响。方法1.人肺腺癌A549及A549/DDP细胞常规进行复苏、培养、传代及冻存;2.将两组细胞接种于96孔板培养,按梯度加入顺铂,共分为10个浓度梯度,分别为(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4,12.8,25.6)μg/ml,每个梯度设为5个复孔,应用CCK8法测定两组细胞OD值,然后通过半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)及耐药指数验证 A549/DDP细胞的耐药性;3.应用RT-PCR和Western blot两种方法分别检测两组细胞中Gal-1在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果1.A549 细胞的 IC50 值为:2.16±0.30μg/ml;A549/DDP 细胞的 IC50 值为:17.66±1.21μg/ml,耐药指数为 8.18(P<0.05)。2.与A549细胞相比较,Gal-1 mRNA的表达水平在A549/DDP细胞中显著升高(0.76±0.03vs.0.39±0.01;P<0.05)。3.与A549细胞相比较,Gal-1蛋白表达水平在A549/DDP细胞中显著升高(0.85 ±0.03 vs.0.61 ±0.02;P<0.05)。结论1.人肺腺癌A549/DDP细胞耐药性稳定,耐药指数为8.18。2.Gal-1可能是A549/DDP细胞系耐顺铂的一个潜在基因,可作为候选耐药蛋白进一步研究。第二部分 沉默Galectin-1对A549/DDP细胞逆转作用的体内外实验研究目的通过沉默Gal-1在人肺腺癌A549/DDP细胞中的表达,在体内外实验中逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性,探讨Gal-1影响A549/DDP细胞耐顺铂的作用,为进一步研究其耐药机制和药物研发提供实验依据。方法1.应用慢病毒稳定转染法沉默人肺腺癌A549细胞及A549/DDP细胞中的Gal-1,将细胞进行培养传代。2.应用RT-PCR和Western blot两种方法分别检测A549、A549/DDP细胞和对照组 A549/C、A549/DDP/C 细胞及沉默 Gal-1 的 A549(A549/I)、A549/DDP(A549/DDP/I)细胞中Gal-1 mRNA和蛋白的表达。3.应用CCK8法测定OD值,计算各组细胞的IC50,计算A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 细胞的耐药指数。4.通过在裸鼠腋下注射 A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I细胞建立裸鼠肿瘤模型,在成功构建成瘤模型的裸鼠中,每组随机选取5只裸鼠进行实验。腹腔内注射顺铂,观察肿瘤在模型体内的生长,4周后处死裸鼠,测量肿瘤重量及直径。5.应用免疫组织化学和Western blot两种方法分别检测A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 组裸鼠肿瘤中 Gal-1 的表达。结果1.Gal-1 mRNA 在 A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I细胞中表达量分别为:0.38±0.01、0.39±0.03、0.22±0.02、0.76±0.02、0.75±0.05、0.23±0.03。在A549/DDP细胞中的Gal-1 mRNA表达高于在A549中的表达(P<0.05);A549/I、A549/DDP/I细胞组间Gal-1 mRNA的表达比较无统计学意义(P>0.05),均低于在A549中的表达(P<0.05)。2.Gal-1 蛋白在 A549、A549/C、A549/1、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I细胞中表达量分别为:0.61±0.02、0.59±0.03、0.28±0.02、0.85±0.03、0.84±0.01、0.31±0.04。在A549/DDP细胞中的Gal-1蛋白表达高于在A549中的表达(P<0.05);A549/I、A549/DDP/I细胞组间Gal-1蛋白的表达比较无统计学意义(P>0.05),均低于在A549中的表达(P<0.05)。3.A549 细胞的 IC50 值为 2.16±0.30μg/ml;A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 细胞的 IC50 值分别为 2.17±0.31、1.88±0.27、17.66±1.21、17.48±1.02、2.97±0.18μg/ml;A549/C、A549/1、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 细胞的耐药指数为 1.00、0.87、8.18、8.09、1.38;A549/DDP、A549/DDP/C细胞组IC50值及耐药指数大于A549细胞组(P<0.05);A549、A549/C、A549/I、A549/DDP/I 细胞组间 IC50 值及耐药指数比较无统计学意义(P>0.05)。4.裸鼠成瘤实验过程中无死亡。A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 组肿瘤体积分别为:761.19±52.13、763.16±51.04、725.84±67.46、1554.61±123.35、1523.58±98.66、804.98±61.63mm3;A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 组肿瘤重量分别为:0.35±0.02、0.35±0.02、0.34±0.02、0.70±0.02、0.71±0.03、0.37±0.03g;A549/DDP 组瘤重及体积大于 A549、A549/I、A549/DDP/I 组(P<0.05);A549 与 A549/I、A549/DDP/I组比较瘤重及体积无统计学意义(P>0.05)。5.在裸鼠肿瘤中,免疫组化与Western blot法检测结果表明,Gal-1在A549/I、A549/DDP/I 组的表达明显低于 A549/DDP 组(P<0.05);而在 A549、A549/DDP组中分别与A549/C和A549/DDP/C组相比较无统计学意义(P>0.05)。结论1.慢病毒稳定转染法沉默Gal-1能够在人肺腺癌A549细胞及A549/DDP细胞中稳定传代。2.人肺腺癌A549细胞及A549/DDP细胞均能够成功构建裸鼠成瘤模型。3.沉默Gal-1能够提高A549/DDP细胞在体内外实验中对顺铂的敏感性。4.体内外实验进一步验证了 Gal-1在A549/DDP细胞耐顺铂中产生影响,为进一步研究其耐药机制和药物研发提供实验依据。第三部分Galectin-1、ERCC1在肺腺癌组织中的表达及临床意义目的研究人肺腺癌组织中Gal-1、切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementary gene 1,ERCC1)在肺腺癌组织中的表达及临床意义。方法1.收集2011年11月到2012年12月蚌埠医学院第一附属医院胸外科经术后病理证实的肺腺癌手术患者91例。所有患者均为术后应用含顺铂为基础的辅助化疗方案。采用免疫组化法测定术后石蜡包埋的肺腺癌组织中Gal-1、ERCC1的表达情况。2.分析Gal-1与ERCC1的相关性;Gal-1、ERCC1与患者的年龄、性别、吸烟及临床分期的相关性;3.通过对患者的随访,将两种指标对预后的影响进行分析,探讨与预后的关系。结果1.Gal-1在肺腺癌中的阳性表达率为30.77%(28/91);ERCC1在肺腺癌中的阳性表达率为31.87%(29/91)。Gal-1、ERCC1在肺腺癌中同时阳性表达18例,同时阴性表达52例。McNemar配对资料χ2检验的结果,P=1.00(P>0.05),提示Gal-1、ERCC1在肺腺癌中的表达无显著性差异。而根据临床诊断一致性 Kappa 检验,Kappa=0.46,P=0.00(P<0.05),说明 Gal-1、ERCC1 在肺腺癌中的表达具有一致性。2.肺腺癌组织中Gal-1的表达与患者的性别、年龄、是否吸烟、TNM分期等临床指标无相关性(P>0.05)。3.肺腺癌组织中ERCC1的表达与患者的性别、年龄、是否吸烟、TNM分期等临床指标无相关性(P>0.05)。4.Gal-1 阳性表达组中位无瘤生存期(disease-free survival,DFS)为(19±1.96)个月,而阴性表达组为(27±1.62)个月,差异具有统计学意义(χ2=22.48,P=0.00)。Gal-1 阳性表达组中位总生存时间(overall survival,OS)为(22±1.02)个月,而阴性表达组为(33±1.56)个月,差异具有统计学意义(χ2=36.81,P=0.00)。5.ERCC1阳性表达组中位DFS为(21±1.30)个月,而阴性表达组为(27±1.53)个月,差异具有统计学意义(χ2=7.03,P=0.01)。ERCC1阳性表达组中位OS为(25±1.04)个月,而阴性表达组为(33±1.72)个月,差异具有统计学意义(χ2=11.64,P=0.00)。6.Gal-1、ERCC1同时阳性表达组中位DFS为(18±2.83)个月,而阴性表达组为(29±1.40)个月,差异具有统计学意义(χ2=12.13,P=0.00)。Gal-1、ERCC1同时阳性表达组中位OS为(22±1.00)个月,而阴性表达组为(35±1.77)个月,差异具有统计学意义(χ2=21.30,P=0.00)。结论1.Gal-1与ERCC1在肺腺癌中的表达具有一致性。2.Gal-1、ERCC1与肺腺癌患者的性别、年龄、吸烟、TNM分期等临床指标无相关性。3.Gal-1、ERCC1与肺腺癌的术后辅助化疗的预后有关,可作为判断预后的指标,同时检测具有更好的准确性。
佚名[9]2010年在《肿瘤免疫》文中提出免疫系统对肿瘤化疗的系列反应现象刘辉吴晓鑫大连医科大学临床免疫学教研室,大连116044肿瘤的发生发展及其转归与特定的机体免疫状态及免疫应答能力密切相关,而且肿瘤的免疫疗法亦是当前治疗恶性肿瘤最有希望的方法之一。但目前治疗肿瘤化疗方法仍占主要地位,由于各种化疗药物多是细胞毒性物质,因而大多数人推测化疗药物对机体免疫系统一定有不同程度的抑制作用,而对肿瘤患者化疗时机体免疫功能状态的检测并没有系统的实验评估,对化疗病人各阶段的免疫状况亦缺乏较全面的认识。
王晚萍[10]2007年在《重组人p53腺病毒对胃癌细胞生长及化疗敏感性的实验研究》文中认为胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，疾病早期手术是主要的治疗措施，化疗在进展期胃癌综合治疗中处于不可缺少的重要地位。目前国内外常用的化疗方案有效率在50％～70％，仍有一部分胃癌患者治疗失败。近年来研究表明肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降是影响治疗失败的主要原因。p53抑癌基因是目前与化疗敏感关联最高的基因，60％的胃癌存在p53的点突变。p53基因的突变与缺失不仅可诱导细胞基因不稳定及恶性分化，而且与肿瘤细胞对化疗的敏感性亦有密切关系。化疗药物产生细胞损伤导致肿瘤细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。正常功能的野生型p53对化疗药物引起的细胞周期阻滞和凋亡起促进作用，而p53基因的变异将失去这种功能，这是产生肿瘤细胞化疗抵抗性的重要原因之一。因此导入野生型p53基因修复细胞内突变的异常p53基因可增加化疗敏感性。重组人p53腺病毒制品(recombinant adenovirus-p53 rAd-p53)是利用腺病毒为载体，将P53基因导入癌细胞中，诱导癌细胞的凋亡，促进癌细胞的溶解死亡。国内外基础及临床应用研究表明：rAd-p53不仅增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性，而且与化疗药物无交叉毒性并明显减少放化疗的副作用，起到增效减毒的临床疗效。目前rAd-p53的临床应用主要集中在头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌等，涉及到胃癌的治疗研究很少。顺铂、紫杉醇是临床胃癌化疗方案中常用药物，药物的耐药性是限制其临床应用的一个主要原因。本研究的目的是研究重组人p53腺病毒感染不同p53状态胃癌细胞，观察外源p53基因在胃癌细胞内的表达，对肿瘤细胞周期阻滞与凋亡的影响，以及对胃癌细胞化疗敏感性的作用和机制。为开辟新的胃癌治疗途径，更好的使用rAd-p53治疗胃癌，提高胃癌的临床疗效尤其是rAd-p53与化疗药物的科学联合应用提供可靠的实验基础。材料与方法：1．细胞选用三种携带不同p53状态人胃癌细胞系BGC-823：即含野生型p53基因的细胞(略写为W)、含突变型p53基因的细胞(略写为M)．含空载质粒即p53基因缺失的细胞(略写为neo)。2．实验药物选用rAd-p53(recombinant adenovirus-p53 rAd-p53)、顺铂(cis-dismine dichoroplatinum，DDP)，紫杉醇(paclitaxel，TAX)。3．MTT比色法测定不同浓度的单药及联合用药作用细胞的生长抑制率，并绘制生长曲线。4．流式细胞仪检测细胞的周期分布和凋亡率。5．免疫细胞化学与Western blotting法检测感染rAd-p53细胞中p53蛋白表达。6．统计学处理：采用SPSS10.0统计软件，统计学数据用均数±标准差((?)±S)表示，计量资料满足正态性，方差齐时多组均数间比较行单因素方差分析(one-way ANOVA)，均数间的两两比较采用LSD方法；每组处理前后的比较用配对t检验；P≤0.05具显著性。结果：1．免疫细胞化学法检测显示：5×10~7VP／ml rAd-p53感染三种胃癌细胞48h后，p53蛋白阳性表达于瘤细胞的细胞核内。neo对照组细胞未见p53表达，而W和M对照组细胞则呈弱阳性表达。rAd-p53作用W细胞48h后，实验组p53的蛋白表达的阳性率(50.20±4.84)％显著高于对照组(14.15±3.44)％(P＜0.001)；rAd-p53作用M细胞48h后，实验组p53的蛋白表达的阳性率(63.74±4.21)％显著高于对照组(30.80±5.32)％(P＜0.001)：rAd-p53作用neo细胞前未见p53表达，rAd-p53作用neo细胞48h后，实验组p53的蛋白表达的阳性率(48.87±5.88)％。2．Western Blotting结果显示：5×10~7VP／ml rAd-p53感染三种胃癌细胞48h后在53KD位置上均有一条清晰的杂交带，对照组neo细胞在同一位置无杂交带，而对照组W细胞和M细胞则在53KD处有很浅的一条杂交带。3．不同浓度的rAd-p53、DDP、TAX单药作用48h后，三种胃癌细胞生长均受到不同程度的抑制，所有实验组与对照组间及不同浓度实验组之间OD值比较(P＜0.01)。结果显示，三种药物均可有效抑制三种胃癌细胞BGC-823的生长。其抑制效应呈剂量依赖性。rAd-p53对BGC-823细胞的生长抑制与细胞内在的p53状态无关。DDP、TAX同浓度组作用三种不同p53状态的BGC-823细胞比较，作用于W细胞的生长抑制率高于M与neo细胞(P＜0.01)，M与neo细胞比较P＞0.05。M与neo较W细胞IC_(50)(median inhibitingconcentration，半数抑制浓度)值增高。4．不同浓度的rAd-p53、DDP、TAX联合用药作用于三种胃癌细胞，所有实验组与对照组间及各实验组之间OD值比较(P＜0.01)。rAd-p53+DDP与rAd-p53+IAX对M细胞的生长抑制率高于W与neo细胞(P＜0.01)，W与neo细胞比较P＞0.05。实验结果表明，rAd-p53与DDP、TAX联合用药，均可有效抑制三种胃癌细胞的生长，呈剂量依赖性。rAd-p53感染三种胃癌细胞48h后联合DDP、TAX用药较DDP、TAX单药对细胞生长抑制率增高(P＜0.01)，DDP、TAX的IC_(50)值下降。5．根据MTT结果绘制rAd-p53与DDP、TAX单用和联合对三种胃癌细胞BGC-823的生长曲线：不同浓度的rAd-p53与DDP、TAX单用和联合作用三种不同p53状态的胃癌细胞24、48、72h的体外生长抑制曲线表明对胃癌细胞的抑制作用均呈时间依赖性和剂量依赖性效应。6．流式细胞仪检测rAd-p53与DDP、TAX单用和联合应用对三种胃癌细胞BGC-823细胞周期变化与凋亡效应：6．1对于W细胞，与空白对照组比：单纯rAd-p53作用出现G_2／M期明显阻滞，凋亡率为9.33％±1.27％；单纯加DDP出现以G_1期为主的阻滞，凋亡率为30.8％±1.53％；单纯加ZAX出现G_2／M期明显阻滞，凋亡率为33.5％±2.05％；rAd-p53+DDP发生G_2／M期阻滞，凋亡率为47.7％±1.66％；rAd-p53+ZAX发生更明显G_2／M期阻滞，凋亡率为52.8％±2.35％；以凋亡作为化疗增效效应，rAd-p53+DDP的增效比为1.55，rAd-p53+TAX的增效比为1.58。6．2．对于M细胞，单纯rAd-p53作用出现G2／M期明显阻滞，凋亡率为11.76％±2.33％；单纯加DDP出现以G_1期为主的阻滞，凋亡率为24.7％±2.42％；单纯加ZAX出现G2／M期明显阻滞，凋亡率为29.89％±1.9％；rAd-p53+DDP发生G_2／M期阻滞，凋亡率为51.88％±2.03％；rAd-p53+ZAX发生更明显G_2／M期阻滞，凋亡率为60.2％±2.33％；以凋亡作为化疗增效效应，rAd-p53+DDP的增效比为2.1，rAd-p53+TAX的增效比为2.01。6．3．对于neo细胞，单纯rAd-p53作用出现G2／M期明显阻滞，凋亡率为10.97％±1.5％；单纯加DDP出现以G_1期为主的阻滞，凋亡率为23.2％±1.58％；单纯加TAX出现G_2／M期明显阻滞，凋亡率为26.8％±1.47％；rAd-p53+DDP发生G_2／M期阻滞，凋亡率为44.3％±2.26％；rAd-p53+TAX发生更明显G_2／M期阻滞，凋亡率为50.53％±2.28％；以凋亡作为化疗增效效应，rAd-p53+DDP的增效比为1.91，rAd-p53+TAX的增效比为1.89。7．rAd-p53单药感染三种细胞24、48h分别进行caspase-3蛋白表达定量分析，以公式荧光指数(FI)表示蛋白的相对含量。FI＞1.0为阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。结果显示：对照组W、M细胞呈弱阳性表达，neo细胞呈阴性表达。rAd-p53感染三种细胞24、48hcaspase-3蛋白表达有时间依赖性。三细胞实验组与对照组及实验组之间比较P＜0.01。同时间组caspase-3蛋白表达比较P＞0.05。结论：1．rAd-p53可抑制三种不同p53状态胃癌细胞的生长及诱导细胞凋亡，该作用不受内源性p53状态的影响。rAd-p53对细胞的生长抑制作用呈剂量时间依赖性效应，并使细胞周期阻滞于G2／M期。2．rAd-p53感染三种胃癌细胞48h后实验组三细胞均有p53蛋白强阳性表达，而对照组W、M细胞有弱阳性表达，neo细胞p53蛋白表达阴性；rAd-p53可上调凋亡相关蛋白caspase-3的表达。3．rAd-p53联合TAX、DDP可抑制三种胃癌细胞的生长，抑制作用较单药时增加。联合作用时化疗药物IC50值较单药下降，诱导细胞凋亡率增高，细胞的周期分布与单药作用不同。4．携带突变与缺失p53基因的M、neo细胞对ZAX、DDP敏感性下降，rAd-p53感染纠正了胃癌细胞内变异的p53基因，增加胃癌细胞对ZAX，DDP的敏感性。
参考文献：
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