袁娟[1]2011年在《马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制》文中研究指明马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi Subsp.zooepidemicus, SEZ)是引发猪链球菌病的主要病原之一,主要引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎、及突发性死亡。其引起的动物疫病呈世界性分布,是目前危害我国猪群最严重的细菌性传染病之一。马链球菌兽疫亚种的类M蛋白(M-like protein, SzP)是一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗抗体的吞噬细胞对其的吞噬作用。本实验对具有免疫原性的类M蛋白进行原核表达,以期制造出可以对马链球菌兽疫亚种引致的猪链球菌病进行有效预防的疫苗。根据已经发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi Subsp.zooepidemicus)猪源菌株的类M蛋白序列设计合成一对引物,以CY株基因组为模板,通过PCR技术,扩增类M蛋白基因并定向克隆于pMD-18T载体中,鉴定阳性质粒插入片段的正确性,将目的基因片段定向克隆至pGEX-4T-1表达载体的BamH I和Xho I位点之间。重组质粒经限制性酶切鉴定和测序,以验证其阅读框架的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,可获得分子量约为64kD的融合蛋白。通过和类M蛋白的多克隆抗体免疫印迹分析表明,表达的融合蛋白同时具有类M蛋白的抗原性。以不同含量的融合蛋白加入马链球菌兽疫亚种全菌灭活疫苗分别免疫仔猪5头,同时以马链球菌兽疫亚种全菌灭活疫苗免疫对照组仔猪,免疫后21d用2倍MLD的CY菌(105CFU)进行攻毒,结果显示所制混合疫苗的免疫保护率优于全菌灭活苗；且联合疫苗的最小免疫剂量可为重组蛋白(0.125mg)+CY(8×108CFU)。
李芳[2]2008年在《马链球菌兽疫亚种多重PCR检测方法建立及应用》文中进行了进一步梳理马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus)是引发猪链球菌病的主要病原,主要引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎、及突发性死亡。其引起的动物疫病呈世界性分布,是目前危害我国猪群最严重的细菌性传染病之一。在危害集约化养猪业发展的同时,该菌对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。纤连蛋白结合蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FNZ)是链球茵一种重要的表面蛋白和毒力因子,是链球菌建立感染所依附的重要的表面分子之一,该蛋白是重要的黏附素之一。其主要的功能是与存在于细胞外基质及细胞表面的纤连蛋白(fibronectin,Fn)发生特异性结合。马链球菌兽疫亚种的类M蛋白(M-like protein,SzP)是一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗抗体的吞噬细胞对其的吞噬作用。根据已经发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus)猪源菌株的纤连蛋白结合蛋白序列设计合成一对引物,以ATCC35246株基因组为模板,通过PCR技术扩增纤连蛋白结合蛋白和类M蛋白基因并定向克隆于PMD-19 T载体中,鉴定阳性质粒插入片段的正确性,利用DNAstar软件,比较所测序列与不同来源的链球菌的纤连蛋白结合蛋白序列的同源性,扩增的fnz、szp基因片段的长度为540bp和700bp,该序列与已经发表的马链球菌兽疫亚种相应基因的同源性为99%。以上序列的测定为建立检测马链球菌兽疫亚种多重PCR的方法奠定了基础。根据马链球菌兽疫亚种类M蛋白、纤连蛋白结合蛋白、超氧化物歧化酶A基因已经发表的序列设计和合成引物,建立马链球菌兽疫亚种多重PCR检测方法,并对建立的方法进行优化。结果显示:建立的多重PCR方法具有较好特异性和敏感性,对14株马链球菌兽疫亚种和6株其它相关菌株进行多重PCR检测,只有马链球菌兽疫亚种能够同时扩增出类M蛋白、fnz、SodA基因;其最低可检测模板量为37 ng/ml。根据建立的马链球菌兽疫亚种叁重PCR检测方法,对江苏地区奶牛场、屠宰场和某猪场进行了马链球菌兽疫亚种流行病学调查。结合培养特性及形态、染色情况等对其进行检测。在屠宰场分离到1株马链球菌兽疫亚种,在猪场分离到2株马链球菌兽疫亚种。显示该方法在马链球菌的快速诊断和分子流行病学的调查中有实用价值。
唐福余[3]2008年在《马链球菌兽疫亚种类M基因缺失株的构建及生物特性分析》文中研究说明马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ)对集约化养猪业的发展危害严重,同时对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。类M蛋白是该菌一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗的吞噬细胞对其的吞噬作用。本试验构建了类M蛋白基因(szp)的缺失株,在分子水平上对马链球菌兽疫亚种类M蛋白的粘附机制进行了研究,同时,通过动物模型评价了该突变株的毒力和免疫原性。因此本研究所构建的ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变弱毒菌株,为该菌的致病机制及引起的猪链球菌病的防控进行了有益的探索。1链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因缺失株的构建根据已发表的马链球菌兽疫亚种猪源ATCC35246株的类M蛋白基因序列,设计和合成一对基因步移引物,并以ATCC35246株的基因组DNA为模板,通过基因步移技术,扩增出类M蛋白左右两翼基因。为了敲除类M蛋白基因,以ATCC35246为始发菌株,构建基因重组质粒PUC-18,利用同源重组的原理构建了ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变菌株(缺失了类M蛋白基因共1090bp)并对该菌株的致病力、小鼠模型的免疫保护作用进行了研究。结果表明,ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变菌株对实验小鼠的致病性明显减弱;突变株能对小鼠提供良好的免疫保护,半定量RT-PCR显示,免疫鼠IL-2、IFN-γ基因的转录水平显著升高。所以经免疫的小鼠可以获得良好的被动免疫保护作用。为了进一步确定szp基因的具体作用,进行了马链球菌兽疫亚种szp基因缺失株的基因互补实验。实验证实基因互补株与野生株的生物特性基本一致。因此本研究所构建的ATCC35246的szp基因缺失突变弱毒菌株可作为预防ATCC35246感染的疫苗候选株,为最终研究制出马链球菌兽疫亚种链球菌的基因工程菌苗奠定基础。2类M蛋白及其基因缺失株对HEp-2细胞的粘附作用采用通用的模式细胞HEp-2细胞,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白的粘附作用。结果显示,用重组的ATCC35246株类M蛋白预处理HEp-2细胞,当类M蛋白的量达到3.2μg/200μL,可显示为阳性;用重组表达的类M蛋白单抗处理类M蛋白,可抑制其对HEp-2细胞的粘附,在1.8μg/500μL能完全抑制它对HEp-2细胞的粘附,说明其单抗对应的抗原表位在细胞粘附中具有决定性作用。同时发现,亲本株及szp基因缺失株均对HEp-2细胞有黏附和侵袭力,但szp基因缺失株黏附能力降低50%以上。电镜观察结果显示,黏附部位是细胞膜和细胞微绒毛,并观察链球菌内化现象。以上结果提示,上皮细胞是SEZ的定植细胞;菌株黏附后直接侵入细胞内是其穿过上皮细胞屏障的机制之一。
周瑾[4]2012年在《马链球菌兽疫亚种间接ELISA诊断方法的建立与应用》文中进行了进一步梳理根据GenBank上已经公布的马链球菌兽疫亚种重要保护性抗原类M蛋白(M-like protein)的编码基因Szp的基因序列,设计出一对引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株的全基因组DNA为模板,通过多聚酶链式反应扩增出目的基因并定向克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,通过PCR鉴定和重组质粒双酶切鉴定之后,确认重组质粒构建成功。再将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,对阳性菌落进行增菌培养,并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖(IPTG)诱导其在低温下进行表达。经SDS-PAGE鉴定,表明类M蛋白获得了良好的表达,且以可溶性蛋白形式存在于上清中,蛋白分子量与推导值一致。Western-blot免疫印迹反应显示,所得目的蛋白可被猪源ATCC35246株康复血清识别,表明其具有良好的免疫原性。随后用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化蛋白后,通过Bradford蛋白定量法绘制了测定蛋白浓度的标准曲线,并运用统计学知识,建立了回归方程,对获得的类M蛋白进行定量分析,测定了较为精确的类M蛋白的浓度。在此基础上,用类M蛋白作为包被抗原,采用方阵滴定法,确定了抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度,并通过一系列的优化试验,确定了最佳反应试剂和操作规程,并组建了间接ELISA反应试剂盒,随后通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验和保存期试验等对该试剂盒的敏感性、特异性和长期应用与保存条件进行了检验,并通过对实验室保存的40份标准阴性血清进行了测定,确定了平均值,标准偏差,根据经验公式确定了阴阳性临界值。从而为后续的流行病学调查奠定了基础。本试验对实验室保存的猪血清400份,实验室保存的血清主要来自河南、上海、山东、安徽地区,采集自南京地区部分猪场的80份血清、肉联厂的猪血清100份,用已经建立的ELISA操作规程对其进行了检测；对常用试验动物小鼠、家兔在试验前采集其血清各50份进行检测,以确定南京和扬州地区部分试验动物感染马链球菌兽疫亚种的情况；对南京地区部分养牛场的血清50份进行了检测,以确定大动物感染马链球菌兽疫亚种的情况。结果显示,调查中的各省血清阳性率从16%-33.3%不等,安徽和河南的小型猪场血清阳性率偏高,江苏、山东和上海地区的猪场血清阳性率偏低,初步推测是由于规模化的养殖管理促进了马链球菌兽疫亚种的防治；健康小鼠的血清抗体阳性率为84%,健康家兔的血清抗体阳性率为78%；牛的血清抗体阳性率为0。
何赏[5]2006年在《马链球菌兽疫亚种类M蛋白对细胞的粘附作用》文中认为马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)对集约化养猪业的发展危害严重，同时对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。马链球菌兽疫亚种的类M蛋白是一种重要的表面蛋白和毒力因子，具有调理素功能，且能够抵抗抗体的吞噬细胞对其的吞噬作用。本试验在分子水平上对马链球菌兽疫亚种类M蛋白的粘附机制进行了研究，为该菌的致病机制及引起的猪链球菌病的防控进行了有益的探索。 根据已发表的马链球菌兽疫亚种猪源ATCC35246株的类M蛋白基因序列，设计和合成一对引物，并以ATCC35246株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出去掉信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)中。重组质粒通过酶切鉴定和测序后，将重组质粒转化入大肠杆菌BL21进行原核表达，SDS-PAGE显示表达产物约60kD，Western blot显示，其与ATCC35246株多克隆抗血清反应，抗原性良好。 以His亲和层析拄纯化重组的类M蛋白作为抗原免疫6-8周龄的BALB／c小鼠，叁次免疫后，取脾细胞并与对数期生长良好的SP2／0细胞进行融合，应用灭活的ATCC35246菌液为包被抗原，建立间接ELISA筛选阳性克隆，经过3次亚克隆之后得到12株稳定分泌抗类M蛋白单抗的细胞株，特异性检测显示其与猪链球菌2型等没有交叉反应。以BABL／c小鼠制备的腹水单抗，ELISA效价约为1:10000。 采用通用的模式细胞HEp-2细胞，研究马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白的粘附作用。结果显示，ATCC35246株可以粘附HEp-2细胞，它可以粘附细胞。用重组的类M蛋白预处理HEp-2细胞，当类M蛋白的量达到160μg／500μL，可以完全抑制细胞对细菌的粘附；用重组表达的类M蛋白鼠单抗血清处理ATCC35246，可抑制其对HEp-2细胞的粘附，在1:200倍稀释时即能完全抑制它对HEp-2细胞的粘附；而ATCC35246的全菌鼠抗血清在1:200时能完全抑制它对HEp-2细胞的粘附。同时，以12株单抗处理细菌以后，发现单抗2C8具有明显抑制细胞粘附的作用，说明2C8对应的抗原表位在细胞粘附中具有决定性作用。 以类M蛋白的单抗细胞株2C8分泌的单抗作为靶分子，研究其对应的抗原表位。用从前以试验得到的2C8单抗包被酶标条孔，从12肽随机肽库中经过5轮生物淘洗(结合、淘洗及富集)程序进行筛选，第2轮以后降低2C8的包被浓度，同时升高洗
张言召[6]2011年在《马链球菌兽疫亚种类M蛋白与猪血管内皮细胞互作蛋白筛选》文中提出马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus)对集约化养猪业的发展危害严重,是我国猪链球菌病的主要病原。类M蛋白是该菌的一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗吞噬细胞对其的吞噬作用。本试验通过酵母双杂交系统筛选猪脐静脉血管内皮细胞中与类M蛋白的相互作用的蛋白质,为进一步阐明该菌的致病机制进行了探索。以猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)为研究对象,提取总RNA,经分离获得mRNA,采用SMART技术合成cDNA第一链,并通过LD-PCR合成双链cDNA。用限制性内切酶SfiI酶切后连接到pGADT7 AD载体质粒上,利用电转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH10B中构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明：初始文库库容量为1.01×107CFUs,重组率接近100%,插入片段在1.8-4.4kb之间,平均插入片段为2.7kb,达到了用于目的基因的分离筛选及克隆表达的建库要求。根据已发表的马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的类M蛋白基因序列,设计和合成一对引物,并以ATCC35246株的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出去掉信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至酵母表达载体pGBKT7中,构建诱饵质粒pGBKT7-szp。重组质粒通过酶切鉴定和测序后转化入酵母菌株Y2HGold中进行表达,融合蛋白经自激活、毒性及Western blot检测,结果显示,构建的诱饵蛋白满足酵母双杂交系统的要求。使用酵母双杂交系统,筛选SUVECs全长cDNA文库中与类M蛋白相互作用的蛋白质的编码序列：通过诱饵酵母菌株Y2HGold[pGBKT7-szp]与SUVECs cDNA文库酵母菌株Y187[pGADT7-cDNA]交配形成二倍体酵母,经含X-α-gal及Aureobasidin A的营养缺陷型培养基(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)筛选后获得蓝色克隆,提取质粒,转化入大肠杆菌DH5a扩增并提取文库质粒。获得的文库质粒再回复酵母酵母双杂交系统验证其表达的蛋白与类M蛋白间的相互作用关系。结果显示,未能从构建的SUVECs全长cDNA文库中筛选到与类M蛋白相互作用的蛋白质。
参考文献：
[1]. 马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制[D]. 袁娟. 南京农业大学. 2011
[2]. 马链球菌兽疫亚种多重PCR检测方法建立及应用[D]. 李芳. 南京农业大学. 2008
[3]. 马链球菌兽疫亚种类M基因缺失株的构建及生物特性分析[D]. 唐福余. 南京农业大学. 2008
[4]. 马链球菌兽疫亚种间接ELISA诊断方法的建立与应用[D]. 周瑾. 南京农业大学. 2012
[5]. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白对细胞的粘附作用[D]. 何赏. 南京农业大学. 2006
[6]. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白与猪血管内皮细胞互作蛋白筛选[D]. 张言召. 南京农业大学. 2011
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