蔡颖1 李一鸣2 陈红栓 李澄 袁保锋 翟润亚 夏晗
【摘 要】 目的 探讨COPD大鼠模型中气道弹性及炎症因子的改变。方法 将40 只Wistar 大鼠随机分为5组，每组再分两组（COPD 模型组及正常对照组），采用烟熏加气管内注入脂多糖的方法制造COPD大鼠模型。用HE染色及马松(Masson)三色染色评价大鼠气道壁病理变化和胶原纤维的变化；采用ELISA法检测血清中基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9）、金属蛋白酶抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP1）及热休克蛋白（heat shock proteins27，HSP27）的表达水平。结果 COPD模型组血清MMP9、TIMP1及HSP27的表达水平高于正常对照组的表达水平；COPD模型组MMP9的表达总体呈上升趋势，差异有统计学意义（P＜0.01）；COPD模型组TIMP1的表达总体呈上升趋势，G3与G5组（P＜0.01）及G4与G5组（P＜0.01）差异有统计学意义；COPD模型组MMP9/TIMP1的比值随MMP9和TIMP1改变而变化，差异有统计学意义（P＜0.01）；COPD模型组HSP27的表达呈轻微上升趋势，G4与G5组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 MMP9/TIMP1的平衡及胶原纤维、HSP27的改变可以作为评价COPD进展的重要指标。
【关键词】 慢性阻塞性肺疾病； 胶原； MMP9； TIMP1； HSP27
【Abstract】 Objectives To investigative the variation of airway flexibility and inflammation factors in the analogue of rats with COPD.Methods 40 Wistar rats were devided into five groups randomly，eath group was devided into two groups: COPD model group and normal control group.The rats’ COPD model were made by smoking and lipopolysaccharide injected in the trachea.To appreciation the change of pathology of rats’ airway wall and collagen by HE and Masson.To detect the level of MMP9、TIMP1 and HSP27 by ELISA.Results The level of MMP9、TIMP1 and HSP27 in COPD model groups appeared higher than those of nomal control group.The level of MMP9 in COPD model groups presented a trend of rising on the whole,difference was statistically significant（P＜0.01）;the level of TIMP1 in COPD model groups also showed rising trend as a whole,difference between G3 and G5（P＜0.01）and difference between G4 and G5（P＜0.01) was statistically significant;the ratios of MMP9/TIMP1 changed as the level of MMP9 and TIMP1 change,difference was statistically significant（P＜0.01）.The level of HSP27 in COPD model groups had a slightly rising tend,difference between G4 and G5 was statistically significant(P＜0.05）.Conclusions The balance of MMP9/TIMP1 and the change of collagen and HSP27 cold as a new approach to COPD control.
【Key Words】 Chronic obstructive pulmonary disease； collagen； MMP9； TIMP1； HSP27
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种高患病率、高死亡率的呼吸系统疾病，目前位居全球死因的第4位。在未来几十年内，COPD仍是一项严重的公共卫生问题，预计到2020年COPD将是全球第5位负担最重的疾病及第3位致死性疾病。我国COPD患病人群中每年致残人数达500-1000万，致死人数达100万。本研究旨在成功建立COPD大鼠模型，并研究COPD模型中气道弹性的变化以及血清中MMP9、TIMP1与HSP27的改变，以探讨其在COPD气道弹性改变的机制及在COPD进展中的作用，为COPD的防治提供可靠的依据。
材料与方法
1．材料
Wister大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；实验用烟为黄果树牌香烟（焦油含量12mg）；马松(Masson)三色法染色试剂盒产自上海博谷生物科技有限公司；HSP27、MMP9和TIMP1 ELISA试剂盒产自MILLIPORE公司；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；洗板机来自芬兰（Thermo Labsystems）的AC8型号；微量高速离心机（thermo）型号：TG16W；隔水式恒温培养箱（国产）型号：GNP-9080型；正置荧光显微镜( 日本，OLYMPUS公司)。
2．大鼠COPD模型的制备
选择纯系雄性Wistar大鼠40只，鼠龄8周，体质量200～240 g；采用随机数表法将动物随机分为分为5组（G1-G5），每组2只作为正常对照组（共10只），6只为COPD模型（共30只）。两组在相同环境下采用相同的喂养方式，对照组正常饲养，不做任何干预，作为空白对照。每天上、下午分别将实验组大鼠置于密闭有机玻璃箱内熏香烟各0.5 h，每次10支香烟，共20支，通过箱侧壁孔使箱内气压与大气压相等，中间间隔4 h。G1、G2组于第1天经超声引导下气管内注入脂多糖 200 μg，G3-G5组于第1、14天经超声引导下气管内注入脂多糖 200 μg（给药当天不烟熏）。分别于第7、14、21、28、42天处死实验组G1-G5（标记为GnT1-GnT6）及两只正常对照组（标记为GnC1、GnC2）。
3．血清及肺组织的采集
用10％水合氯醛(40mg/kg体重)腹腔注射麻醉并固定大鼠，迅速剖开胸腔，暴露心脏，于心尖部进针入左心室采血6ml，4℃保存24小时后离心（3250r/min，15min），将分离出的血清-80℃冷冻保存，待测MMP9、TIMP1及HSP27。沿气管找出肺组织，并将其与周围结缔组织分离，用生理盐水冲洗，放置于福尔马林中固定24h，包埋、切片。HE染色行大鼠COPD模型的鉴定。Masson染色测量胶原蛋白厚度。
4．MMP9、TIMP1及HSP27的测定
血清MMP9、TIMP1及HSP27的浓度测定采用ELISA分析法，进行以下操作：
①标准品的稀释与加样：标准品按照ELISA说明书稀释好5个梯度，各个梯度50μl/每孔；
②加样：分别设空白孔和待测样品孔，在酶标包被板上的待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不要触及孔壁，轻轻晃动摇匀）；
③温育：用封板膜封板，放于37℃下温育30min；
④配液洗涤：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔洗涤液加满，静置30秒，弃去液体，重复5次，拍干；
⑤加酶温育：加入酶标试剂50μl/每孔，空白孔除外；用封板膜封板，至于37℃下温育30min；
⑥洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔洗涤液加满，静置30s，弃去液体，重复5次，拍干；
⑦显色：先加入显色剂A50μl/每孔，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡摇匀，37℃避光显色15min；
⑧终止：加终止液50μl/每孔，终止反应；
⑨测定：以空白孔调零，450nm波长下依序测量各孔的吸光度（OD值），测定在加终止液后15min以内进行；
⑩计算：用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出各样品浓度，乘以稀释倍数，即为各样品的实际浓度。
5．胶原蛋白的测定
肺组织切片行Masson染色：将石蜡切片脱蜡至水后用0.5%碘酒处理5分钟，水洗，再用5%硫代硫酸钠处理3分钟，经流水冲洗10分钟后依次用自来水和蒸馏水洗涤。用试剂A染核10分钟，充分水洗显蓝后镜检，至胞核呈蓝色（如过染可盐酸酒精分化），用蒸馏水洗，再将玻片上的水分甩干，将玻片放入65℃烘箱或者37℃培养箱中若干分钟，直至玻片表面没有水分、标本表面干燥发白为止。 将干燥好的玻片水平放置，滴加试剂B（染液覆盖住标本）后水平放置，室温染色15分钟，再用试剂C清洗玻片（3次，3分钟/次）， 甩干玻片后滴加试剂D，分化处理4分钟，用滤纸拭去试剂D（滤纸不能接触到样本）。直接用试剂E染色15秒，用试剂C清洗玻片（染色色调清晰鲜艳即可），最后用 95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。镜下胶原纤维呈丝状蓝色。
6．统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，实验数据采用 的形式表示。COPD模型组血清MMP9、TIMP1及HSP27的表达各组间比较采用方差分析（LSD-t检验），P＜0.05为有统计学差异。
结 果
1．HE染色结果观察
正常对照组的大鼠支气管及肺组织结构正常；COPD 模型组中G1、G2组大鼠肺组织切片见部分支气管纤毛破坏，管壁稍增厚，粘液腺增生，少量中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润，部分肺泡腔扩大，肺泡间隔变薄；G3、G4、G5组大鼠肺组织切片见支气管纤毛倒伏、脱失，细支气管管壁明显增厚，管腔狭窄，粘液腺增生，大量中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润，上皮细胞变性、坏死，肺泡腔明显扩大，肺泡间隔变薄、部分断裂，并可见部分扩大的肺泡融合，形成肺大疱，以上病理改变符合 COPD 的表现。（图1）
图2：图a为正常对照组大鼠肺组织切片，结构正常；图b为COPD模型组大鼠肺组织切片，可见气道周围蓝色胶原纤维明显增多，增厚。
3．血清MMP9、TIMP1及HSP27的各组间比较（图3）
①COPD模型组血清MMP9、TIMP1及HSP27的表达水平高于正常对照组的表达水平（表1）；
讨 论
慢性阻塞性肺疾病以持续存在并逐步进展的气流受限为特征[1]。对遗传易感人群来说，吸入的有害颗粒和气体可以诱发气道炎症反应增强，引起气道和肺实质的结构改变。研究证明，小气道为气流受限的主要部位，COPD气流受限的特征是由小气道和肺泡结构异常引起的。Hogg等研究了一系列COPD GOLD1-4期患者（n=159）的气流受限（用FEV1评估）和经手术切除肺组织的组织学结果之间的关系。研究发现FEV1减低伴随着小气道管壁内组织容积的增长和小气道管腔内粘液渗出物的累积[2]。上皮异常，包括上皮增生、鳞状化生[3]和杯状细胞增生[4]，这些异常似乎通过增加气管壁厚度而导致小气道管腔的狭窄。COPD患者的细支气管周纤维化也是造成小气道狭窄的一个重要原因[5]，并且小导气道管腔内粘液渗出的积累进一步加重了气流受限[4?6]。我们既往的研究通过多层螺旋CT低剂量动态扫描中发现：低剂量CT气道测量可以作为反映气道管壁增厚和管腔狭窄的手段，可以观察到随着COPD病情的进展逐渐出现气道壁的增厚增加，重度患者（3-4级）在呼气期间出现气道的狭窄和闭塞（提示气道弹力下降），而肺的密度未见明显变化[7-10]。因此，气道改变有可能是病变进展和重度患者急性加重的原因。本研究结果显示，COPD 模型组中G1、G2组大鼠肺组织切片见部分支气管纤毛破坏，管壁稍增厚，粘液腺增生，少量中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润；G3、G4、G5组大鼠肺组织切片见支气管纤毛倒伏、脱失，细支气管管壁明显增厚，管腔狭窄，粘液腺增生，大量中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润，上皮细胞变性、坏死。与我们既往的研究结果一致，提示气道炎性改变在COPD进展中起重要作用。
而关于COPD的发病机制则有慢性支气管炎症反应和蛋白酶/抗蛋白酶平衡失调两种机制。前者认为，引起慢性支气管炎的各种因素如感染、吸烟、大气污染、职业性粉尘和有害气体的长期吸入，以及过敏因素等均可引起支气管慢性炎症，使管腔狭窄形成不完全阻塞，使吸气时气体容易进入肺泡，而呼气时由于胸膜腔内压力增加，支气管进一步闭合，导致肺泡中残留气体过多和肺泡过度充气。慢性炎症还可损伤小支气管壁软骨组织，使支气管失去正常的支架作用，和呼气时支气管易于陷闭，阻碍气体排出，导致肺泡内气体积聚过多，肺泡内压力升高和过度膨胀。此外，由于肺泡内压的增高，使肺泡壁的毛细血管受压，肺组织血液供应减少和营养障碍，亦可引起肺泡壁弹性减退。因此，慢性支气管炎症性损伤为引起阻塞性肺气肿的重要原因。后者认为，体内的某些蛋白水解酶对肺组织具有损伤破坏的作用，而抗蛋白酶对于弹力蛋白酶等多种蛋白酶具有抑制的效能。蛋白酶和抗蛋白酶维持平衡是保证肺组织正常结构免受破坏的重要因素。如抗蛋白酶不足或蛋白酶增加均可导致肺组织结构破坏发生肺气肿。
气道狭窄由气道平滑肌细胞、细胞外基质及气道周围其他细胞共同作用形成[11, 12]。细胞外基质主要包括弹性蛋白、胶原纤维及蛋白聚糖，研究证明COPD患者细胞外基质中弹性蛋白减少[13]，但目前对胶原纤维的研究结果还没有完全统一。一些研究证明在COPD中期、缓和期和某些COPD患者中可以见到胶原纤维增多[14]。MMPs是一类蛋白酶，对讲解细胞外基质成分起到了重要作用。MMP9的过度表达，讲解了气道和肺组织的细胞外基质，造成肺气肿形成[15]。TIMP1是MMP9的抑制因子，MMP9与TIMP1的平衡对维持细胞外基质有重要的意义。热休克蛋白-27（HSP27）作为一种分子伴侣，其主要的功能是保护细胞免受应激因素的损伤。有研究证明，COPD患者血清中HSP27的水平升高，并且随着COPD及疾病程度的加重而升高[16, 17]，可以作为COPD的一种诊断指标。本实验着重探讨了MMP9、TIMP1及HSP27在大鼠COPD模型中表达水平的改变及细胞外基质中胶原纤维的改变。结果显示COPD中MMP9、TIMP1及HSP27的表达均高于正常值，MMP9、TIMP1及HSP27的表达对COPD的形成起到了一定的作用。在COPD模型形成初期，这些炎症因子的表达并不是很明显，但对后期COPD的形成影响很大。G4组相对于G3组MMP9/TIMP1比值明显升高，表明气道以炎症反应为主，将导致组织破坏；而G5组相对于G4组MMP9/TIMP1 比值下降，则表明气道开始以修复为主，本研究中Masson染色中看见胶原纤维厚度明显增加，表明肺组织开始纤维化，提示COPD从炎症破坏到纤维化的一个病理过程。HSP27有促进蛋白质降解、抑制炎症因子释放的等作用。实验结果显示，COPD模型组的HSP27表达水平提高，其是否可以减轻COPD患者的肺组织损伤并在COPD进展的什么阶段开始表达有待进一步研究。
综上所述，MMP9/TIMP1的平衡及HSP27的表达可以作为COPD进展的重要指标，胶原纤维的调节为将来在COPD患者肺泡结构广泛地病变之前，从根本上靶向治疗早期或中期COPD提供了一定的方向。
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论文作者:蔡颖1,李一鸣2,陈红栓,李澄,袁保锋,翟润亚,
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期
论文发表时间:2016/7/19
标签：气道论文; 肺泡论文; 蛋白酶论文; 模型论文; 大鼠论文; 支气管论文; 组织论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期论文;